Valutazione della procedura per eseguire la cystometria sveglia in un modello di mouse

Riepilogo

Questo studio descrive le procedure chirurgiche e le tecniche sperimentali per eseguire la cistometria sveglia in un mouse in movimento. Inoltre, fornisce prove sperimentali per sostenere la sua ottimizzazione e standardizzazione.

Abstract

La revoca della cistometria è stata utilizzata da molto tempo per valutare la funzionalità della vescica in topi liberamente spostati, tuttavia i metodi specifici utilizzati variano tra i laboratori. Lo scopo di questo studio era quello di descrivere la procedura microchirurgica impiegata per l'impianto di un tubo intravesico e la tecnica sperimentale per la registrazione della pressione vescicale urinaria in un topo sveglio, in movimento libero. Inoltre, vengono presentati dati sperimentali per mostrare come la chirurgia, così come il tipo e la dimensione del tubo, influenzano la funzione del tratto urinario inferiore e la sensibilità di registrazione. L'effetto del diametro del tubo sulla registrazione a pressione è stato valutato sia in tubo di polietilene e poliuretano con diversi diametri interni. Successivamente, il tubo più performante di entrambi i materiali è stato impiantato chirurgicamente nella cupola della vescica urinaria dei topi maschi C57BL / 6. La frequenza di micturition di 12 ore, durante la notte, è stata registrata in animali sani e intatti e animali 2, 3, 5 e 7 giorni dopo la chirurgia. Al raccolto, vesciche wSono stati valutati per segni di gonfiore utilizzando osservazione lorda e successivamente sono state trattate per l'analisi patologica. Il più grande grado di gonfiore della vescica è stato osservato nel giorno 2 e 3, che è correlato con i dati comportamentali di annullamento che evidenziano una significativa riduzione della funzionalità della vescica. Al giorno 5, l'istologia della vescica e la frequenza di annullamento erano normalizzati. Sulla base della letteratura e delle prove fornite dai nostri studi, proponiamo le seguenti fasi per la registrazione in vivo della pressione intravesica e del volume annullato in un mouse sveglio: 1) eseguire l'intervento chirurgico utilizzando un microscopio operativo e strumenti microchirurgici, 2) utilizzare polietilene-10 Tubazioni per ridurre al minimo gli artefatti di movimento e 3) eseguire cistometria al giorno 5 postoperatorio, quando si risolve il gonfiore della vescica.

Introduzione

La cistometria di riempimento (FC) è un metodo diagnostico che prevede l'inserimento di un catetere nella vescica urinaria per registrare la pressione durante il riempimento lento della vescica. Introdotto per la prima volta nel 1927 come metodo diagnostico clinico per valutare la funzione del tratto urinario inferiore, è rimasto ampiamente utilizzato. ¹ Nelle applicazioni di ricerca, FC può essere utilizzato per testare la funzione vescicale nei modelli animali sani e malati e per studiare gli effetti degli agenti farmacologici. I modelli animali roditori sono comunemente usati per indagare la funzione del tratto urinario inferiore. ² In questo gruppo di mammiferi, FC è stato sviluppato per l'uso in ratti. ³ Qui, la metodologia per implantare un tubo nella vescica urinaria e eseguire FC è stata ben descritta e utilizzata da molti ricercatori con un livello accettabile di riproducibilità. ⁴ La disponibilità di ceppi di origine transgenica e di colata rendono i topi una specie preziosa per numerose aree di ricerca,Compreso il campo della disfunzione del tratto urinario inferiore. La metodologia utilizzata per eseguire la cistometria del mouse varia notevolmente tra i laboratori, rendendo difficile il confronto dei risultati. ⁵

Rispetto ai modelli ex vivo , FC conserva l'anatomia del tratto urinario inferiore, consentendo di valutare la funzione coordinata tra la vescica e la sua uscita durante le fasi di stoccaggio e di annullamento del ciclo di micturition. Precedenti ricerche dimostrano che numerosi, comunemente usati anestetici sopprimono la contrazione della micturition. Agenti che conservano la contrazione muscolare liscia della vescica urinaria (uretano, α-cloralosio, ketamina e xilazina), consentendo all'animale di micturate, riducono ancora significativamente la capacità funzionale della vescica e sopprimono la neurotrasmissione. ^{6 , 7 , 8 , 9} Anche se tecnicamente più impegnativo, FC ha eseguito in awGli animali ambulanti ake conservano l'integrità funzionale del riflesso della micturition.

La funzione del tratto urinario inferiore è influenzata da diversi fattori, tra cui il gonfiore della parete della vescica post-operatoria, lo stress causato dal dolore e dal disagio e dalle influenze ambientali. Utilizzando una tecnica chirurgica che riduce al minimo i danni dei tessuti durante l'impianto di tubi e metodi di registrazione che riducono il movimento del tubo, permettendo allo stesso tempo l'animale ad ambulare liberamente, sono essenziali per ottenere registrazioni accurate e riproducibili.

Se eseguito in modo adeguato, in vivo FC in animali liberamente in movimento può fornire dati che riflettono affidabilmente la funzione fisiologica della vescica. ¹⁰ FC in animali liberamente in movimento possono fornire dati sui seguenti parametri; Pressione basale o basale: pressione minima tra due micturition. Pressione intermittente: pressione media tra due micturition. Pressione soglia: pressione intravesica immPrima della micturition. Pressione massima: pressione massima della vescica durante un ciclo di micturition. Attività spontanea (o pressione media oscillatoria intermedia): pressione dell'intermitturazione minus pressione basale. Contrazioni non vuote: aumento della pressione intravesica durante la fase di riempimento, non associata al rilascio di fluido. Compatibilità della vescica: capacità della vescica divisa per pressione di soglia minus pressione basale. Frequenza di micturition: numero di micturitions per unità di tempo. Intervallo di intermittenza: Periodo tra due pressioni di vuoto massime. Capacità della vescica: volume infuso diviso per il numero di micturition. Una descrizione dettagliata di questi parametri e terminologia standardizzata è stata precedentemente pubblicata. ¹¹

FC può essere eseguito usando un metodo di infusione intravesica a ciclo continuo o singolo ciclo. La cistometria continua permette di registrare più cicli di micturition e di scegliere i dati rappresentativi basatiSulla riproducibilità. La sua precisione nella misurazione della capacità della vescica è limitata a causa del volume residuo sconosciuto. Inoltre, è impegnativo raccogliere piccoli volumi vuoti (che a base di ceppo e sesso variano da 30 a 184 μL) nei topi liberamente ambulanti. Utilizzando questo metodo per registrare il volume vuoto è meno accurato rispetto ad una preparazione anestetizzata, ma è superiore in quanto evita gli effetti soppressivi degli anestetici sulla funzione della vescica. La cistometria a ciclo unico deve essere utilizzata per valutare la capacità della vescica. In questo metodo la vescica viene svuotata mediante aspirazione prima dell'infusione e la capacità viene calcolata in funzione della velocità di infusione moltiplicata per il tempo alla massima pressione.

Sebbene sia stata pubblicata la tecnica di esecuzione della cistometria nei piccoli roditori, ha descritto l'intervento eseguito in un topo e ha raccomandato che la cistometria del mouse dovrebbe essere eseguita sotto anestesia uretanica. ¹⁰ L'obiettivo di questa comunicazione è tO descrivere sia le tecniche microchirurgiche usate per l'impianto di un tubo intravesico nella cupola della vescica urinaria e la configurazione sperimentale utilizzata per registrare la funzione del tratto urinario inferiore, in vivo , durante il riempimento continuo della vescica e la micturition in un topo sveglio liberamente in movimento. Inoltre, sono stati eseguiti esperimenti per affrontare come la lunghezza del tubo, il diametro e il materiale, nonché la metodologia per eseguire in vivo FC, influenzano la registrazione. Questo protocollo sperimentale riassume le tecniche precedentemente pubblicate e propone una serie di modifiche basate sui risultati sperimentali.

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Protocollo

Gli animali sono stati alloggiati presso l'Università di Vermont Animal Care Facility secondo orientamenti istituzionali. Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida Nazionale delle Nazioni Unite per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Implantazione tubo intravesicale

1. Preparazione di tubi e strumenti per la procedura chirurgica
   1. Tagliare un pezzo di PE10 da 7 cm per fare il catetere per l'impianto.
   2. Creare un flare ad una estremità del tubo PE10 lentamente avanzando l'estremità verso una fiamma aperta.
      NOTA: estrarre rapidamente il tubo non appena il flesso si sviluppa.
   3. Applicare tre gocce di colla calda a tutti gli usi, usando la regolazione a basso tenore di calore su una pistola a colla, a 4,5, 5 e 5,5 cm dall'estremità svasata all'esterno del tubo PE10. Questi aiutano a fissare il tubo alla schiena dell'animale. ( Figura 1 )
   4. Sterilizzare il tubo ammollando nel 70%Etanolo e poi sciacquarlo con NaCl di 0.9% sterile prima dell'uso. Lasciare il tubo riempito per evitare di introdurre bolle d'aria nel sistema.
   5. Creare una spina a 30 guarnizioni per sigillare l'estremità del catetere PE10 separando un ago da 30 gauge dal mozzo manipolando manualmente il lato prossimale a lato. Applicare una goccia di colla calda alla fine. Assicurarsi che la guarnizione sia impermeabile. ( Figura 2 )
   6. Utilizzare i seguenti strumenti microchirurgici: due paia di microforceps curve Dumont # 7, due coppie di microforceps curve Dumont # 5, un ago da 21 G, un hemostato diretto ultrafine, micro forbici, forbici di dissezione e un porta micro ago.
   7. Sterilizzare tutti gli strumenti prima di avviare la procedura.
2. Preparazione dell'animale
   1. Dopo aver anestetizzato l'animale, prima raggruppa la metà inferiore dell'addome, poi girate l'animale in preda e raschiate e pulite l'area sul dorso superiore con alcol al 70% seguito da betadina. Applicare unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza. Successivamente, utilizzare una coppia di forbici dritti e sbucciate e un paio di microforceps curve Dumont # 7 per eseguire una incisione cutanea di 1,5 cm tra la scapola e mettere l'animale supino sopra un tappetino riscaldante (37 ° C) ricoperto di drappi sterili.
   2. Infine, pulire l'addome con alcool e betadina.
3. Operazione chirurgica
   NOTA: eseguire tutte le procedure chirurgiche sotto un microscopio operativo con ingrandimento variabile da 3.15X a 20X. Dopo aver posizionato l'animale sui teli sterili, indossare guanti sterili. Continuare a utilizzare procedure sterili durante l'intero intervento chirurgico.
   1. Posizionare l'animale in una scatola di induzione e anestetizzarsi usando 2% di isoflurano inalato con un supporto ossigeno (1 L / min). Mantenere l'anestesia in tutta la procedura, posizionando la testa dell'animale in un cono di naso e utilizzando il 2% di isoflurano inalato con un portatore di ossigeno (1 L / min). Inizia l'intervento chirurgico dopo aver ricevuto un negRisposta dal test di pizzicotto.
   2. Utilizzare una coppia di forbici dritti e sbattute e un paio di microforceps curve Dumont # 7 per fare una incisione addominale inferiore inferiore di 1,5 cm, attraverso la pelle. Successivamente, creare un'incisione corrispondente attraverso la fascia lungo la linea alba e il muscolo per esporre la cupola e la metà superiore della vescica urinaria. Evitare di danneggiare la vescica applicando la trazione verso l'alto a ciascun strato di tessuto usando una coppia di microforceps curve Dumont # 7. Tenere la viscera addominale dall'essiccazione aggiungendo gocce di calda fisiologica salina.
   3. Ruotare l'animale sul suo fianco per accedere all'incisione sulla nuca del collo. Spingere un hemostat stretto sottocutaneo anche se l'incisione. Il canale sottocutaneo dovrebbe iniziare sul retro e continuare lungo il lato.
   4. Una volta che la punta dello strumento raggiunge il fondo della gabbia toracica, ruotare la punta verso la linea mediana e dentro l'addome (ci sarà un leggero pop quando piercing i muscoli della parete addominale). Continuare a far avanzare l'emostato fino a quando la punta viene esposta all'incisione addominale sotto lo strato muscolare. ( Figura 3 )
   5. Afferrare l'estremità "non sporgente" del tubo con l'hemostat e ritirare lentamente l'utensile, tirando l'estremità del tubo attraverso l'incisione sul retro del collo. Regolare l'estremità svasata del tubo in modo che si trovi direttamente sopra la cupola della vescica.
   6. Fare una cravatta allentata di sutura monofilamento 6-0 (non assorbibile) e metterla in cima alla cupola della vescica. Questa cravatta verrà utilizzata in seguito per fissare il tubo nella vescica.
   7. Mettere un piccolo rotolo di tessuto privo di lanugine nell'addome e dietro la vescica per aiutare a stabilizzarlo e ad elevarlo.
   8. Preparatevi di inserire l'estremità svasata del catetere PE10 nella vescica.
      1. Nella mano non dominante, tenere la cupola della vescica con le microforceps curve Dumont # 7 e mantenere questa presa fino a quando il catetere è collocato nella vescica.
      2. Usare un ago da 21 gaugeO fare una cistotomia nell'apice della cupola. Procuratevi delicatamente la cistotomia con una coppia chiusa di microforceps curvilinee # 5 per assicurarvi che il catetere possa facilmente passare attraverso il foro.
      3. Tenendo ancora la cupola della vescica nella mano non dominante, mettere l'estremità svasata del catetere PE10 nella vescica (spingere il flare verso il basso fino al collo della vescica in modo che non scivoli mentre si blocca).
      4. Legare la sutura monofilamento 6-0 intorno alla cupola della vescica e del tubo con il legame posto anteriormente al tubo. Assicurarsi di legare la sutura come alta su la vescica per evitare di ridurre artificialmente la capacità della vescica. ( Figura 4 )
      5. In alternativa, fissare il catetere utilizzando una sutura stringa borsa come segue. Effettuare una sutura della corda della borsa sciolti sulla cupola della vescica usando il monofilamento 6-0. Seguire i punti 1.3.8.1 - 1.3.8.3 per eseguire la cistotomia e inserire il catetere. Fissare il tubo legando la sutura della corda della borsa. ( Figura 5 )
   9. Verificare la chiarezza e la tenuta del tubo nella vescica collegando una siringa da 0,5 ml di insulina con un ago da 30 gauge all'estremità distale del tubo. Riempire lentamente la vescica con 0.1 - 0.2 mL di NaCl 0.9% fino a quando una goccia compare all'orecchio uretrale, quindi svuotare la vescica aspirando. È importante che la vescica sia riempita e svuotata.
   10. Se non si verificano perdite alla cupola, incatenare la vescica con un paio di microforceps curve e tirare delicatamente il tubo finché il flare non si appoggia all'interno della cupola della vescica.
   11. Prima di chiudere, rimuovere il piccolo rotolo di tessuto e assicurarsi che la vescica sia nella sua posizione normale.
   12. Chiudere la parete addominale in due strati (muscolo e pelle) con sutura da 6-0. È preferibile approssimare il muscolo retto addominale suturando solo i bordi della fascia addominale anteriore (parete anteriore della guaina rectus).
   13. Per proteggere il tubo negli animali, con delicatezzaL'animale sul suo addome. Inserire la porzione sottocutanea dell'ancora metallica nell'incisione interscapolare. ( Figura 12 ) Utilizzare una sutura da 6-0 per fissare il tubo e ancorare circondandoli con una sutura a materasso verticale.
   14. Assicurarsi che una bolla di colla rimanga sopra e sotto la pelle per evitare che il tubo si estrae. Tagliare il tubo di circa 2 cm sopra la pelle.
   15. Inserire delicatamente la spina a 30 gauge (punto 1.1.5) nell'estremità del tubo per evitare che l'urina venga fuoriuscita.
4. Iniettare 0,5 ml di NaCl 0,9% per via sottocutanea per l'idratazione. Dare analgesia postoperatoria subito dopo l'intervento chirurgico e mantenere per 48 h.
   1. Riporre l'animale nella sua gabbia posta sotto una lampada a infrarossi. Mantenere un'osservazione costante finché l'animale non si muove liberamente sulla gabbia.
5. Monitorare l'animale quotidianamente e lasciarlo recuperare per 5 giorni prima della registrazione.

2. Svegliatevi della cistiRegistrazione di ometria

1. Preparazione del programma di registrazione, trasduttore di pressione e pompa di infusione.
   1. Prima di anestetizzare l'animale, collegare la pompa di infusione, il trasduttore di pressione e la girante 22 G utilizzando tubi PE50. ( Figura 6 )
   2. Aprire il programma di registrazione (vedere tabella dei materiali per un esempio), su un computer per calibrare la pressione del sistema e prepararsi alla registrazione. Assicurarsi di utilizzare le stesse impostazioni durante la calibrazione e la registrazione.
      1. Riempire una siringa da 20 ml con 10-15 ml di temperatura ambiente 0,9% NaCl e caricare nella pompa di infusione. Programmare la pompa per infondere ad una velocità di 0,6 mL / h.
      2. Fissare il trasduttore di pressione alla stessa altezza della vescica animale o del fondo della gabbia di registrazione.
      3. Fissare il girevole a 22 giri fino alla fine del trasduttore di pressione (PE50 - tubo - trasduttore di pressione a girevole)
         NOTA: Il girevole è usato per impedire che il tubo si torsi o si sbatteL'animale si muove.
      4. Avanzate la pompa della siringa per scorrere lo 0,9% di NaCl attraverso il sistema. Accertarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria prima della calibrazione.
      5. Con il programma di registrazione in esecuzione, utilizzare un righello per calibrare la pressione (cm / H ₂ O). Spostare lentamente l'estremità del telaio PE50 da 0 a 30 cm. Regolare lo zero se necessario.
         NOTA: Il contrassegno di 0 cm dovrebbe essere al medesima altezza del pavimento della gabbia di registrazione e del trasduttore di pressione.
   3. Sospendere il girevole a 22 giri sopra al centro della gabbia di registrazione. Assicurarsi che il fondo della gabbia consente l'urina a cadere sul dispositivo di raccolta del bilanciere posizionato sotto la gabbia. Regolare l'altezza del tirante in modo che il mouse possa muoversi liberamente intorno alla gabbia senza sforzarsi o allungare il tubo. ( Figura 7 )
   4. Al termine, verificare che il sistema e tubi PE50 esterni siano pieni di NaCl 0.9% e tutte le bolle d'aria sono state rimosse.
2. PrepL'animale per la registrazione
   1. Anestetizzare l'animale con 2% di isoflurano inalato e metterlo sul suo addome. Rimuovere la spina da 30 gauge e far scorrere il tubo PE10 (catetere della vescica) nell'estremità del telaio PE50. Utilizzare la colla a caldo per formare una tenuta stagna.
   2. Disattivare l'anestesia e mettere l'animale nella registrazione tramite un pavimento a filo parallelo, che permetterà che l'urina scenda direttamente su un dispositivo di raccolta posto in cima ad un bilanciamento analitico. ( Figura 7 )
   3. Avviare la registrazione una volta che l'animale si trova nella gabbia, ma non inizia a infondere. Monitorare l'animale fino a recuperare completamente dall'anestesia. Una volta che la pressione della vescica si stabilizza, iniziare a infondere 0,9% di NaCl ad una velocità di 0,6 mL / h.
      NOTA: Fare una nota nel programma di registrazione quando vengono apportate modifiche. È importante avere un record di quando l'infusione inizia, si arresta o si verificano irregolarità.
   4. Controllare il sistema per perdite e assicurarsi che l'animale abbia facilitàAl cibo e all'acqua.
   5. Continuare a registrare in una stanza tranquilla fino a ottenere tre cicli di riproduzione riproducibili.
      NOTA: L'animale deve essere completamente disturbato durante la registrazione. Preferibilmente, utilizzare monitoraggio video remoto per osservare il comportamento.

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Risultati

Non c'era alcuna differenza significativa tra i materiali di tubo e i diametri nella consistenza dell'ascesa di pressione e cadere all'interno del sistema durante l'occlusione del tubo. L'impianto di tubo intravesicale post-gonfiore della parete della vescica era significativo per i materiali di polietilene (PE) e poliuretano (PU). Il giorno 2 si è sviluppata una rigonfiata gonfiore sottocutaneo. Ha occupato la metà della sezione trasversale della vescica, portando ...

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Discussione

Materiale ottimale e dimensione del tubo intravesicale

Per determinare il diametro del tubo di effetto sulle registrazioni a pressione, abbiamo provato diversi tubi microfluidici; PE50 (0,58 mm ID), poliuretano PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) e PE10 (0,28 mm ID). Per ogni tubo, la pressione è stata registrata con la pompa di infusione in esecuzione a 1 mL / h, mentre si muove rapidamente il tubo verticalmente da 0 a 30 cm. Gli esperimenti iniziali in vivo hanno tentato di utilizzare tubi ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene (PE) 10 tubing	Instech	BTPE-10	Fits 30G connectors/plugs
Polyethylene (PE) 50 tubing	Instech	BTPE-50	Fits 22G connectors/plugs
22 G single channel stainless steel swivel	Instech	375/22
High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD)	Grainger	1NAH1	Protects PE50 tubing - Cut to length
22 G connector	Instech	SP22/12
Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun	Yutaoz		Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work
Surebonder DT-2010 all purpose glue stick	Surebonder		Any all purpose hot glue will work
Dumont #5 curved microforceps	World Precision Instruments	500232
Dumont #7 curved microforceps	World Precision Instruments	14188
Mini dissecting scissors - straight	World Precision Instruments	503240
Micro mosquito forceps (12.5 cm)	World Precision Instruments	500451
Dissecting scissors - straight	World Precision Instruments	14393
Castroviejo Needle Holder	World Precision Instruments	503258
Isoflurane, USP	Phoenix		2%, 1 L/min flow rate
Buprenorphine			0.05 mg/kg
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP	Baxter
6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture	Ethicon		Bladder tie
6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture	Ethicon		Muscle suture, running
6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture	Ethicon		Skin suture, vertical mattress, buried interrupted
KD Legato 210 infuse/withdraw pump	KD Scientific		1.5 mL/hr
Disposable pressure transducer	Digitimer	NL108T2
Pressure Amplifier	Digitimer	NL108A
Power1401-3 data acquisition interface	Digitimer
Spike2	Cambridge Electronic Design Limited		PC pressure recording software
Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X)	Leica Microsystems		Magnification