Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

Résumé

Systèmes automatisés et protocoles pour l’établissement systématique d’un grand nombre d’écrans et des gouttelettes de cristallisation nanolitres pour expériences de diffusion de vapeur sont décrites et discutées.

Résumé

Lorsque des cristaux de haute qualité sont obtenus qui diffracter des rayons x, la structure cristalline peut être résolue à près de résolution atomique. Les conditions de cristallisation des protéines, ADN, ARN, ainsi que leurs complexes ne peuvent toutefois pas être prédite. Utilisant une large variété de conditions est un moyen d’augmenter le rendement des cristaux par diffraction de qualité. Deux systèmes entièrement automatisés ont été développés à la MRC laboratoire de biologie moléculaire (Cambridge, Angleterre, MRC-LMB) qui facilitent le dépistage cristallisation de 1 920 conditions initiales par diffusion de la vapeur en gouttelettes nanolitre. Semi-automatisé protocoles ont également été développés pour optimiser les conditions en changeant les concentrations des réactifs, le pH, ou en introduisant des additifs potentiellement améliorent les propriétés des cristaux qui en résulte. Tous les protocoles correspondants seront décrites en détail et discute brièvement. Pris ensemble, ils permettent la cristallisation macromoléculaire pratique et très efficace dans une installation multi-utilisateurs, tout en donnant aux utilisateurs un contrôle sur les paramètres clés de leurs expériences.

Introduction

Cristallographie aux rayons x est largement appliquée pour faire progresser notre compréhension des mécanismes biologiques et la maladie au niveau atomique et d’aider par la suite des approches rationnelles de drogue découverte¹. Pour ce faire, purifié et échantillons macromoléculaires (2 à 50 mg/mL) concentré de protéines, ADN, ARN, autres ligands et leurs complexes sont testés pour leur propension à former commandé des grilles tridimensionnelles par cristallisation^{2,3 ,4}. Lorsque des cristaux de haute qualité sont obtenus qui diffracter des rayons x, la structure cristalline peut être résolue à près de résolution atomique^5,6. Fondamentalement, les conditions de cristalliser un nouvel échantillon ne peuvent être prédit et le rendement des cristaux de haute qualité est généralement très faible. Une raison est que plusieurs échantillons d’intérêt ont des propriétés biochimiques difficiles, qui les rendent instables à l’échelle de temps correspondante pour la cristallisation (généralement quelques jours). Enfin, le processus est aggravé par le temps nécessaire pour produire des échantillons et des variantes de l’échantillon et d’optimiser leur purification et cristallisation^7,8.

Une condition de cristallisation est une solution avec un précipitant qui réduit la solubilité de l’échantillon, et conditions contiennent souvent aussi des tampons et additifs. Des centaines de ces réactifs sont bien adaptés pour modifier les paramètres de l’expériences de cristallisation, comme ils l’ont faible propension à interférer avec l’intégrité des échantillons (tels que des protéines ou des acides nucléiques qui se déroulent). Alors qu’il n’est pas possible de tester des millions de combinaisons de réactifs de cristallisation,^,10 - plusieurs à plusieurs kits de dépistage - formulés avec diverses stratégies⁹essais est possible avec essais miniaturisés et protocoles automatisés. Dans cette perspective, la technique plus favorable est probablement diffusion de la vapeur avec des gouttelettes de nL 100-200 assis sur un petit puits au-dessus d’un réservoir contenant l’état de cristallisation (25-250 µL), mis en œuvre dans la cristallisation spécialisées plaques^{11 , 12}. l’échantillon de protéine et l’État sont souvent combinés dans un rapport 1:1 pour un volume total de 200 nL lorsque vous configurez les gouttelettes dans les puits supérieur. La cristallisation de protéines nanolitres robotique peut être implémentée avec des techniques alternatives et plaques telles que le pétrole sous lot¹³ et la Phase cubique lipidiques¹⁴ (la dernière étant appliquée spécifiquement à des protéines membranaires qui sont très peu solubles dans l’eau).

L’installation de cristallisation à la MRC-LMB a débuté dans les années 2000 et un résumé au début de nos protocoles automatisés a été présenté en 2005¹⁵. Une introduction historique à la cristallisation de protéines a été présentée et aussi un aperçu des avantages de robotique nanolitres approche (puis une nouvelle approche à l’expérimentation systématique). Depuis macromoléculaire cristallisation est essentiellement un processus stochastique avec peu ou pas utile information préalable, qui emploient une grande variété de conditions initiales (adaptées), augmenter le rendement de qualité diffraction cristaux¹⁶. En outre, un avantage souvent négligée d’un grand écran initial est de réduire considérablement le besoin d’optimisation des échantillons et des cristaux dans de nombreux cas. Bien sûr, on peut toujours avoir besoin de procéder à l’optimisation de certaines conditions initiales plus tard. En général, la concentration des réactifs et le pH sont ensuite systématiquement étudié. Plus réactifs peuvent également être introduits dans l’ou les conditions optimisée de plus modifier paramètres de cristallisation. Certes, on devrait essayer de cristallisation auprès d’un échantillon fraîchement préparé, c’est pourquoi les protocoles correspondants doivent être simples et disponibles n’importe quel moment.

Ici, deux entièrement automatisée des systèmes conçus à la MRC-LMB (circuits 1 et 2) et les protocoles correspondants sont décrits en détail. L’application principale de ces deux systèmes est initiale de dépistage par la diffusion de la vapeur en séance les plaques de cristallisation de goutte. Système 1 intègre un gestionnaire de liquid, un carrousel automatisé aux plaques de stock, une imprimante jet d’encre pour l’étiquetage de la plaque et un film adhésif adhésive. Sur le système 1, 72 plaques à 96 puits sont remplis avec les kits de dépistage disponibles dans le commerce (80 µL de condition transférée au réservoir d’un volume de 10 mL dans des éprouvettes de départ), étiquetés et scellées. Les plaques sont ensuite stockés dans un incubateur à 10 ° C où ils sont accessibles aux utilisateurs à tout moment (comme initiales écrans appelés « Plaques LMB »).

Système 2 intègre un gestionnaire de liquid, un distributeur nanolitre et un film adhésif adhésive. Sur le système 2, assis de gouttelettes (100-1 000 nL) pour les expériences de diffusion de vapeur sont produites en combinant les conditions et l’échantillon dans les haut-puits de 20 plaques de 48 ou 96 puits pré-remplis avec conditions. Cela signifie que 1 920 conditions de présélection sont mis à l’essai lors de l’utilisation de 20 plaques LMB sur le système 2.

Robots sont également utilisés individuellement pour l’optimisation de certaines affections, et les protocoles semi-automatisé correspondantes sont également décrites. La méthode 4-coin¹⁷ est employé couramment pour produire des écrans de l’optimisation. Le protocole correspondant nécessite tout d’abord la préparation manuelle de 4 solutions (« A, B, C et D »). Deux gradients linéaires des concentrations (pour les deux agents principaux de la cristallisation) sont ensuite automatiquement générées directement dans les réservoirs d’une plaque de cristallisation. Pour ce faire, un gestionnaire de liquid axée sur la seringue distribue les solutions de 4 angle à différentes proportions.

Afin d’optimiser une condition, on peut employer écrans additifs potentiellement améliorer les propriétés du résultant cristaux¹⁸. Il existe deux approches pour le dépistage de l’additif : un protocole commençant par additifs dispensés dans les réservoirs des plaques de cristallisation avant de configurer les gouttelettes (protocole 1) et un autre protocole où l’écran additif est dispensé directement sur les gouttelettes (protocole 2).

Autres développements utiles qui ont été lancés dans la MRC-LMB pour faciliter la cristallisation macromoléculaire automatisée, sont également présentés. Essentiellement, les plaques de cristallisation et périphériques associés, tels qu’un empilable société de Biomolecular Screening (SBS) couvercle qui minimise évaporation des conditions lorsque vous utilisez le système 2.

Par souci de brièveté, on suppose que les utilisateurs sont familiers avec les fonctions de base et l’entretien de distributeur nanolitre, l’imprimante jet d’encre et le film adhésif adhésive. Sauf indication contraire, les plaques sur le pont des robots sont positionnés tel que le puits A1 (« A1-coin ») est vers l’arrière à gauche d’un support de plaque.

Protocole

1. les deux systèmes (présélection) entièrement automatisés

1. Système 1 : préparation des plaques de 96 puits cristallisation 72 rempli de dépistage kits (plaques LMB)
   1. Avant d’effectuer la procédure, faire en sorte que les robots du système sont initialisées et leur logiciel de contrôle est ouvert. Allumez le refroidisseur du transporteur tube refroidissement environ 30 minutes avant le programme principal sera lancé.
   2. Placez une plaque d’essai sur le support motorisé de SBS de l’adhésif. Exécutez le film adhésif et vérifiez que le film est correctement appliqué. Répéter ce test deux fois plus que le film adhésif est prêt.
   3. Puis, ajoutez 20 L d’eau déionisée au conteneur principal du gestionnaire liquid. Débrancher les inserts de couplage du petit récipient (20 % d’éthanol solution de rinçage) et les inserts au conteneur principal.
   4. Entrez le nom d’écran approprié (tableau 1) sur l’écran tactile l’imprimante jet d’encre. Ensuite, ouvrez et fermez la porte du carrousel pour déclencher la rotation du carrousel. Ouvrir la porte lorsque la première pile se présente.
   5. Charger complètement la première pile avec 22 plaques de cristallisation, chacune avec revêtement de colonne 1 dehors. Charger complètement les deux cheminées de la même manière.
   6. Charger les 6 plaques restants dans les postes les plus élevés de la quatrième pile. Ensuite, fermez la porte du carrousel.
   7. Vérifier que le refroidisseur affiche 14 ° C. Doucement et à plusieurs reprises il faut inverser les kits de dépistage sélectionnée pendant 1 minute. Ensuite, ouvrez le panneau avant du gestionnaire liquid.
   8. Ouvrir les tubes et les placer dans le support de refroidissement selon la norme-cadre 96 puits (A1, A2, etc.). À placer chaque tube dans le porte-bébé, placer le couvercle sur un plateau dans la même disposition de 96 puits.
   9. Recouper le tube positions et faire en sorte que tous les tubes sont de niveau et se sont installés dans le porte-bébé. Ensuite, fermez le panneau avant.
   10. Dans la fenêtre de « Démarrage » du logiciel gestionnaire liquide, sélectionnez « Run maintenance » et ouvrez le programme rinçage. Exécutez le programme afin d’éliminer l’éthanol de 20 % du système et pour laver les surfaces extérieures des conseils de distribution de liquides.
   11. Lorsque le rinçage est terminé, cliquez sur « Annuler » pour revenir au « Démarrage ». Sélectionnez « Exécuter un processus existant » et cliquez sur « Démarrer votre sélection ». Ouvrez le programme « MRC kit distribution ». Renseignez '18' pour « Instances » dans la configuration de l’écran et lancez le programme.
   12. Surveiller le système comme les quatre premières plaques sont étiquetés, remplis et scellés.
   13. Une fois que toutes les 72 plaques ont été élaborés et placés dans le carrousel, placez-vous dans les inserts de couplage du conteneur principal le petit récipient. Exécutez le programme « Start up flush » (voir étape 1.1.10).
   14. Éteindre le refroidisseur et jeter le vide des tubes de trousse de dépistage. Retirez soigneusement les 72 plaques préparées au carrousel. Jeter les plaques remplies de manière incorrecte ou mal scellés. Stocker les plaques prêtes à l’emploi à 10 ° C.
2. Système 2 : mise en place des gouttelettes de cristallisation (protéine de nL 100 + 100 nL condition) d’un seul échantillon dans 20 plaques LMB
   1. Tout d’abord, veiller à ce que les robots du système sont sur le distributeur nanolitre est initialisé avec son logiciel ouvert et gestionnaire de méthode du gestionnaire liquide est ouvert. Allumez le transporteur microtube-refroidissement environ 15 minutes avant le programme principal sera lancé.
   2. Placez une plaque d’essai sur le support motorisé de SBS de l’adhésif. Exécuter le film adhésif et vérifier que la plaque est bien scellée. Tester le film adhésif trois fois.
   3. Ensuite, exécutez le distributeur nanolitres pour définir 100-nL gouttes de solution d’essai dans une coupelle. Vérifier au microscope que les gouttelettes sont correctement définies. Fermez le logiciel de distributeur nanolitre et retirer le bloc de porte-bande depuis le pont.
   4. Ensuite, insérer dans le support de plaque personnalisée (voir Résultats représentant: cristallisation dispositifs mis au point à la LMB) la plaque de la LMB avec la plus grande quantité relative des réactifs instables dans ses conditions (tableau 1). Retirer la pellicule adhésive de la plaque.
   5. Ouvrir le panneau avant du gestionnaire liquide et placer la plaque non scellée sur le pont, à l’arrière du premier transporteur coulissant (glissement de transporteurs peut être retiré pour faciliter l’accès).
   6. Couvrir la plaque avec un couvercle en aluminium SBS. Régler le couvercle vers le coin arrière gauche du transporteur en appliquant une légère pression jusqu'à l’angle opposé du couvercle.
   7. Desceller, charger dans les transporteurs coulissants et recouvrir les 19 plaques restants de la même façon, travaillant de plus à des conditions moins volatiles. Une fois que le transporteur microtube-refroidissement est à 4 ° C, comme indiqué par une lumière verte, enlevez le couvercle.
   8. Coupez le couvercle d’un microtube contenant (au moins) 440 µL de l’échantillon de protéine (tableau 2). S’assurer que l’échantillon a sans mousse au-dessus du ménisque, comme cela n’interférera pas avec le système de détection de liquide. Placer le tube dans la Position 1 du transporteur microtube-refroidissement.
   9. Posez une plaque PCR sur le pont de gestionnaire liquide devant le transporteur adaptateur plaque de terrassement. Ensuite, fermez le panneau avant.
   10. Après avoir chargé le pont, faire en sorte que le pont de distributeur nanolitre est clair du bloc porte-bande et que les transporteurs à l’arrière les piles d’extrémité 50 µL sont claires des couvercles en aluminium SBS.
   11. Dans l’interface de « Gestion de la méthode » gestionnaire liquide, sélectionnez « Setup plaques ». Surveiller l’initialisation des deux systèmes, puis renseignez les paramètres d’exécution. Suivez les indications de l’interface de gestion de la méthode (invites, figures et un système de gestion de pointe aide à la préparation).
   12. Vérifiez que tous les requis de composants sont prêts et puis démarrez le processus.
   13. Surveiller le système comme le distributeur nanolitres définit les gouttes dans la première plaque et le film adhésif joints par la suite la plaque.
   14. Une fois que toutes les plaques de 20 ont été élaborés avec des gouttelettes de cristallisation et automatiquement renvoyées aux transporteurs coulissants, ouvrir le panneau avant et retirer délicatement les plaques. Vérifiez que les plaques soient correctement scellés avant leur stockage de cristallisation.
   15. Nettoyer les couvercles SBS avec une solution d’éthanol à 20 % avant les empilant sur le côté gauche du gestionnaire de stockage liquid. Jeter la plaque PCR et microtube.
   16. Désactiver le support de refroidissement microtube et essuyer la condensation. Laissez une serviette en papier sur le dessus de la surface plus froide d’absorber plus de condensation. Ensuite, replacez le couvercle du transporteur et refermer le panneau avant.

2. optimisation des conditions

1. Axée sur la seringue de liquide gestionnaire : produisant deux dégradés linéaires des concentrations dans les réservoirs d’une plaque de cristallisation (la méthode des 4 coins).
   1. Tout d’abord, assurez-vous que le gestionnaire liquid est activé et initialisé avec son logiciel ouvert.
   2. Sous le « dégradé » onglet : Ouvrez le programme requis, sélectionnez le type de plaque de cristallisation et le volume final dans les réservoirs (tableau 3). Le paramètre avancé pour « max vol shot » devrait être ramené de 6 000 à 3 000 lors de l’utilisation de solutions contenant [isopropanol] > 10 % v/v et MPD] > 20 % v / v
   3. Préparer les seringues. Placez un piston dans chaque seringue (bout pointu vers le bas) et insérez le dos des seringues dans les rainures désignés sous la tête du robot. Tordre une seringue dans le sens horaire pour le bloquer en position (le programme va commencer qu’avec toutes les seringues nécessaires bien fixés).
   4. Préparer les auges. Retirez le cadre en acier inoxydable et insérer les auges. 4 positions de gauche correspondent aux 4 coins A, B, C, D. commutateur sur « SET UP » onglet qui affiche les volumes des solutions requises dans chaque seringue (le tableau 3, 0,5 volume mort de mL a été ajouté à l’affiche des volumes). Verser les solutions d’angle dans leurs creux respectifs et replacez le cadre sur le pont (l’armature maintient en position avec 2 petits aimants positionnés à l’avant du pont). Une autre manière de procéder à cette étape consiste à verser les solutions dans les auges, lorsqu’ils sont déjà placés sur le pont.
   5. Placer la plaque de cristallisation sur le support motorisé de la SBS.
   6. Cliquez sur « Aspirer » et d’attendre pour cette étape à compléter (lorsque les pistons s’est arrêté sur le chemin vers le haut).
   7. Basculez vers l’onglet « RUN » et exécuter le programme.
   8. Une fois le programme terminé, retournez à l’onglet configurer, puis cliquez sur « Supprimer » : le système supprime les seringues de solutions de restes et puis soulève les pistons tout le chemin. « Purger » peut être demandé au lieu de « Supprimer » ; ceci laissera les pistons à la position de fond, prête à aspirer plus de solutions avec les mêmes seringues.
   9. Enlever les seringues en tournant dans le sens anti-horaire.
   10. Jeter les seringues et les creux dans la benne appropriée (ou rincez-les à l’eau désionisée et puis solution à 20 % v/v d’éthanol pour les réutiliser).
   11. Sceller la plaque et placez-la sur la table de mixage de microplaque pendant 3 min à 1000 tr/min ou 10 min quand des solutions hautement visqueuses sont mixées. La plaque est prête pour la mise en place des gouttelettes de cristallisation sur la distributeur nanolitre.
2. Additif 1 (mise en place des gouttelettes de cristallisation dans une plaque à 96 puits cristallisation pré-remplie avec écran additive) de protocole de dépistage
   1. Tout d’abord, préparer l’État où les concentrations initiales des réactifs a augmenté de 10 % (min. vol. 15 mL lors du transfert de la condition d’un conteneur sur l’écran d’additif avec le gestionnaire de liquid).
   2. Assurez-vous que le gestionnaire liquid est prêt à fonctionner. Ouvrez le programme « Écran Ajouter aux additifs » pour une seule plaque (entrez le volume dans les réservoirs : 'µL 72 »). Invite, figures et une astuce-gestion système (conseils de 12 x 1 000 µL requis) aide à veiller à ce que le robot est prêt à fonctionner selon les sélections.
   3. Récupérer l’écran additive de l’incubateur de-20 ° C et retirer immédiatement son sceau d’en aluminium (utilisez le support de plaque), puis placer la plaque sur le pont du gestionnaire liquid. Le programme fonctionne selon un schéma de portrait (la plaque est placée avec l’A1-angle situé à l’avant gauche du transporteur). Aussi placer aussi le conteneur rempli la condition. Exécutez le programme.
   4. Une fois les réservoirs de la plaque ont été pourvus, le placer sur un agitateur de microplaque et exécuter le programme. Rincer le récipient de condition avec désionisée éthanol eau et 20 % pour la réutilisation.
   5. Mettre en place les gouttelettes sur la distributeur nanolitre. Tout d’abord, desceller la plaque de cristallisation (utilisez le support de plaque). Puis, placez la plaque et la protéine de 8 puits bande en première position du bloc porte-bande. L’onglet « Configuration » sur le logiciel de commande affiche les positions réelles de chaque composant sur le pont. Chargez chaque puits de la bande avec l’échantillon de protéine selon la taille des gouttes nécessaire (tableau 4). Exécuter le programme pour préparer les gouttelettes.
   6. Une fois le programme terminé, retirez la plaque du pont et scellez-la immédiatement (utiliser le film adhésif, ruban adhésif large de 3 pouces). Jetez la bandelette dans l’emplacement approprié.
   7. Évaluer la taille, la forme et le centrage des gouttelettes sous le microscope avant stockage.
3. Additif dépistage protocole 2 (mise en place des gouttelettes de cristallisation dans une plaque de 96 puits cristallisation avec un écran additif réutilisable)
   1. Tout d’abord, préparer l’écran additif : laisser la plaque de culture cellulaires congelés de 96 puits correspondant à décongeler à température ambiante pendant 40 min. Puis, centrifuger l’écran additif à 1 000 x g pendant 2 min.
   2. Préparer la condition (min. vol. 15 mL lors du transfert de la condition d’un conteneur sur l’écran d’additif avec le gestionnaire de liquid).
   3. Remplir les réservoirs d’une plaque 96 puits cristallisation avec la condition. Sur le liquide-gestionnaire, procéder de la même manière que le protocole 1, étape 2.2.2, mais entrez '80 µL » pour le volume dans les réservoirs.
   4. Mettre en place les gouttelettes sur la distributeur nanolitre avec 3 composantes sur le pont (la plaque contenant l’additif écran, ainsi que la plaque de cristallisation et de la bande de 8 puits protéine en première position du bloc porte-bande, tableau 4).
   5. Sceller la plaque de culture cellulaire contenant l’écran avec une feuille d’aluminium et placez-le dans l’incubateur de-20 ° C.
   6. Évaluer la taille, la forme et le centrage des gouttelettes sous le microscope avant stockage.

Résultats

1. le système 1 et plaques LMB

Figure 1 a montre le système 1 basé sur un gestionnaire liquid fonctionnant avec un système de liquide (eau déminéralisée). Le liquide-système comprend un conteneur, une pompe, tuyau, 8 seringues équipées de soupapes et 8 conseils fixes. Les paramètres de la classe liquide ont été optimisées pour aspirer/dispense une vaste gamme de solutions et multi-répartir dans 4 assiettes (multi-dispense nécessite un relativement grand excès de volume aspiré). Un récipient d’eau 22 L et un plus petit récipient (5 L) avec 20 % v/v d’éthanol sont stockés sous le système pour alimenter le système de liquide. Chaque conteneur est équipé de deux inserts de couplage. Un insert (en bleu) permet d’alimenter le système avec le liquide, l’autre (rouge) est un retour pour réduire l’excès de pression. Après utilisation, rinçage à l’eau, puis la solution à 20 % v/v d’éthanol empêche la prolifération microbienne. Une unité de refroidissement (également située sous le système) est connectée à un support de tube-refroidissement sur mesure. Système 1 est 2050 mm de large, y compris le carrousel, de 760 mm de profondeur et de 88 mm de hauteur. Il faut un supplémentaire 550 mm à l’avant pour la table de travail qui contient l’unité de commande de l’imprimante à jet d’encre et le film adhésif adhésive. Un espace supplémentaire est également nécessaire à côté du système pour le contrôle de PC. Le programme pour produire 72 plaques remplies au préalable (c'est-à-dire 18 tours de 4 assiettes) prend 3 h et 50 min.

Figure 1 b est un gros plan du pont principal, qui est équipé de 8 fixes conseils (Figure 1) montés sur un bras de pipetage automatisé, un second bras avec une pince, une station de lavage de pointe, porteuses de 2 x 4 broches pour plaques SBS et le support de tube de refroidissement. Le programme principal traite 4 assiettes à la fois qui sont sortis automatiquement au carrousel et placés sur le pont où ils sont remplis avec des conditions de cristallisation (80 µL dans les réservoirs, Figure 1). Niveaux de liquides sont automatiquement détectés car les pointes sont conductrices. Alors que le gestionnaire liquid distribue des conditions dans un ensemble de plaques, une autre série d’assiettes vides est souscrite au carrousel, étiquetée et placée sur le pont principal. Un petit support sur mesure et la fenêtre dans la paroi arrière du gestionnaire liquide étaient tenus pour positionner la tête de l’imprimante et son capteur à l’arrière du pont principal. Les 8 conseils sont vidées et lavées à l’eau du bac principal après chaque étape de distribution qui se compose de 4 parties aliquotes dans les colonnes correspondantes des réservoirs. Après que 4 assiettes ont été pourvus, ils sont automatiquement scellés et placés dans leur position d’origine dans le carrousel. Le film adhésif est déclenché par un pilote spécifique (appelé par le logiciel de commande). L’utilise un rouleau de ruban adhésif large de 3 pouces, qui est appliqué à une assiette avec des rouleaux sous pression mécanique. À la fin du programme, les plaques remplies au préalable sont retirés manuellement les empilements de carrousel et stockés dans un incubateur à 10 ° C situé à l’intérieur de l’installation.

Figure 1 : Remplir les réservoirs avec des kits de dépistage initial. (A) vue d’ensemble du système entièrement automatisé 1. Le carrousel est une entité automatisée avec piles de plaque et il est logé dans un bien fait d’acryliques clair feuilles sur le côté droit du pont principal. (B), le pont principal du gestionnaire en exploitation avec (a) le transporteur tube-refroidissement liquid (reliés à une unité de réfrigération dessous, non illustré), (b), le jeûne station de lavage (reliée au drainage, non illustré), (c), le bras de pipetage le bras de préhension apportant une plaque remplie sur (e) le transporteur motorisé de SBS de l’adhésif de remplissage 8 réservoirs d’une plaque 96 puits cristallisation, (d). À l’arrière de la platine est tête (f) l’impression de l’imprimante à jet d’encre connecté à (g) l’unité de commande de jet d’encre sous le scelleur. (C) A marqué plaque (nom de l’écran) et la date de production étant remplis par des conditions de cristallisation par 8 conducteurs fixé les pointes en acier inoxydable enduit de polytétrafluoroéthylène. (D) coupe transversale d’une cristallisation étanche bien. Le réservoir contient 80 µL de condition de cristallisation (tandis que la partie supérieure est bien vide). Réservoir et les spécifications de la profondeur des puits supérieur sont en millimètres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le tableau 1 montre les différentes formulations pour les kits de dépistage disponibles dans le commerce dans des éprouvettes. Les kits sont utilisés pour remplir les réservoirs des plaques de 96 puits cristallisation (LMB01-LMB22) sur une base régulière avec le système 1.

Nom de la plaque	nom de la trousse	fournisseur	Numéro de catalogue	tubes	description fondamentale
LMB01	Écran de cristal 1	Recherche de Hampton	HR2-110	48	Sparse Matrix (pH 4,6-8,5)
	Écran de cristal 2	Recherche de Hampton	HR2-112	48	Échantillonnage stochastique (pH 4,6-9.0)
LMB02	Assistant 1	Rigaku	1009530	48	Échantillonnage stochastique (pH 4,5-10,5)
	Sorcier 2	Rigaku	1009531	48	Échantillonnage stochastique (pH 4,5-10,5)
LMB03	Sulfate d’Ammonium de grille écran	Recherche de Hampton	HR2-211	24	Écran de la grille, [AmS] = 0,8 à 3,2 M et tampons pH 4,0-9.0
	Grille écran PEG/LiCl	Recherche de Hampton	HR2-217	24	Écran de la grille, [PEG 6000] = 0-30 %p/v, conc. LiCl = 1,0 M et tampons pH 4,0-9.0
	Écran rapide	Recherche de Hampton	HR2-221	24	Écran de la grille, [NaKPO4] = 0,8 à 1,8 M à pH 5.0-8.2
	Chlorure de Sodium grille écran	Recherche de Hampton	HR2-219	24	Écran de la grille, [NaCl] = 1,0 à 4,0 M et tampons pH 4,0-9.0
LMB04	Grille écran PEG 6000	Recherche de Hampton	HR2-213	24	Écran de la grille, [PEG 6000] = 5-30 %w/v et tampons pH 4,0-9.0
	Grille écran MPD	Recherche de Hampton	HR2-215	24	Écran de grille MPD] = 10-65 %w/v et tampons pH 4,0-9.0
	MemFac	Recherche de Hampton	HR2-114	48	Sparse Matrix pour les protéines de la membrane (pH 4,6-8,5)
LMB05	PEG-Ion	Recherche de Hampton	HR2-126	48	Écran de la grille, [PEG 3350] = 20 %w/v et divers sels à 0,2 M (pas de tampons)
	Natrix	Recherche de Hampton	HR2-116	48	Factorielle incomplète (pH 5,6-8,5)
LMB06	Écran de Crystal Lite	Recherche de Hampton	HR2-128	48	1 écran cristal avec la moitié des concentrations precipitant originales
	Custom Lite écran	Dimensions moléculaires	n/a	48	Conditions supplémentaires avec de faibles concentrations precipitant
LMB07	Assistant Cryo 1	Rigaku	1009536	48	Échantillonnage stochastique avec des conditions cryoprotected à l’aide de pinces à faible MW (pH 4,5-9,4)
	Assistant Cryo 2	Rigaku	1009537	48	Échantillonnage stochastique avec des conditions cryoprotected à l’aide de pinces à faible MW (pH 4,5-10.1)
LMB08	JBS1	JenaBioScience	CS - 101L	24	Factorielle incomplète basée sur divers supports (pH 4,6-9.0)
	JBS2	JenaBioScience	CS - 102L	24	Factorielle incomplète basée sur PEG 4000 (pH 4,6-8,5)
	JBS3	JenaBioScience	CS - 103L	24	Factorielle incomplète basée sur PEG 4000 (pH 4,6-8,5)
	JBS4	JenaBioScience	CS - 104L	24	Factorielle incomplète basée sur moyen MW chevilles (pH 6,5 à 8,5)
LMB09	JBS5	JenaBioScience	CS - 105L	24	Factorielle incomplète basée sur lourdes chevilles MW (pH 6,5 à 9,5)
	JBS6	JenaBioScience	CS - 106L	24	Factorielle incomplète basée sur AmS (pH 4,6-8,5)
	JBS7	JenaBioScience	CS - 107L	24	Factorielle incomplète basée sur MPD (pH 4,6-8,5)
	JBS8	JenaBioScience	CS - 108L	24	Factorielle incomplète basée sur MPD et éthanol (pH 4,6-8,5)
LMB10	JBS9	JenaBioScience	CS - 109L	24	Factorielle incomplète basée sur les sels de common et propanol-2 (pH 4,6-8,5)
	JBS10	JenaBioScience	CS - 110L	24	Factorielle incomplète basée sur common sels (pH 4,6-8,5)
	Désactivez la stratégie écran 1 pH 4.5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
	Désactivez la stratégie écran 1 pH 5.5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
LMB11	Désactivez la stratégie écran 1 pH 6,5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
	Désactivez la stratégie écran 1 pH 7.5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
	Désactivez la stratégie écran 1 pH 8,5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
	Désactivez la stratégie écran 2 pH 4.5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
LMB12	Désactivez la stratégie écran 2 pH 5.5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
	Désactivez la stratégie écran 2 pH 6,5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
	Désactivez la stratégie écran 2 pH 7.5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
	Désactivez la stratégie écran 2 pH 8,5	Dimensions moléculaires	MD1-16LMB	24	Écran de grille avec des pinces à divers
LMB13	Index	Recherche de Hampton	HR2-144	96	Petits écrans sparse matrix et grille (pH 3.0-9.0)
LMB14	SaltRX 1	Recherche de Hampton	HR2-107	48	Écran de grille dont 22 unique des sels par rapport à la concentration en sel et pH (4.1 à 9,0)
	SaltRX 2	Recherche de Hampton	HR2-109	48	Écran de grille dont 22 unique des sels par rapport à la concentration en sel et pH (4.1 à 9,0)
LMB15	MemStart	Dimensions moléculaires	MD1-21	48	Matrices creuses pour les protéines de la membrane (pH 4,0 et 10,0)
	MemSys	Dimensions moléculaires	MD1-25	48	Écran de la grille pour les protéines de la membrane (pour la plupart, les chevilles, les pH 3.5-9,5)
LMB16	JCSG +	QIAGEN	130720	96	Sparse Matrix (pH 4,0 et 10,0)
LMB17	Écran de MORPHEUS	Dimensions moléculaires	MD1-46	96	Écran de grille, y compris les mélanges d’additifs et de conditions de cryoprotected (pH 6,5 à 8,5)
LMB18	Écran un minimum de pi	JenaBioScience	CS-127	96	Factorielle incomplète (pH 4,0-9,5)
LMB19	Écran de pi-PEG	JenaBioScience	CS-128	96	Factorielle incomplète des protéines membranaires (pH 4,8-8,8)
LMB20	Écran de MORPHEUS II	Dimensions moléculaires	MD1-91	96	Écran de grille, y compris les mélanges d’additifs (atomes lourds) et les conditions de cryoprotected (pH 6,5 à 8,5)
LMB21	Écran de cristallisation LMB	Dimensions moléculaires	MD1-98	96	Matrices creuses y compris conditions sélectionnées parmi les publications de la LMB
LMB22	Écran de MORPHEUS III	Dimensions moléculaires	n/a	96	Écran de grille, y compris les mélanges d’additifs (composés médicamenteux) et cryoprotected conditions (pH 6,5 à 8,5)

Tableau 1 : Formulations des kits trouvés en plaques LMB. Chaque kit de projection se compose de 24/48/96 conditions initialement dans des éprouvettes. Les plaques LMB sont stockés dans des incubateurs de 10 ° C situés à l’intérieur de l’établissement où ils sont accessibles aux utilisateurs à tout moment.

2. système 2 et les exigences pour la mise en place des gouttelettes

Figure 2 a montre le système 2 basé sur un gestionnaire liquide¹⁹ fonctionnant avec déplacement positif et des embouts jetables. Les embouts jetables sont fournis dans des paniers empilables adaptés à une manutention automatisée. Un pont de 3 positions nanolitres distributeur²⁰ a été intégré sur le côté droit du système. Aspiration/distribuer sur la distributeur nanolitres fonctionne aussi avec déplacement positif, à l’aide de microseringues jetables (fourni en grandes bobines). Comme un robot autonome, un bloc de bande emportable est utilisé pour charger des échantillons de protéines. Pour le processus entièrement automatisé, une plaque PCR 384 puits remplace le titulaire de la bande. Un même film adhésif adhésive au système 1 a été intégré sur le côté gauche. Le scellant et le distributeur nanolitres debout sur des tables de travail sur mesure, surélevées afin que la pince principale atteindre les transporteurs plaque de ces deux robots intégrés (une fenêtre a dû être coupé dans les deux panneaux latéraux du gestionnaire liquid pour la pince accéder à l’extérieur le pont principal). Le programme principal appelle les pilotes spécifiques à gâchette nanolitres distribution programmes et le scellant en bonne heure. Le système 2 est de 2 850 mm de large, profondeur 800 mm et 800 mm de hauteur. Un espace supplémentaire est nécessaire à côté du robot pour l’affichage de l’ordinateur de contrôle. Deux poubelles sont situées sous le système de conseils et de microseringues rejetées au cours du processus (le PC de contrôle est également stocké sous). Une caractéristique importante du système 2 est la mise en page globale, qui conserve un accès facile aux trois robots afin qu’ils peuvent être utilisés individuellement pour les protocoles d’optimisation décrites précédemment, ou autres protocoles décrits ailleurs comme la cristallisation des protéines de la membrane lipidique mésophases²¹ et matrice aléatoire microseed dépistage²².

Figure 2 b est un gros plan sur le pont qui est équipé d’un bras robotisé unique. Le bras intègre 12 sondes indépendantes de pipetage et la pince principale. Les positions des sondes peuvent être contrôlées individuellement dans une seule direction afin d’accéder à différents endroits le long de l’axe entre les sondes ou même de simples tubes. Les sondes peuvent ramasser des embouts jetables (1-12) ou une paire de plaque de terrassement adaptateurs. Deux jeux de 4 piles contenant 50 embouts jetables µL est chargées au départ. Niveaux de liquides sont automatiquement détectés car les pointes sont conductrices. Les adaptateurs de plaque de terrassement sont conçus avec 2 broches tranchants à l’intérieur qui forment une pince facultatif lorsque nécessaire. Sur le pont principal est situé un microtube 24 positions, support pour l’échantillon, de refroidissement, bien que seulement 1-2 positions sont utilisées ici. En outre, il y a un support pour la plaque PCR et également 2 porteurs de rangement pour couvercles SBS empilables, sur mesure (Figure 2). Enfin, il y a 4 supports coulissants, chacune avec 5 emplacements pour les plaques de cristallisation (4 x 5 = 20 plaques).

Figure 2 : Mise en place des gouttelettes pour expériences de diffusion de vapeur. (A) vue d’ensemble du système entièrement automatisé 2. (B), le pont principal du gestionnaire liquid en opération avec (a) le stockage des transporteurs pour les cheminées de couvercles SBS, (b) l’empilable conseils, transporteur (c) le refroidissement-transporteur auprès d’un échantillon en microtube, (d) pour les 2 plaque de terrassement adaptateurs, (e), la plaque de la PCR pour le transfert de plaques de protéine pour le robot de manutention nanolitre, (f) 9 scellé qui ont été placées dans leur position initiale, (g) la pince en option retrait du couvercle SBS de la 10^ème plaque tout pour être transporté sur le pont du gestionnaire liquid, (h) la prochaine 10 plaques à préparer avec des couvercles SBS sur le dessus, (i) la pince principale qui est utilisée pour transporter les plaques PCR et cristallisation, (j) le principal automatisé bras intégrant 12 sondes de pipetage (2 utilisé pour servir de pince en option) et la pince principal et (k) le pont du distributeur nanolitre. (C) couvercles SBS personnalisés interne en aluminium. Les couvercles d’intégrer une feuille de caoutchouc pour éviter l’évaporation des conditions et deux petits trous pour être exactement ramassés par la pince en option. (D) coupe transversale d’une cristallisation étanche bien où le réservoir est rempli avec une condition et le puits supérieur contient une gouttelette composé de l’échantillon de protéine et de la condition. Parce que le précipitant dans la goutte est moins concentré que dans l’État, les concentrations de tous les composants dans le menu déroulant remontent dans l’eau perte durant le processus d’équilibration par diffusion de la vapeur (très schématiquement représentée par une flèche). (E) micrographes de 100 nL et (F), 200 gouttelettes nL produites par le distributeur nanolitre avec une solution d’essai (20 % v/v polyéthylèneglycol 400, 0,001 % p/v safranine comme colorant rouge). La taille et la forme des gouttes peuvent varier selon physicochimique de la condition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le programme principal commence avec la pince en option retrait du couvercle de la SBS de la première plaque de cristallisation. Après que le couvercle a été transféré au transporteur de stockage correspondantes, la plaque de cristallisation est transportée sur le pont du distributeur nanolitre. Le bras de pipetage transfère ensuite la quantité d’échantillon nécessaire pour mettre en place des gouttelettes de microtube normalement réfrigéré à la première colonne de la plaque PCR. Par la suite, la pince principale déplace la plaque PCR sur le pont du distributeur nanolitres qui préparera les gouttelettes suivant les options choisies par l’utilisateur au début (e.g. taille des gouttelettes). Pour ce faire, l’échantillon de protéine est tout d’abord dispensé dans les supérieur-puits (à l’aide d’un seul ensemble de 8 microseringues et multi-distribution), puis les conditions de cristallisation sont distribuées sur les gouttelettes de protéine (chaque ligne requiert maintenant 8 microseringues de nouveau afin d’éviter contamination croisée). Après avoir terminé le programme à mettre en place des gouttelettes, la pince principale transporte la plaque correspondante à l’adhésif, puis place la plaque PCR dans sa position d’origine (plus de protéines sera distribué dans la colonne suivante de la plaque PCR pour cette plaquette ). Enfin, la plaque scellée de cristallisation est déplacée vers sa position d’origine sur le pont : expériences de diffusion de vapeur ont déjà commencé dans cette plaque (Figure 2D). Ce cycle se répète selon le nombre d’assiettes. Lorsque nécessaire, la pince en option supprime un rack vide Astuce permettant le bras de pipetage accéder à plus de conseils. Le programme prend 2 heures et 20 min et 440 µL de l’échantillon pour préparer des gouttelettes unique à 20 plaques à l’aide de 100 nL échantillon + 100 condition nL (Figure 2E et 2F).

Lorsque vous utilisez le distributeur nanolitres comme stand-alone robot pour deux plaques supplémentaires (voir le protocole, étape 1.2.3), l’ensemble des plaques de présélection disponibles dans un incubateur à 10 ° C peut être mis en place (22 conditions de plaques x 96 LMB = 2 112 conditions).

Le tableau 2 montre les exigences pour le programme principal selon la sélection de l’utilisateur sur le système 2.

Plaques		Taille des gouttes (nL)	Ou les échantillons		Exigences de pointe		Durée
Nombre	Type de		Vol. 1 (µL)	Vol. 2 (µL)	50 embouts µL	Microseringues
10	96 puits	100	240	0	80	1040	1 h 12 min
20	96 puits	100	440	0	160	2080	2 h 20 min
10	96 puits	100	240	240	160	2080	1 h 45 min
20	96 puits	100	440	440	320	4160	3 h 05 min
10	48-puits	1000	624	0	80	560	1 h 10 min
20	48-puits	1000	1208	0	160	1120	2 h 16 min

Tableau 2 : exemples des options de programme principal disponibles sur le système 2 pour mettre en place des gouttelettes de cristallisation. La quantité d’échantillon de protéine, des conseils et des microseringues nécessaire varient selon le programme. Les volumes d’échantillon "vol. 1' (1 goutte) et ' vol. 2' (drop 2) sont calculées comme suit : (8 conseils x requis perte de volume / puits de la plaque PCR + 4 µL volume) x nombre de plaques de cristallisation + volume mort de 40 µL dans microtube. Le volume requis / puits de la plaque de PCR pour 100 gouttes de nL en plaque 96 puits cristallisation est 2 µL, tandis que 6,8 µL est requis pour 1 000 gouttelettes nL dans une plaque de 48 puits (volume mort dans le puits de la plaque PCR : 0,8 µL). Un volume supplémentaire d’échantillon est tirée en considération (« volume perdu ») due à l’évaporation le microtube et autres pertes (par exemple l’échantillon coller sur conseils). Par exemple, pour 20 plaques de MRC, 100 nL, 1 goutte protocole, le volume d’échantillon requis est : (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (c'est-à-dire, l’équivalent de 22 µL par plaque). Huit pointes µL 50 jetables sont nécessaires pour chaque plaque et chaque échantillon. Par exemple, pour 10 plaques, protocole 2-baisse, le nombre de conseils requis est de 8 x 10 x 2 = 160 conseils. Le nombre de microseringues est calculé comme suit : (8 + certaines conditions par plaque) x nombre d’échantillons x nombre de plaques. Par exemple, pour plaques à puits 10 x 48, le nombre de conseils de gestionnaire liquide requis est : (8 + 48) x 1 x 10 = 560 conseils.

3. formuler, de préparation et de manipulation des solutions 4-coin

Les deux formulations des solutions de 4 angle (« A, B, C et D ») et l’écran d’optimisation correspondante (Figure 3 a) sont générées automatiquement par une feuille de calcul Excel. Il y a des feuilles de calcul différentes à différents nombres de conditions — essentiellement de 24, 48 et 96 conditions — et aussi des feuilles de calcul pour préparer deux écrans optimisation différentes en une seule plaque. En général, on prépare un ensemble de 4 x 10 mL des solutions d’angle dans des éprouvettes de 2 – 3 écrans d’optimisation qui peuvent être préparés, selon le nombre et le volume des conditions requises. Les solutions sont versées dans les auges, d'où ils sont aspirés par un gestionnaire liquid axée sur la seringue et plus tard distribués directement dans les plaques (Figure 3 b). Les deux gradients linéaires des concentrations résultent du mélange A, B, C et D à systématiquement divers ratios (Figure 3).

Figure 3 : la méthode 4-coin pour la préparation des écrans optimisation. (A) représentation des deux gradients de concentrations à travers une présentation de la plaque à 96 puits. (B) le gestionnaire liquid axée sur la seringue prêt à préparer un écran avec 4 seringues insérés dans la tête du robot. Une plaque de cristallisation se trouve dans le transporteur motorisé de la SBS et le 4 à partir de solutions (A, B, C et D) ont déjà été distribués dans leurs creux respectifs (les solutions ont été couleur rouge uniquement à des fins de démonstration). (C) les rapports des solutions A, B, C et D 96 réservoirs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le tableau 3 montre les conditions requises pour les programmes disponibles aux utilisateurs sur le liquide-gestionnaire axée sur la seringue.

Type de plaque	Lol des conditions	Vol. en plaque (réservoirs, µL)	Vol. en creux (mL)	Durée
96 puits	48	80	1.6	2 min 5 s
96 puits	96	80	2.5	3 min 50 sec
96 puits	2 x 48	80	1.6	2 min 50 s
48-puits	24	200	1.8	2 min 25 sec
48-puits	48	200	3	4 min 20 sec

Tableau 3 : programmes disponibles sur le gestionnaire liquid axée sur la seringue pour la préparation des écrans optimisation selon la méthode des 4 coins. La plaque à 96 puits peut être utilisée pour préparer l’écran optimisation 96 - 48-État (lorsque deux écrans de 48-condition sont préparés en même temps, le robot doit être équipé 8 seringues et 8 creux). Autres programmes permettent d’utiliser des plaques de 48 puits. Les volumes répertoriés dans des caniveaux comprennent le volume mort requis (0,5 mL).

4. l’additif dépistage

La figure 4 montre les étapes à effectuer un dépistage additif commençant soit avec 96 solutions additives déjà dans les réservoirs de la plaque de cristallisation (protocole 1) ou dans les puits d’un profil bas plaque de culture cellulaire utilisé comme un écran additif réutilisables ( Protocole 2). Le tableau 4 énumère les programmes disponibles sur la distributeur nanolitres selon les deux types de protocoles.

Figure 4 : les deux types de protocoles pour le dépistage de l’additif. Les écrans de 96-additif sont stockés à-20 ° C. Suite de protocole 1, l’écran additif est ajouté au départ dans les réservoirs des plaques cristallisation (et idéalement stocké de cette façon). Un gestionnaire liquide ou l’échantillon est utilisé pour distribuer la condition dans les réservoirs contenant les solutions additives (le volume d’écran additif représente 10 % du volume final dans les réservoirs : 8 µL volume final de 80 µL). Après avoir mélangé les conditions sur une table de mixage de microplaque (non illustré), le distributeur axée sur la microseringue nanolitres sert à mettre en place les gouttelettes (tableau 4). À la suite de protocole 2, l’écran additif est ajouté seulement plus tard tout en créant les gouttelettes de cristallisation. Cette fois-ci le distributeur nanolitre est employé pour préparer des gouttelettes avec un composant supplémentaire sur le pont (la plaque de culture cellulaire réutilisable contenant l’additif écran). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocole		Taille des gouttes (nL)			Type de bande	Échantillon vol. (µL)		Lol des microseringues	Durée
Type de	Source d’additifs	Protéine	Condition	Additif		Dans chaque cupule (bande)	Total
1	plaque 96 puits cristallisation	100	100	0	2 ΜL	2	16	104	2 min
1	plaque 96 puits cristallisation	200	200	0	5 ΜL	3.8	31	104	2min 10sec
2	plaque de culture cellulaire de 96 puits	200	200	100	5 ΜL	3.8	31	200	3min 45 sec
2	plaque de culture cellulaire de 96 puits	500	500	100	5 ΜL	7.4	60	200	4min 15 sec

Tableau 4 : programmes disponibles sur la distributeur nanolitres axée sur la microseringue pour le dépistage de l’additif. Le volume requis de l’échantillon dans chaque puits de la bande de 8 puits est calculé comme suit : volume mort + 12 x drop taille. Il existe 2 types de bandes (2 µL et 5 µL). Les volumes morts sont µL 0,8 pour les 2 puits µL (qui peut en fait contenir 3,2 µL max.) et 1,4 µL pour 5 puits µL (7,5 µL max.). Le volume total de protéine nécessaire : 8 x volume en puits de la bande (valeur de rafles). Le volume mort des puits de la plaque de culture cellulaire de 96 puits en forme de V est 2,5 µL. Le nombre requis de microseringues varie en fonction du programme sélectionné (8 + 96 = 104 ; ou 8 + 2 x 96 = 200).

En raison de la dilution de l’état avec l’additif au protocole n° 1, la condition doit être préparé à une concentration proportionnellement supérieure au départ. L’augmentation de la concentration finale est plus facilement atteint en réduisant l’addition finale de l’eau au volume final calculé. Après cela, on simplement part avec le jeu normal vers le haut des gouttelettes qui se mélangent la condition et l’échantillon (par exemple, 100 nL protéine + 100 condition nL déjà mélangée avec des additifs). Protocole 2 (par exemple, 200 nL protéine + condition de nL 200 + 100 additif nL) facilite la projection à différentes concentrations d’additifs en faisant simplement varier le volume d’écran additif ajouté. Protocole 2 implique plus ou moins de dilution des gouttelettes (ce qui peut altérer la cristallisation).

Le gestionnaire liquid du système 2 peut être utilisé pour aspirer suffisamment condition dans 12 conseils et diluer 8 aliquotes dans les réservoirs d’une plaque de 96 puits (voir le protocole, étape 2.2.2), bien que cette étape peut bien sûr se faire manuellement avec une pipette multicanaux ( Figure 4). Plusieurs planches peuvent être remplis à la fois avec le même État lorsque vous utilisez le gestionnaire de liquid (pour tester différents écrans additifs plus tard). Lors de la préparation 2 assiettes, remplir le réservoir de réactif d’au moins 23 mL. Lors de la préparation à 3 plateaux, remplissez le réservoir de réactif avec au moins 31 mL.

5. plaques de cristallisation et dispositifs associés

La conception des deux plaques de cristallisation de diffusion MRC séance-goutte vapor (96 puits 2-déplacer 48 puits 1-déposer, Figure 5 a et 5 b Figure) fournit des caractéristiques qui permettent des expériences de cristallisation automatique fiable et efficace, avec notamment la forme sphérique des haute-puits et une légère forme en V des réservoirs qui facilitent la distribution précise et aussi centrifugation lorsque des gouttelettes de centrage est nécessaire. En outre, les haut-puits ont un effet de lentille pour un éclairage optimal sous un stéréomicroscope (le polymère est transmissible pour la détection des cristaux absorbeurs UV ou fluorescents²³UV).

Un sceau personnalisé (Figure 5) permet la mise en place de pendaison des expériences de cristallisation baisse dans les deux types de plaques avec un distributeur nanolitres (protocoles non illustrés). Enfin, les deux plaques MRC ont les mêmes dimensions extérieures et la jante. La jante s’insère dans les rainures de notre support de plaque sur mesure (Figure 5), qui est utilisé pour placer/suppression manuelle ruban d’étanchéité sans éclaboussures de liquides.

Figure 5 : plaques de cristallisation de la MRC et dispositifs associés mis au point à la LMB. (A) A1-coin de la plaque à 96 puits. Le réservoir (oblong) est sur le côté gauche de l’évidement de la cristallisation, les deux haut-puits sphériques sur la droite. Les dimensions sont en millimètres. (B) A1-coin de la plaque 48 puits. Le réservoir est sur le côté droit du puits (1 grand haut-puits seulement). Joint suspendu (C), à la MRC. (D), à la plaque personnalisée interne titulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

6. cristaux de protéine

La figure 6 montre des exemples d’utiles cristaux obtenus avec nos protocoles automatisés.

Figure 6 : allumer les micrographies de gouttelettes contenant des cristaux obtenus en suivant les protocoles automatisés. (A, B) Cristaux de dépistage initial du FPMO et MreB dans des plats préparés avec les 2 complètement des systèmes automatisés (voir protocole points 1.1 et 1.2, conditions : A4 bien LMB07 et LMB20 bien D12, respectivement, la taille des gouttelettes est 100 protéines nL + 100 nL condition, travail de Andrzej Szewczak, LMB)²⁴. (C, D) Barre de cristaux de domaine avant et après l’optimisation des conditions initiales avec la méthode 4-coin (étape 2.1, LMB02 B6, 1 000 nL + 1 000 nL, œuvre de Leonardo Almeida-Souza, LMB inédite). (E, F) La chaîne lourde de cristaux de domaine N-terminal dynéine humaine 1 avant et après l’optimisation des conditions initiales avec la méthode 4-corner (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, puis 500 nL + 500 nL, œuvre de Edgar Morales-Ríos, LMB inédite). (G, H) Compléter les cristaux facteur D avant et après l’optimisation de la condition avec projection additive (étape 2.2, la condition initiale d’interne écran personnalisé, 200 nL + 200 nL, additif D6 dans l’écran additif 96-condition, œuvre de Matthias Bauer, inédite LMB). (I, J) Cristaux de²⁵ glycoprotéine enveloppe virale avant et après l’optimisation de la condition avec projection additive (étape 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, puis 200 nL + 200nL + additif de nL 100 E5 depuis l’écran d’additif 96-condition, œuvre de Yorgo inédite MODIS, Université de Cambridge, Royaume-Uni). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

1 - préparation et utilisation des dépistages initiaux stockés en plaques

Trousses de dépistage doit être mélangé avant d’être distribués en plaques car légère séparation de phase ou de précipitations se produit dans quelques tubes pendant le stockage. Quand un écran est composé de deux kits (tubes 2 x 48), le premier tube du second kit est placé dans emplacement E1 du transporteur refroidissement. Quand un écran est composé de 4 kits (4 x 24 tubes), le premier tube du second kit est placé dans emplacement C1, le premier tube du troisième kit est placé dans l’emplacement E1 et le premier tube du quatrième kit est placé dans l’emplacement G1. Tout en insérant des tubes dans leur entreprise de refroidissement, les couvercles sont placés sur un plateau suite à la mise en page standard 96 puits paysage. Car bien numéros sont indiqués sur le dessus des couvercles par les fabricants, cela permet de recouper si tous les tubes ont été placés dans le bon ordre. Cela permet également de remplacer les couvercles correctes sur les tubes lors du remplissage d’un nombre réduit de plaques.

Nous stockons les plaques pré-rempli à 10 ° C, un compromis pour éviter la congélation et stockage à 4 ° C qui peut causer une détérioration des conditions et des problèmes avec étanchéité. Plaques sont stockées pendant plusieurs mois avec normalement sans condensation visible sur la face intérieure du joint. C’est moins vrai pour les plaques de LMB05, LMB06, LMB09 et LMB10, car ceux-ci contiennent des conditions avec des concentrations relativement élevées de réactifs instables (tableau 1). Petite quantité de condensation sur la face interne du joint réduit étanchéité et peut engendrer une contamination croisée entre les loges tandis qu’apposés les plaques. Pour aider à prévenir la condensation pendant le refroidissement initial, plaques peuvent être transférées d’abord au carrousel dans un pique-nique isotherme glacière qui est stocké dans une chambre froide de 4 ° C durant la nuit. Le refroidissement très lent réduit le développement des gradients de température dans les puits scellés et donc réduit la condensation globale¹⁵. En outre, une fois que les plaques sont stockées dans un incubateur à 10 ° C, un couvercle de polystyrène SBS personnalisé interne est placé sur la plaque en haut de chaque pile (non illustré).

L’ensemble de nos assiettes remplies au préalable peut être utilisé comme un grand écran initial contre un échantillon de protéines solubles dans l’eau, roman. Par ailleurs, moins de plaques peuvent être sélectionnés pour répondre aux besoins spécifiques. Par exemple, LMB15 et LMB19 sont des écrans formulées spécialement pour les protéines de membrane échantillons^26,27, ou LMB20 est un écran formulé avec des atomes lourds pour faciliter l’élimination expérimentale de la diffraction données²⁸ (voir aussi : Formulation des protéines MORPHEUS cristallisation écrans).

2. mise en place des gouttelettes de cristallisation

Lorsque vous utilisez le système 2, kits avec des quantités importantes de réactifs instables de dépistage doit être traitée en premier. Cela évite la condensation sur le caoutchouc des couvercles SBS, qui pourrait affecter la manipulation du couvercle et plaque d’étanchéité. Un couvercle SBS a un peu d’espace libre lorsque sur le dessus d’une plaque, c’est pourquoi ils doivent être alignés au départ (voir le protocole, étape 1.2.6). Les volumes morts de protéine dans les puits de la plaque de la PCR sont relativement généreux (0,8 µL, voir la légende du tableau 2). Notez que tout aussi généreux volumes morts sont employés lorsque vous utilisez le distributeur nanolitres individuellement avec les protéines en bandes de 8 puits (tableau 4). Petits volumes morts peut fonctionner, cependant certains échantillons respectent les conseils, étalonnage d’un robot peut devenir légèrement inexacte, la salle peut être plus chaude que d’habitude, etc.. Toutes mènent à des pertes d’échantillon couvertes par les généreux volumes morts afin de consolider l’approche.

Développements récents a permis plus loin la miniaturisation des expériences et par conséquent le volume d’échantillon requis pour le dépistage des conditions de cristallisation peut être significativement réduit en intégrant la technologie correspondante^29,30 . Cependant, certains aspects de la miniaturisation de plus besoin d’un examen minutieux, tels que l’évaporation des gouttelettes³¹ et la manipulation des microcristaux³².

Enfin, la centrifugation de la plaque (2 000 tr/min, 1 min) pourrait être intégrée comme une étape de routine lorsque vous configurez des gouttelettes de cristallisation (en sphériques supérieure-puits). Taille et leur forme de gouttelettes résultant de la centrifugation plus cohérente peuvent réduire la reproductibilité questions^33,34. Sûrement, gouttes centrés facilitera l’évaluation ultérieure des expériences à l’aide d’un microscope car la distance focale nécessaire sera similaire dans l’ensemble de la plaque entière.

3. les avantages de la méthode 4-coin

L’avantage plus important de la méthode 4-coin réside dans sa simplicité, ce qui minimise les erreurs et facilite les protocoles automatisés simples. Par exemple, les solutions de 4 angle seront toujours placées sur le pont d’un gestionnaire liquid suivant la même présentation. Aussi, tous les programmes sont basés sur des rapports fixes entre les solutions (Figure 3).
Manuel de préparation des solutions 4 coin est préféré au traitement automatisé des solutions à des concentrations élevées qui peuvent être fortement visqueuses. Il est alors possible sur la plupart des types de gestionnaires de liquides avec des exigences minimales pour l’optimisation des classes liquides d’aspiration/distribution relativement rapide et précise. Néanmoins, certaines solutions d’angle est peut-être encore trop visqueuses pour un robot fonctionnant avec un liquide-système de fonctionner efficacement. C’est pourquoi nous avons opté pour un gestionnaire liquid fonctionnant avec déplacement positif (Figure 3 b).

Outre les 2 dégradés linéaires, des opérations de concentration, un troisième volet (c.-à-d., un ensemble de tampons/additifs) peut être testé à une concentration constante d’une manière pratique. Pour ce faire, un volume relativement important d’un ensemble de solutions d’angle à une concentration appropriée, à l’exclusion de la composante de faire varier, on prépare tout d’abord. Solutions courantes, y compris ce composant est ensuite rajouté pour ajuster les concentrations finales. Par exemple, 50 mL d’un ensemble de 4 solutions d’angle sont préparés à des concentrations supérieures à 10 % celles initialement. Cette série de base est ensuite divisée en 5 sous-ensembles de 4. Enfin, 10 % en volume des solutions tampon pH différent est ajouté à chaque sous-ensemble.

4. les formats et types d’écrans additifs

Les écrans sont normalement stockés à-20 ° C (Figure 4), car ils ne sont pas utilisés régulièrement et contiennent des composés volatiles/unstable. L’utilisation d’un écran additif congelé stocké dans un bloc de puits profonds (1 mL dans les puits) doit être planifiée dès le début parce qu’il faudra de 12 à 24 heures pour toutes les solutions additives décongeler complètement à température ambiante. Aussi, une multitude d’utilisateurs partagent le même écran additif, pouvant causer des problèmes avec la contamination croisée. Enfin, la hauteur des blocs de puits profonds qui les rend impropres pour la plupart des distributeurs de nanolitre. Comme une solution pratique pour contourner ces problèmes, l’écran doit être transférée du puits profond bloc à profil bas plaques (Figure 4).

Des écrans additifs incluent une grande variété de réactifs simples (avec des concentrations unique) ont toujours été très populaire^35,36. Toutefois, autres types d’écrans additifs ont été développés qui intègrent les mélanges d’additifs³⁷ ou un nombre réduit d’additifs unique à différentes concentrations,³⁸. Enfin, une approche complémentaire est d’étudier l’effet des additifs sur les échantillons avant cristallisation^39,40.

5. autres considérations

Bonnes pratiques : La plupart des écrans contiennent des substances dangereuses ou toxiques même et donc protection individuelle adéquats doit être employée pendant les protocoles. Également, pièces des robots mobiles peuvent entraîner des blessures, surtout lorsque vous essayez d’intervenir manuellement alors qu’un programme s’exécute (bien que la plupart des robots ont système/bouton d’arrêt d’urgence). À cause des complexités techniques impliquées, régulières vérifiant des robots, des écrans et des programmes avec caractérisait auparavant échantillons testés sont importants pour des niveaux élevés soutenus de reproductibilité.

Débit : À titre indicatif, entre 4 000 à 8 000 LMB tôles sont produites chaque année avec le système 1 (et par la suite employées par les utilisateurs pour le dépistage initial). Il n’est pas adapté au stock une grande quantité de plaques pré-rempli à 10 ° C lorsque le chiffre d’affaires escompté est beaucoup plus faible, comme après 4-5 mois, certaines conditions commencera à se détériorer et s’évaporer. Différentes approches aux protocoles d’automatisation ont été appliquées pour les laboratoires de petites à moyennes,⁴¹.

Stockage et évaluer les expériences : Après avoir préparé les gouttelettes, plaques sont stockés sur des étagères de bas-vibration dans une chambre à 4 ou 18 ° C et température étroitement contrôlée (+/-écart maximal de 0,5 ° C). Des expériences sont évaluées à l’aide de microscopes de source de lumière froide. Divers systèmes d’imagerie automatisées sont disponibles dans le commerce, mais on devrait considérer soigneusement tous les aspects : la vitesse requise pour analyser une plaque sera suffisante pour un débit élevé ? Objets autres que les cristaux n’interférera avec autofocus ? La qualité qui en résulte des images sera suffisante pour spot très petits cristaux (surtout sur le pourtour des gouttelettes) ? ^{42 , 43 , 44}

Comparaison des conditions de cristallisation : Après enquêtes prudents quant à la nature des cristaux obtenus au départ, on peut analyser les tendances et les similitudes dans l’ensemble des conditions à l’aide de la base de données LMB écran ou la C6 Webtool⁴⁵.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Robots
Freedom EVO®	Tecan	n/a	Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.
Microlab® STAR™	Hamilton	n/a	Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito®	TTP Labtech	n/a	Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.
Dragonfly®	TTP Labtech	n/a	Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.
Adhesive plate sealer	Brandel	n/a	Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232	Markem-Imaje	n/a	Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1	Hampton Research	HR2-110	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™	Hampton Research	HR2-112	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1	Rigaku	1009530	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2	Rigaku	1009531	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate	Hampton Research	HR2-211	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl	Hampton Research	HR2-217	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™	Hampton Research	HR2-221	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride	Hampton Research	HR2-219	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000	Hampton Research	HR2-213	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD	Hampton Research	HR2-215	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™	Hampton Research	HR2-114	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™	Hampton Research	HR2-126	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™	Hampton Research	HR2-116	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™	Hampton Research	HR2-128	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen	Molecular Dimensions Ltd	n/a	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1	Rigaku	1009536	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2	Rigaku	1009537	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1	JenaBioScience	CS-101L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2	JenaBioScience	CS-102L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3	JenaBioScience	CS-103L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4	JenaBioScience	CS-104L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5	JenaBioScience	CS-105L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6	JenaBioScience	CS-106L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7	JenaBioScience	CS-107L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8	JenaBioScience	CS-108L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9	JenaBioScience	CS-109L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10	JenaBioScience	CS-110L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™	Hampton Research	HR2-144	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1	Hampton Research	HR2-107	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2	Hampton Research	HR2-109	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-21	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-25	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite	Qiagen	130720	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen	JenaBioScience	CS-127	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen	JenaBioScience	CS-128	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-91	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-98	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen	Hampton Research	HR2-138	Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-93-500	Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-100	Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-93	Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-100-FX	Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen	Molecular Dimensions Ltd	n/a	48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate	Swissci	MRC 96T-UVP	Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80  µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate  ('MAXI plate')	Swissci	MMX01-UVP	Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200  µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal	Swissci	n/a	Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape	Hampton Research	HR4-50	3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet	Beckman Coulter	538619	Used to reseal additive screens.
Ink cartridge	Markem-Imaje	9651	System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge	Markem-Imaje	8652	System 1 (inkjet printer).
50 µL tips	Hamilton	235947	System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container	Hamilton	194052	Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.
PCR plate	Thermo Scientific™	AB-2150	System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes	TTP Labtech	4150-03020	Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block	TTP Labtech	3019-05013	SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip	TTP Labtech	4150-03110	Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip	TTP Labtech	4150-03100	Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes	TTP Labtech	4150-07100	Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs	TTP Labtech	4150-07103	Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker	CamLab Limited	n/a	Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer	TTP Labtech	3121-01015	MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.