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Résumé

Une méthode pour créer et diffuser différentes niches humanisées de moelle osseuse chez la souris est présentée. Sur la base de la niche de soutien créée par les cellules mésenchymateuses humaines, l'addition de cellules endothéliales humaines induit la formation de vaisseaux humains, tandis que l'addition de rhBMP-2 induit la formation de tissu osseux matriciel humain-souris chimère.

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC) résident dans le niche de moelle osseuse (BM), un réseau complexe et multifactorielle de composants produisant des cytokines, des facteurs de croissance et une matrice extracellulaire. La capacité des HSC à rester tranquille, à se renouveler ou à se différencier, à acquérir des mutations et à devenir malignes dépend des interactions complexes qu'elles établissent avec différents composants stromaux. Pour observer la diaphonie entre les HSC humains et la niche BM humaine dans des conditions physiologiques et pathologiques, nous avons conçu un protocole pour modeler ectopiquement et imaginer un niche BM humanisé chez des souris immunodéficientes. Nous montrons que l'utilisation de différents composants cellulaires permet la formation de structures humanisées et la possibilité de soutenir la greffe de hématopoïétique humaine à long terme. En utilisant la microscopie à deux photons, nous pouvons vivre ces images in situ à la résolution d'une seule cellule, fournissant un nouvel outil puissant pour la caractérisation fonctionnelle du BM humainIcroenvironnement et son rôle dans la régulation de l'hématopoïèse normale et maligne.

Introduction

Les décisions relatives au sort cellulaire observées dans les compartiments de cellules souches sont étroitement réglementées par des facteurs intrinsèques et extrinsèques. En particulier, il est maintenant largement reconnu que le microenvironnement du BM joue un rôle fondamental dans le contrôle de l'interruption des HSC d'un état de repos à un état actif, ainsi que dans leur décision de devenir auto-renouvellement ou de différenciation 1 . De plus, des résultats récents indiquent que les tumeurs malignes hématologiques affectent la fonction du microenvironnement du BM, indiquant l'existence d'une diaphonie active entre les deux compartiments 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Malgré les progrès récents, de nombreuses questions clés restent à propos de la façon dont l'activité de composants de niche BM spécifiques contribuent au comportement de HSC et à la transformation maligne.

Le microenvironnement du BM est très hétérogène Mélange énorme et complexe de différents types de cellules, chacun avec des fonctions spécialisées. L'abondante composante endothéliale (EC) et vasculaire régulent le renouvellement des nutriments et des métabolites, l'entrée et la sortie de différentes cellules vers et à partir du BM, et plusieurs fonctions HSC 7 , 8 . Les cellules stromales mésenchymateuses (MSC), une population hétérogène de cellules souches indifférenciées et de progéniteurs engagés dans trois lignées différentes ( c'est-à-dire osteogènes, chondrogéniques et adipogènes) constituent une autre composante fondamentale de la niche BM. Ces MSC localisent les deux dans les zones centrales du BM et à proximité de la région endosteal. Ils peuvent être associés à des structures vasculaires et sont impliqués dans la régulation de la fonction HSC 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .

De nombreux rapports suggèrent que les HSC résident dans divers sites définis dans la moelle et que leur fonction dépend de leur localisation précise. La plupart des connaissances actuelles concernant les HSC et leur interaction avec le microenvironnement BM découlent des études murines 1 . L'utilisation de modèles de xénogreffe a étendu cette connaissance aux HSC normaux et malins humains, se greffant dans le BM murin des souris immunodéficientes 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Bien que cela représente un modèle valide, il présente encore de nombreux défis, comme la nécessité de conditionner la souris destinataire dans la plupart des cas pour permettre l'homing humain et le greffage ou la barrière des espèces transversales et son influence mal comprise sur les interactions cellule-cellule et les fonctions.

L'utilisation d'anticorps neutralisants et de souris génétiquement modifiées, ainsi que la xénotransplantation, a contribué à mettre en évidence le dialogue complexe que les HSC humains établissent avec leur microenvironnement. L'introduction et le développement de la microscopie intracommunale à deux photons confocales ont fait de ces études un pas en avant, ce qui permet une imagerie directe, haute résolution et dynamique de la moelle osseuse 19 , 20 , 21 , 22 et fournit un outil puissant pour la fonctionnelle La caractérisation du microenvironnement BM et son rôle dans la régulation de la fonction HSC. Afin de contourner certains des problèmes posés dans les modèles classiques de xénotransplantation, le concept d'ingénierie d'une structure BM humanisée a été mis en évidence. La fusion des biomatériaux et des concepts d'implantation cellulaire, les rapports ont montré la faisabilité d'imiter l'os humainFlèche microenvironnement dans les régions hétérotopiques 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Cela ouvre la possibilité d'utiliser la bio-ingénierie dans les modèles de souris pour étudier l'hématopoïèse humaine et maligne 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , la tumorigénèse et les métastases 40 , 41 , 42 , 43 , 44 .

Sur la base d'une expérience antérieure dans l'ingénierie des tissus osseux et l'imagerie in vivo 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , nous décrivons un protocole pour les tissus de BM bio-ingénieurs et bio-organotypes d'image vivante. Ces structures proviennent de l'implantation de cellules stromales dérivées de BM humaines dans des échafaudages à base de collagène greffés par voie sous-cutanée dans des souris immunodéficientes. Dans un rapport précédent, nous avons démontré que les CSM humains assurent la formation d'un micro-environnement humain adéquat pour la greffe de cellules hématopoïétiques humaines 45 . En outre, nous décrivons ici comment la co-implantation d'un autre composant cellulaire BM humainS, telles que les cellules endothéliales humaines (hEC) et / ou les cytokines importantes pour la formation osseuse ( p. Ex ., HBMP2), coopèrent avec les HMSC pour générer différents microenvironnements humanisés, qui peuvent être imagés en direct sur place .

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées sous PPL 70/8904, approuvées par le Home Office du Royaume-Uni et conformément aux lignes directrices du Cancer Research UK. L'utilisation du sang de cordon ombilical humain (UCB) et des échantillons primaires de leucémie myéloïde aiguë humaine (AML) a été approuvée par le comité d'éthique d'East London après avoir reçu son consentement et a été effectuée conformément à la déclaration d'Helsinki.

1. Bio-ingénierie Échafaudage à base de collagène avec cellules humaines et hématopoïétiques et stromales

NOTE: L'intégralité du protocole doit être effectuée dans des conditions stériles et avec un matériau stérile. Le milieu de culture cellulaire 1 correspond au milieu hMSC (MEM-α, P / S et 10% hMSC-FBS); Le milieu de culture cellulaire 2 correspond au milieu EC (M199, 20% FBS, P / S, HEPES 10 mM, 50 μg / ml d'héparine, 2 mM de glutamine et 50 μg / mL ECGS) et le milieu de culture cellulaire 3 correspond au milieu cellulaire hématopoïétique (H5100 Et P / S).

  1. Préparer le sang du cordon ombilical mLes cellules ononucléaires (CB-MNC) ou la LBC primaire (MTC de la moelle osseuse ou du sang périphérique) en utilisant un gradient de densité Ficoll-Paque, selon des protocoles bien établis 53 .
    1. Pour AML, épuiser les cellules T en utilisant l'anticorps OKT.3. Incuber 4 μg de OKT.3 par 1 x 10 6 MLC AML pendant 30 min à température ambiante avant de se laver les cellules dans du PBS. Si nécessaire, cryopréserver les MNC dans FBS avec 10% de DMSO à 2 x 10 8 cellules par ml.
  2. Préparer les cultures de cellules HMSC (milieu de culture 1) et EC (milieu de culture 2). Plaque de cellules HMSC (voir la Table des Matériaux ) sur des flacons de culture cellulaire réguliers en milieu hMSC. Plaques EC (voir le tableau des matériaux ) sur les surfaces revêtues de collagène 1 en milieu CE.
  3. À 85-90% de confluence cellulaire, retirer le milieu, laver deux fois avec du PBS et ajouter une solution de trypsine-EDTA (20 μL par cm 2 ).
    1. Après 5 minutes, vérifiez que les cellules sont détachées. Récupérer les cellules en diluant 1:3 avec un milieu de culture cellulaire. Centrifuger à 300 xg pendant 5 min et ré-suspendre dans le milieu correspondant pour chaque type de cellule et compter les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
    2. Utiliser des cellules à 2 x 10 6 - 10 7 cellules par ml. Si les deux types de cellules doivent être utilisés ensemble, mélanger les suspensions hMSC et EC dans un rapport 1: 1.
  4. Transférer la suspension cellulaire dans une seringue à insuline.
  5. À l'aide d'un scalpel, couper l'échafaudage stérile de la gélatine stérilisée ( p. Ex ., Gelfoam) (20 mm x 60 mm x 7 mm) dans 24 pièces de taille similaire (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, figures 1A et B ).
  6. Reconstituer les échafaudages de gélatine par immersion dans du PBS (5 min).
  7. Un à un, metz doucement les échafaudages sur un tissu stérile pour éliminer l'excès de PBS. Transférer les échafauds à un puits d'une plaque à 24 puits (surface de fixation ultra-faible) et en utilisant la seringue pour injecter 50 ul contenant 10 5 - 10 6 cellules (hMSC alUn ou en combinaison avec hEC; Figure 1C ).
  8. Répétez l'étape 1.7 avec chaque échafaudage jusqu'à ce que tous les échafaudages nécessaires soient ensemencés avec des cellules stromales.
  9. Incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C et CO 2 5%).
  10. Remplissez chaque puits avec 3 mL de milieu de culture cellulaire 1 ( Figure 1D ) et renvoyez les échafaudages dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C et CO 2 5%) pour une incubation durant la nuit. Utiliser le milieu de culture cellulaire 2 si les EC sont utilisés dans les échafaudages.
  11. Découpez les CB-MNC et isolez les cellules CD34 + à partir d'un protocole de kit de section CD34 + approprié. Suspendre les cellules CD34 + sélectionnées dans le moyen 3 et les compter dans une chambre Neubauer.
    NOTE: Ici, les cellules ont été utilisées à une concentration de 2 x 10 6 cellules par ml.
    1. Si des échantillons primaires dérivés du patient AML sont utilisés, décongeler les cellules, les diluer 1:10 dans FBS, les centrifuger pendant 5 min à 300Xg, remet en suspension les cellules dans du PBS-2% de FBS, ajoute un anticorps anti-CD3 humain (2 à 4 μg pour 10 6 cellules) et incube à température ambiante pendant 30 minutes. Centrifuger pendant 5 min à 300 xg et ré-endiguer dans un milieu cellulaire hématopoïétique complété par des cytokines (20 ng / mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), 20 ng / mL de IL-3 et 20 ng / mL de thrombopoïétine (TPO)). .
  12. Répétez les étapes 1.7 à 1.9, mais dans ce cas, prenez 1 x 10 5 cellules hématopoïétiques humaines au lieu des composants stromaux, comme ci-dessus.
    1. Remplir le puits avec 3 mL de milieu de culture cellulaire 3 ( Figure 1D ) et renvoyer les échafaudages dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C et CO 2 5%) pour une incubation durant la nuit. Utilisez un mélange 1: 1 de milieux de culture cellulaire 2 et 3 Si les EC sont utilisés dans les échafaudages.
  13. Pour les échafaudages porteurs morphogénétiques de l'os humain humain recombinant protéinés-2 (rhBMP-2), collez doucement les échafaudages un à un sur un tissu stérile pour enlever l'excès de PBS. Transférez les échafaudages sur un puits d'une plaque de 96 puits ( Figure 1E ) et ajoutez 5 μL de rhBMP-2, couvrant complètement l'échafaudage.
    1. Ajouter 20 μL de thrombine suivie de 20 μL de fibrinogène, couvrant complètement l'échafaudage à chaque fois ( figure 1F ). Répétez la procédure pour chaque échafaudage jusqu'à ce que tous les échafaudages nécessaires soient traités et ensuite incuber pendant 5 à 10 min à 37 ° C. Vérifiez si la coagulation s'est formée avec succès.

2. Implantation chirurgicale d'échafaudages bioengénés

NOTE: Ici, des souris NSG de sexe masculin ou féminin de 6 à 12 semaines ont été utilisées. Comme les animaux sont immunodéficients, toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Les étapes 2.10 à 2.13 sont liées aux stratégies de survie et aux soins post-chirurgicaux.

  1. 60 - 120 min avant la chirurgie, administrer par voie sous-cutanée un analgésique (carprofène, 5 mg / kg de poids corporel / souris).
  2. Induire l'anesthésie dans une chambre avec 0,5% d'isoflurane et 2 L / min O 2 . Les souris devraient être surveillées en continu pendant la procédure. Transférer l'animal dans la zone chirurgicale en position exposée afin d'avoir un accès facile à l'arrière. Gardez l'animal sous anesthésie en utilisant un cône de nez fournissant 1,5% d'isoflurane et 2 L / min O 2 . Gardez la souris sous anesthésie pendant la procédure chirurgicale et vérifiez fréquemment l'état de l'animal.
  3. Alors qu'il est sous anesthésie, utilisez un gel ophtalmique sur les yeux de la souris pour éviter la sécheresse et maintenez la souris à 37 ° C.
  4. Raser la zone chirurgicale à l'arrière de la souris à l'aide d'un coupe-bord électrique. Pour stériliser la peau, tremper une pointe de coton dans de la clorexidine diluée (diluée à 1:10 dans PBS) et utiliser cette pointe pour nettoyer la surface de la peau. Répétez cette procédure deux fois.
  5. En utilisant des pinces stériles et un scalpel (ou des ciseaux), faites une incision complète de la peau de 0,5 à 0,7 cm avant-postérieure. Utilisez la pince inséréeSous le tissu sous-cutané pour faire une poche.
  6. Insérez l'échafaudage par voie sous-cutanée, en vous assurant qu'il soit placé profondément dans la poche ( Figure 1G et H ). Fermez l'incision avec de la colle chirurgicale ( Figure 1I et J ).
  7. Pour traiter la douleur post-chirurgicale, administrer par voie sous-cutanée de la buprénorphine (0,1 mg / kg de poids corporel).
  8. Pendant la récupération, placez l'animal sur son côté dans une cage préchauffée et surveillez la récupération jusqu'à ce que le comportement normal soit observé.
  9. Diluer le médicament contre la douleur dans de l'eau (carprofène, 0,1 mg / ml d'eau) et le fournir aux animaux comme eau potable pendant 4 jours après la chirurgie.
  10. Vérifiez fréquemment l'animal et la plaie pendant la période post-chirurgie de 48 heures pour des effets indésirables possibles.

3. Traitements de souris, euthanasie et récupération d'échantillon pour l'imagerie

NOTE: L'analyse des échafaudages est réalisée entre8 et 24 semaines après l'implantation.

  1. 60 min avant l'imagerie, garder la souris implantée dans une boîte de chauffage à 37 ° C et administrer par voie intraveineuse 100 μL d'immunoglobuline humaine pour bloquer des sites non spécifiques.
  2. 30 min avant l'imagerie, administrer par voie intraveineuse 10 ug (par souris) d'anticorps spécifiques pour étiqueter les cellules d'intérêt.
  3. 5 min avant l'imagerie, administrer par voie intraveineuse 15 μL (dilué dans 100 μL de PBS) d'un agent de pool de vasque (655-VPA) marqué au fluorophore à 655 nm pour visualiser les structures vasculaires.
  4. Euthanaser la souris par dislocation cervicale.
  5. À l'aide de ciseaux tranchants, faites une incision longitudinale de la peau à l'arrière de la souris, près du site d'implantation d'origine.
  6. Avec l'aide de pincettes et de ciseaux, séparez soigneusement la peau de la poche sous-cutanée où l'échafaudage a été implanté.
  7. Tenir l'échafaudage avec une pincette et l'expliquer délicatement de la peau en coupant la membrane résiduelle aEt un tissu entourant l'échafaudage à l'aide de ciseaux. Voir les exemples d'échafaudages à récupérer à la figure 2 .
  8. Fixez l'échafaudage avec une colle adhésive à action rapide à une plaque d'imagerie (une boîte à pétri de 35 mm x 10 mm) et remplissez une solution saline (PBS) à température ambiante.
  9. Pour les échafaudages BMP, avant de remplir la plaque avec du PBS, utiliser une microdrive chirurgicale pour diluer la surface osseuse sous microscope microchirurgical; Cela permet la visualisation de fluorophores et la capture d'image haute résolution. Utilisez les bavures 1,2 ou 1,6 mm, selon la taille de l'échafaudage.
    REMARQUE: L'utilisateur se rend compte de la quantité de forage en fonction de l'épaisseur de l'os. En général, lorsque les échafaudages BMP sont vascularisés, l'os changera légèrement de couleur et devient plus rouge lors de l'approche de l'épaisseur correcte pour l'imagerie.
  10. Insérez la plaque sur le stade du microscope confocal.

4. Imagerie en direct utilisant Microsc à deux photonsOpy

REMARQUE: Lors de l'utilisation de détecteurs non-détartrés (NDD), utilisez toujours le curseur NDD pour l'imagerie pour diriger la fluorescence vers NDD. La configuration du microscope est fournie à la figure 3 .

  1. Allumez le microscope et l'ordinateur, lancez le logiciel en cliquant sur "Démarrer le système" et accédez au mode "Acquisition".
  2. Cochez la case "Afficher les outils manuels". Dans le menu "Laser", on "met en marche" le laser à deux photons et lui permet de se réchauffer et de se stabiliser.
  3. Dans le menu "Imaging Setup", activez simultanément "Channel Mode" et "Switch track every Frame". Dans le menu «Light Path», sélectionnez «Non Descanché» et «Diviseur de faisceau principal MBS 760+». Cochez pour activer les quatre NDD et définissez la configuration comme illustré à la Figure 3 .
    REMARQUE: avec cette configuration, le signal de collagène provenant des structures osseuses (secLa génération harmonique secondaire, SHG) est recueillie à 380 - 485 nm, cellules endothéliales humaines FITC-hCD31 + et cellules hématopoïétiques humaines AF488-HCD45 + à 500-550 nm et 655-VPA à 640-190 nm.
  4. Dans le menu "Chaînes", réglez la "longueur d'onde laser" à 890 nm et la puissance à 50%. Réglez le "Gain (Master)" sur 500-600, "Digital Offset" sur 0, et "Digital Gain" sur 15 pour chaque canal. Réglez ces valeurs une fois l'acquisition démarrée.
  5. En mode "Acquisition", configurez les paramètres requis pour obtenir des images haute résolution sans endommager le tissu et blanchir les fluorophores. Réglez "Mode de numérisation" sur "Cadre", "Taille du cadre" sur "x512 y512," Étape de ligne "sur 1," Vitesse "sur 9," Numéro de moyenne "sur 8," Profondeur de bit "vers" 8 bits "," Mode "à" ligne "," Direction "à" bidirectionnel "et" Méthode "pour" signifier ".
    1. Définir le "ZoOm "à 1 pour la numérisation initiale de l'image, et l'augmenter si nécessaire pour se concentrer sur des zones particulières.
  6. Placez la plaque contenant l'échafaudage sur le stade du microscope sous la lentille d'immersion eau 20 X, 1,0 NA et abaissez l'objectif jusqu'à ce qu'il touche la solution saline. Réglez l'objectif de l'objectif sur l'échafaudage à l'aide des oculaires au microscope, en utilisant une lampe comme source lumineuse.
  7. Activez le menu "Z-stack", sélectionnez la fonction "First / Last" et réglez l'intervalle requis entre deux tranches secondaires ( p. Ex., Pile Z de 2 μm). Gardez les intervalles constants dans la pile Z.
  8. Sélectionnez «Live» pour imaginer une analyse en direct de l'échantillon et ajuster le «gain numérique» et le «décalage numérique» pour une exposition optimale. Pour visualiser plusieurs chaînes simultanément, sélectionnez la fonction "Split".
  9. Dans le menu "Stage", en mode "Live", numérisez l'image et "Mark" des régions de interEst (ROI), comme la localisation des cellules hématopoïétiques humaines et des structures vasculaires. Lorsque la numérisation de l'échantillon est terminée, passez au premier ROI pour commencer l'imagerie.
  10. En mode "Live", définissez le haut et le bas de la pile 3D Z entourant la zone d'intérêt en utilisant les fonctions "Set first" et "Set last". Une fois terminé, placez le centre, "C." Commencez l'acquisition du ROI avec le bouton "start experiment". Voir les exemples d'images dans la Figure 4 , la Figure 5 et la Figure 6 .
  11. Une fois l'acquisition terminée, enregistrez l'image dans le dossier désigné. Passez au prochain ROI et répétez l'étape 4.10. Une fois l'expérience terminée, retirez la plaque d'imagerie du microscope, détachez soigneusement l'échantillon de la plaque et nettoyez toute colle résiduelle.
  12. Préparez l'échantillon pour la prochaine technique d'analyse.

5. Procédé d'échantillonnageG pour l'histologie et l'immunocoloration

REMARQUE: Les échantillons sont traités selon le protocole décrit dans les techniques de laboratoire général de JoVE 54, qui décrivent les processus de fixation, d'encastrement et de découpe des échantillons. Les échantillons formant des ions devraient être traités pendant 7 jours dans un agent de décalcification à base d'EDTA entre les processus de fixation et d'encastrement. La solution de blocage / perméabilisation est un tampon de PBS pH 7,4 10 mM avec 1% de Triton X-100, 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 10% de sérum de chèvre normal (NGS).

  1. Mettez les tranches dans du xylène pendant 10 minutes), du xylène pendant 5 minutes, de l'éthanol à 100% pendant 5 minutes, de l'éthanol à 70% pendant 5 minutes, de l'éthanol à 50% pendant 5 minutes et de l'H 2 O pendant 5 minutes.
  2. Transférer les tranches à une solution de travail anti-antigène à base de citrate.
  3. Faire bouillir les tranches pendant 15 minutes et laisser refroidir à température ambiante.
  4. Laver les tranches dans une solution 10 mM PBS pH 7,4 avec 1% de Triton X-100 (5 min, 3 fois).
  5. Transférer le samÀ la solution de blocage / perméabilisation et incuber pendant 30 min.
  6. Ajouter un anticorps primaire dilué dans une solution de blocage / perméabilisation et incuber pendant une nuit à 4 ° C.
  7. Laver les tranches dans une solution 10 mM PBS pH 7,4 avec 1% de Triton X-100 (5 min, 3 fois).
  8. Ajouter un anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage / perméabilisation pendant 1 h dans l'obscurité à température ambiante.
  9. Laver avec H 2 O (5 min, 3 fois).
  10. Pour réduire la fluorescence d'arrière-plan, immerger les tranches au Soudan Solution de travail noire pendant 10 min, à l'obscurité et à température ambiante.
  11. Laver les tranches en H 2 O (5 min, 3 fois).
  12. Monter les tranches en utilisant un support fluorescent avec DAPI (0,5 μg / mL).
  13. Conservez les tranches à 4 ° C et vérifiez que le support de montage est sec avant de procéder à l'imagerie fluorescente. Voir les exemples d'images de la figure 7 .

Résultats

Sur la figure 1 , des images représentatives des processus d'ensemencement et d'implantation des cellules d'échafaudage sont représentées. Dans la figure 1C , notez que les cellules sont injectées directement dans l'échafaudage. Dans la figure 1G , notez qu'une incision est faite à l'arrière de la souris, où la poche sous-cutanée est créée et l'échafaudage est implanté. La figure 2 montre la morphologie brute des différents échafaudages implantés chez les souris NSG et récupérée après 8 semaines. Notez la légère vascularisation dans les échafaudages ensemencés par hMSC ( Figure 2A ). Le co-ensemencement des EC humains avec HMSC dans l'échafaudage permet la formation d'une vascularisation plus importante dans les échafaudages ( figure 2B ). Enfin, la présence de RhBMP-2 induit une formation osseuse. Les échafaudages récupérés sont plus importants dans ce cas, et ils sont constitués parRessemblant à un tissu dur dur.

La figure 3 montre la configuration de la configuration du canal sur le microscope pour l'imagerie en direct avec NDD (détails dans la légende de la figure). La figure 4 et la vidéo 1 montrent des cellules hématopoïétiques humaines dans des échafaudages revêtus de hMSC. Les échafaudages ont été expliqués 8 semaines après l'implantation et après l'inoculation intraveineuse de l'anticorps AF488-hCD45 et 655-VPA. Cette procédure permet la visualisation de cellules hématopoïétiques humaines implantées et la structure vasculaire par microscopie confocale à deux photons. Dans ce cas, les images montrent des vaisseaux sanguins (655-VPA) dans les échafaudages et le greffe à long terme de cellules hématopoïétiques humaines (AF488-hCD45) dans le parenchyme de l'échafaudage. La figure 5 et la vidéo 2 correspondent à des échafaudages humains semés avec des HEC et des HMSC. 8 semaines après la chirurgie, les échafaudages ont été expliqués après l'injection intraveineuseDe l'anticorps FITC-hCD31 et du 655-VPA, et des images ont été obtenues avec un microscope confocal à deux photons, comme mentionné précédemment. Les images montrent la participation des HEC dans la formation des vaisseaux dans l'échafaud, ce qui entraîne une vascularité chimère murine-humaine.

La figure 6A montre des données représentatives de l'approche utilisée pour stimuler la formation d'os dans les échafaudages MSC. À l'instar des figures précédentes, 8 semaines après l'implantation, l'inoculation intraveineuse de 655-VPA a été réalisée, des échafaudages ont été récupérés et des images ont été acquises avec microscopie confocale à deux photons. Les échafaudages stimulés par rhBMP-2 induisent la formation de tissu osseux, qui peuvent être visualisés en raison du SHG (couleur cyan dans les images) fourni par le calcium dans l'os. Les images fournies montrent également la formation de cavités et de tissus endostaux vascularisés, qui ressemblent fortement au tissu endosteal BM. À la figure 6B et Video 3 , les HEC ont été impliqués conjointement avec les HMSC. Les échafaudages ont été récupérés après l'inoculation par voie intraveineuse d'anticorps FITC-HCD31 et 655-VPA, et les images de microscopie confocale à deux photons montrent la participation des HEC dans la néovascularisation dans un échafaudage osseux.

La figure 7 montre des images représentatives d'histologie, une procédure effectuée pour corroborer les résultats décrits précédemment. Les images immunofluorescentes montrent la vasculature de la souris, les HEC, les HMSC et les cellules hématopoïétiques humaines greffées à long terme dans les structures de l'échafaudage. Les échafaudages récupérés à partir de souris ont été fixés et utilisés pour l'immunofluorescence. Dans les échafaudages osseux porteurs de RhBMP-2 ( Figure 7D- F ), notez la morphologie du tissu, ressemblant à la moelle osseuse mature avec du tissu adipeux. Dans cet échafaudage osseux, nous montrons que les HMSC sont des fibroblastes, ce qui indiquerait tIls contribuent aux tissus nouvellement formés comme cellules stromales. Nous montrons également l'expression du marqueur adipocytaire humain, ce qui indiquerait que les HMSC contribuent également à la formation de tissu adipeux.

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Figure 1. Images représentatives des processus d'ensilage et d'implantation cellulaire. A) Échafaudage initial et sa méthode de coupe à l'aide d'un scalpel. B) 24 pièces obtenues à partir de l'échafaudage initial. C) Méthode d'ensilage cellulaire d'échafaudage à l'aide d'une seringue. D) Échafaudages à cellules avec milieu de culture, prêts à être implantés. EF) Étapes spécifiques pour les échafaudages ostéotiques: E) échafaudage transféré sur une plaque à 96 puits, fond en U et F) image représentative de la méthode utilisée pour ajouter rhBMP2, thrombine et fibrinogène à l'échafaudage. GJ) Surgi Procédure d'implantation calcique sous anesthésie générale: G) plaie créée dans l'implantation de la peau et de l'échafaudage, H) méthode d'implantation et IJ) procédure de fermeture de la plaie à l'aide d'une colle chirurgicale. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2. Différents échafaudages récupérés à partir de souris. Des images représentatives des échafaudages MSC (à gauche), des échafaudages MSC + EC (milieu) et des échafaudages MSC + EC + BMP (à droite). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3. Configuration des canaux. La configuration du filtre à microscope est affichée. A) Il existe quatre modules détecteurs NDD: dans le premier module, il existe deux cubes de filtre; Les deuxième et troisième modules ont chacun un cube de filtre; Et le dernier module n'a pas de cube (non utilisé). Le premier tube photomultiplicateur (PMT) est pour le canal lointain (640 - 690 nm), reflétant les longueurs d'onde inférieures; Les suivants sont 380 - 485 nm, 500 - 550 nm et 555 - 625 nm (l'ordre est toujours de la plus petite à la plus haute longueur d'onde). B) Les émissions de fluorophores détectables avec les configurations ci-dessus (codées par couleur). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-7953
Figure 4. Échafaud MSC S Autoriser la formation d'une niche pour les cellules hématopoïétiques humaines. A) et B) reconstructions 3D de piles Z prélevées post-explant, après inoculation intraveineuse avec AF488-hCD45 (vert), pour étiqueter les cellules hématopoïétiques humaines et 655-VPA (magenta) m pour étiqueter le système vasculaire. Les barres d'échelle représentent 20 μm dans A et B (panneaux supérieurs) et 5 μm en B (panneaux inférieurs). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-8776
Vidéo 1. Les échafaudages MSC permettent la formation d'une niche pour les cellules hématopoïétiques humaines . Reconstruction 3D de cellules hématopoïétiques humaines (AF488-hCD45) associée à la vascularisation (655-VPA) dans l'échafaud MSC (structures de collagène: SHG, cyan). Chaque pile mesure 140 x 140 μm.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

figure-results-9436
Figure 5. Les EC humains participent à la formation des navires humanisés dans les échafaudages MSC. Reconstruction 3D de la vasculature (655-VPA) doublée par des EC d'origine humaine (FITC-hCD31) dans les échafaudages MSC + EC. Les barres d'échelle représentent 20 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-10039
Vidéo 2. Les EC humains participent à la formation des navires humanisés dans les échafaudages MSC. Reconstruction en 3D de CE humains (FITC-hCD31) bordant le va Sculature (655-VPA) dans les échafaudages MSC + EC. Chaque pile mesure 240 x 240 μm. Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

figure-results-10635
Figure 6. Les échafaudages transporteurs RhBMP-2 ont des surfaces osseuses et une vasculature humanisée semblable à la moelle osseuse. A) reconstruction 3D des échafaudages MSC + BMP montrant la formation de structures osseuses (SHG-cyan) et vasculature (655-VPA). Les barres d'échelle représentent 100 μm (gauche), 70 μm (milieu) et 50 μm (droite). B) Reconstruction 3D d'échafaudages MSC + EC + BMP montrant des vaisseaux humanisés (655-VPA) doublés de CE humains (FITC-hCD31). Les barres d'échelle représentent 50 μm (gauche) et 30 μm (moyen et droit).14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-11512
Vidéo 3. Les échafaudages transporteurs rhBMP-2 ont des surfaces osseuses et une vascularisation humanisée semblable à la moelle osseuse. Reconstruction 3D de l'échafaudage MSC + VERA + BMP (os: SHG, vaisseaux: 655-VPA, EC humaine: FITC-hCD31). Chaque pile mesure 600 x 600 μm. Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

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Figure 7. Images représentatives de l'immunofluorescence effectuée sur des échafaudages fixes. AF) Des études sur l'immunofluorescence réalisées pour localiser les cellules humaines implantées iN échafaudages. AC) Les échafaudages ont été implantés avec des HEC, des HMSC et des HHSC. DF) Échafaudages formant des ions implantés avec des HEC, HMSC et HHSCs. Les canaux de couleur sont les suivants: AD) EC humaine (HCD31) et structure vasculaire de souris (endomucine, ENDOM), BE) hMSC (hVimentin, hVIM) et cellules vasculaires de souris (endomucine, ENDOM), C) cellules hématopoïétiques humaines (HCD45) Et la vasculature de la souris (endomucine, ENDOM) et F) protéines liées à la différenciation adipeuse humaine (HADRP) et la vasculature de la souris (endomucine, ENDOM). Les barres d'échelle représentent 10 μm (A et C), 20 μm (B et E) et 40 (D et F) μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Signification à l'égard des méthodes existantes:

Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode pour générer différents microenvironnements humanisés chez la souris et pour visualiser leur architecture par microscopie à deux photons et histologie. Les données représentatives fournies montrent la faisabilité de l'approche, en utilisant différentes cellules stromales pour l'ingénierie des tissus humanisés. Le protocole a des applications spécifiques à l'étude des cellules hématopoïétiques humaines et des cellules dérivées de la moelle osseuse dans des conditions normales et pathologiques. Ces applications comprennent l'étude de l'évolution clonale, le dépistage de drogue et la diaphonie entre les HSC humains et les composants stromal. Dans le domaine émergent de l'ingénierie tissulaire, plusieurs approches alternatives ont été proposées. Les approches de la note comprennent le développement de structures de BM humanisées 3D in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 et le greffe orthotopique des échafaudages BM humanisés chez la souris 64 . Notre approche a l'avantage de combiner à la fois la complexité du système in vivo avec l'accessibilité anatomique facile du greffe de tissu humanisé.

Modifications et dépannage:

Une source de variabilité dans ce protocole peut être trouvée dans la sélection des cellules utilisées pour semer les échafaudages. Dans notre travail, nous avons utilisé les HMSC dérivés de BM. Cependant, des cellules mésenchymateuses peuvent être obtenues à partir de plusieurs tissus, ce qui peut montrer des propriétés distinctives selon l'origine. Par conséquent, l'utilisation de HMSC dérivés de différents organes peut être considérée. Cependant, leur capacité à former du tissu osseux in vivo devrait être testée avant utilisation dans cette pRotocol. Ce protocole utilise une source de cellules endothéliales humaines disponibles dans le commerce ( c. -à- d., HUVEC transduites par E4ORF1). Récemment, l'utilisation de cellules endothéliales spécifiques d'organe à des fins différentes a été rapportée 65 , 66 . En outre, l'utilisation des HEC primaires dérivés du BM pourrait représenter une amélioration intéressante du protocole. Par conséquent, l'utilisation de différentes sources de cellules endothéliales peut produire différents résultats in vivo .

Nous avons utilisé des souris réciproques immunogènes implanté par NSG pour favoriser l'implantation d'échafaudages humanisés et éviter le rejet des tissus. Nous n'excluons pas la possibilité d'utiliser ce protocole pour concevoir des tissus de moelle épitreux dans d'autres souches de souris. En effet, la rhBMP-2 peut induire une formation osseuse dans différents modèles de mammifères 47 , 48 , 49 , 50 , 52 . Cependant, les différences de viabilité cellulaire et de transplantation à long terme sont susceptibles d'être observées en utilisant différentes souches / modèles.

Le calendrier de la récupération de l'échafaudage peut également être flexible, selon le but final de l'expérience. Dans le protocole présenté, nous récupérons les échantillons à 8 - 12 semaines après l'implantation pour évaluer la greffe de hématopoiétes à long terme. Pour étudier les premières étapes de la formation de niche BM humaine ( par exemple, la formation de tissu ostéochondral 47 ou le développement vasculaire), différents points de temps peuvent être choisis.

La technique d'imagerie en direct que nous avons décrite dans ce protocole est indiquée pour l'imagerie à court terme des explants. L'utilisation d'une chambre équilibrée pour maintenir la température physiologique, la tension de l'oxygène et la concentration de CO 2 devrait être envisagée dans les cas d'imagerie à long terme, comme pour étudier les comportements de motilité.

Critical StEps dans le Protocole:

Parmi les défis liés au protocole, nous mettrons en évidence les compétences techniques requises pour certaines étapes. Les cellules mésenchymateuses et endothéliales devraient être utilisées à faible nombre de cellules; Sinon, ils ne seront pas en mesure de supporter le greffe de cellules hématopoïétiques humaines in vivo ou de participer à la vascularisation de novo et à la formation osseuse in vivo . Nous recommandons l'utilisation des HMSC et des HEC dans les passages 1 à 5. La préparation des échafaudages et les étapes d'ensemencement des cellules nécessitent des compétences basiques en culture cellulaire et la connaissance des propriétés des cellules spécifiques utilisées dans la procédure. Le protocole de chirurgie est assez simple mais nécessite une certaine pratique. La maintenance d'un environnement aseptique pour éviter la contamination des échafaudages implantés chez les souris immunodéficientes est cruciale pour assurer le succès de l'expérience. L'explant d'échantillon et l'imagerie en direct nécessitent une pratique chirurgicale (en particulier pour l'utilisation de la microdrill) et la connaissance de laSystème de microscope. Enfin, le traitement des échantillons et l'histologie nécessitent une connaissance de base des techniques à utiliser.

Limites de la technique:

L'approche que nous décrivons permet de visualiser des cellules hématopoïétiques humaines vivantes, semant un microenvironnement de moelle osseuse humanisé, avec des cellules endothéliales humaines formant des structures vasculaires et des cellules mésenchymateuses formant un espace osseux et osseux. Lorsque le tissu est formé in vivo , l'échafaudage final sera encore chimérique (humain et murin). Cette question devrait être prise en compte, car le tissu chimère peut ne pas imiter complètement la complexité et l'environnement de la moelle osseuse humaine.

Les échafaudages implantés ont une taille limitée (nous avons essayé un maximum de 6,6 x 7,5 x 7 mm) et, par conséquent, ils peuvent héberger un nombre limité de cellules pour la xénotransplantation. Le nombre absolu de cellules récupérées sera également limité; Ainsi, le nombre d'échafaudages implantés devraitÊtre calculé en fonction du nombre de cellules requises pour l'expérience.

L'application d'imagerie que nous avons décrite est particulièrement utile pour observer de grandes surfaces de tissus vivants à des profondeurs de 150 à 200 μm de la surface sans perturber l'architecture et endommager les cellules. Par conséquent, il ne permet pas la visualisation de l'ensemble de l'échafaudage. Si une analyse complète du tissu est nécessaire, les approches d'immunofluorescence standard seraient plus appropriées.

Applications futures:

La direction future de ce modèle de bio-ingénierie serait d'augmenter la complexité des composants humains dans le tissu. La connaissance et la caractérisation de la niche de l'homme humain ont progressé au cours des dernières années 67 et le protocole décrit pourrait être une plate-forme intéressante pour étudier la fonction de ces nouveaux composants cellulaires et des facteurs solubles, ainsi que leur rôle dans le soutien normal / maligneHSC.

En outre, la technique d'imagerie offre le potentiel d'imagerie intravitalisée des échafaudages dans des études longitudinales, ce qui nécessiterait des améliorations techniques dans l'imagerie des échafaudages chez des souris vivantes anesthésiées, avec une récupération post-chirurgicale. Cette approche nécessiterait des étapes supplémentaires et est actuellement à l'étude en laboratoire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions le personnel des installations principales de l'Institut Francis Crick (installations de recherche biologique, In Vivo Imaging et Histopathologie expérimentale) et Yolanda Saavedra-Torres et Mercedes Sanchez-Garzon, les vétérinaires à Crick et LRI, respectivement, pour leur précieuse aide. Nous remercions le Dr W. Grey de lire attentivement le manuscrit. DP a été soutenu par une bourse de recherche non clinique de l'EHA. Ce travail a été soutenu par l'Institut Francis Crick, qui reçoit son financement de base de Cancer Research UK (FC001045), du British Medical Research Council (FC001045) et de Welcome Trust (FC001045).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-PaqueGe Healthcare17-1440-03
Cd34 positive selection KitStemcell18056Store a 4°C.
MagnetStemcell18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3BioxcellBE0001-2Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. 
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)PeproTech200-03, 300-23 and 300-18For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100 μL of water and mix them. Add 200 μL, do alicuots of 45 μL and Store at -20 °C.
DMSOSigmaD4540
FBSLife technologies10270106Heat-inactivate at 56 °C during 30 min, do aliquots and freeze down. Warm in 37 °C water bath before use.
MEM-αInvitrogen32571-028Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Myelocult H5100corning5100Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
199Gibco41150-020Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivatedGibco12662-029Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
P/SSigma-AldrichP0781Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
ECGSMillipore02-102Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPESSigma-AldrichS1558-50MLStore at 4 °C.
HeparinSigma-AldrichH3149Store at 4 °C.
GlutamineGibco25030Store at -20 °C.
Collagen 1 coated cell culture platecorning354505
Trypsin-EDTA solutionThermo-Fisher25200056Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSCLonzaPT-2501Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. 
VeraVec HUVEC endothelial cellsAngiocrine biosciencehVera101Alternatively, other human endothelial cell source may be used.
Human hematopoietic cellsUmbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. 
Gelfoam, Size 12 - 7mmPfizer00009-0315-08Alternative supplier: Febelco
PBSThermo-Fisher10010023
Surgical materialMultipleSterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissuesHeat-sterilize paper tissues.
1 mL Syringe with needle of 25GTerumoSS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3473 or 3471
BMP2NoricumrhBMP-2Dilute at 5 mg/mL in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
ThrombinSigmaT8885Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
FibrinogenSigmaF3879Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20 °C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mmFalcon353001
U-Botton 96 well plateFalcon353077
NSG miceThe Jackson Laboratory5557NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
ChlorhexidineG9Dilute 1:10 before use
CarprofenPfizerRimadyl5 mg/kg of mouse
BuprenorphineAlstoeVetergesic0.1 mg/kg of mouse body weight
IsofluraneAbbottB506Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
TrimmerWellaContura HS61
Surgical glue3MVetbond
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gelNovartisViscotears Liquid Gel
Human Normal ImmunoglobulinGammaplex10g vial100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTrackerInvitrogenQ21021MPVessel-pooling agent. Administrate 15 mL/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45Biolegend304017100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31BD Pharmigen555445100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glueLoctiteSuper Glue
Micro-Drill KitIDEAL - Fisher ScientificNC9010016
Microsurgical microscopeNo specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLOZeissUpright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20X 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensationSpectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-AldrichHT501128
EthanolSigma-Aldrich32294
OsteosoftMillipore1.01728.1000
Polysine slicesThermo scientificJ2800AMNZ
Antigen unmasking solutionVectorH-3300Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100xSigma-AldrichT9284
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA96470Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS)Sigma-AldrichG9023Store at 4 °C.
Endomucin AntibodySanta Cruzsc-65495Store at 4 °C.
hVimentin antibodySanta Cruzsc-6260Store at 4 °C.
hCD31 antibodyDAKOM0823Store at 4 °C.
hCD45 antibodyDAKOM0701Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2)antibodies-onlineABIN283918Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodiesInvitrogenA11029 or A11005Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodiesInvitrogenA11037 or A11008Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodiesInvitrogenA11007 or A21247Store at 4 °C.
Sudan BlackSigmaS2380Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPISigmaD8417Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting mediaDakoS3023Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glassVWR631-0147

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