Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

Résumé

Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.

Résumé

Les modèles murins de la maladie sont indispensables à la recherche scientifique. Cependant, nombreux outils de diagnostic telles que l’endoscopie ou d’imagerie tomographique ne sont pas employés couramment dans des modèles animaux. Afficheurs expérimentales classiques reposent souvent sur des analyses post-mortem et ex vivo , qui empêchent les examens de suivi intra-individuelle et augmentent le nombre d’animaux d’étude nécessaires. Fluorescence induite par la tomographie permet l’évaluation non invasive, répétitive, quantitative tridimensionnelle des sondes fluorescentes. Il est très sensible et permet l’utilisation de fabricants de moléculaires, qui permet la détection spécifique et la caractérisation des cibles moléculaires distinctes. En particulier, les sondes ciblées représentent un outil innovant permettant d’analyser l’expression des gènes d’activation et de protéine dans l’inflammation, maladie auto-immune, infection, maladies vasculaires, la migration cellulaire, tumorigenèse, etc.. Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées sur cette technologie d’imagerie sophistiquée de in vivo de détection et de caractérisation de l’inflammation (c.-à-d., infiltration de macrophages F4/80-positif) dans un modèle murin largement utilisé de inflammation intestinale. Cette technique peut également être utilisée dans d’autres domaines de recherche, comme suivi de cellule ou des cellules souches immunitaire.

Introduction

Modèles animaux sont largement utilisés dans la recherche scientifique, et de nombreuses méthodes non invasives existent pour moniteur activité de la maladie et de la vitalité, tels que la quantification des changements de poids corporel ou l’analyse de sang, urine et les fèces. Cependant, ce sont uniquement les paramètres de substitution indirecte qui sont également sujettes à la variabilité interindividuelle. Ils doivent souvent être complétées par des analyses post-mortem du spécimen de tissu, ce qui empêche la série observation aux périodes répétitives et dirigent observation de physiologique ou pathologique traite in vivo. Des techniques d’imagerie sophistiquées de petits animaux ont émergé, y compris les traverses sectionnelle imagerie, imagerie optique et endoscopie, qui permet la visualisation directe de ces processus et permet également aux analyses répétitives du même animaux^{1 , 2 , 3}. en outre, la possibilité de surveiller continuellement divers États de la maladie chez le même animal peut diminuer le nombre d’animaux nécessaires, qui pourraient être souhaitables dans une perspective éthique animale.

Plusieurs techniques d’imagerie optiques existent pour l’imagerie de fluorescence in vivo . A l’origine, l’imagerie confocale a été employé pour étudier la surface et de subsurface événements fluorescent^4,5. Récemment, cependant, les systèmes tomographiques qui permettent des évaluations quantitatives dimensions des tissus ont été développés⁶. Ceci a été accompli grâce au développement de sondes fluorescentes qui émettent de la lumière dans le spectre de proche infrarouge (NIR), offrant la faible absorption des détecteurs sensibles et sources de lumière monochromatique⁷. Alors que les techniques d’imagerie traditionnelle vues en coupe, comme la tomodensitométrie (TDM), imagerie de résonance magnétique (IRM) ou ultrasons (US), s’appuient principalement sur les paramètres physiques et visualiser la morphologie, imagerie optique peut fournir des renseignements supplémentaires sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’aide de fluorescence endogène ou exogène sondes⁸.

Progrès en biologie moléculaire ont permis de faciliter la génération de sondes moléculaires fluorescentes intelligentes et ciblées pour un nombre croissant de cibles. Par exemple, médiée par les récepteurs l’absorption et la distribution dans une zone cible donnée peuvent être visualisées à l’aide d’anticorps marqués dérivé carbocyanine⁹. L’abondance des anticorps disponibles, qui peuvent être étiquetés à fonctionner comme des traceurs spécifiques dans des endroits inaccessibles autrement du corps, donne un aperçu sans précédent à des processus moléculaires et cellulaires dans les modèles de la tumorigenèse et neurodégénératives, maladies cardiovasculaires, inflammatoires et immunologiques⁷.

Dans cette étude, nous décrivons l’utilisation de la fluorescence induite par la tomographie dans un modèle murin de colite. Dextran sulfate de sodium (DSS)-colite induite est un modèle de souris induite chimiquement standard d’inflammation intestinale qui ressemble à inflammatoires de l’intestin (IBD) la maladie¹⁰. Il est particulièrement utile évaluer la contribution du système immunitaire inné pour le développement de l’inflammation intestinale¹¹. Étant donné que le recrutement, l’activation et l’infiltration de monocytes et macrophages représentent des étapes cruciales dans la pathogenèse de l’EIA, visualisation de leur recrutement et de la cinétique d’infiltration sont essentiels à la surveillance, par exemple, l’effet de substances thérapeutiques potentielles dans un paramètre précliniques¹². Nous décrivons l’induction d’une colite DSS et démontrer la caractérisation induite par la tomographie de l’infiltration de macrophages dans la muqueuse de l’intestin en utilisant la fluorescence moléculaire tomographie pour la visualisation spécifique du marqueur de monocytes/macrophages F4/80 ¹³. en outre, nous illustrons les procédures auxiliaires et supplémentaires, tels que les anticorps étiquetage ; le montage expérimental ; et l’analyse et l’interprétation des images obtenues, en corrélation avec des lectures classiques tels que les indices de l’activité de la maladie, flow cytometry et analyse histologique et immunohistochimique. Nous discutons des limites de cette technique et les comparaisons avec les autres modalités d’imagerie.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, selon la loi allemande de Protection animale (Tierschutzgesetz).

1. les matériaux et montage expérimental

1. Soins aux animaux.
   1. Utilisez souris sexe - et appariés selon l’âge de n’importe quelle contrainte DSS-sensibles (p. ex., C57BL/6) à 20-25 g de poids corporel.
   2. Plan d’au moins cinq ou plusieurs souris par groupe expérimental et maison les souris selon les lignes directrices locales de soins aux animaux.
   3. Fournir un chow rongeur standard alimentation et autoclavé eau potable ad libitum.
   4. Enlever la nourriture standard et remplacez-le par chow exempt de luzerne au moins trois jours avant l’analyse pour réduire endoluminal auto-fluorescence.
2. Induction d’une colite aiguë induite par le DSS.
   1. Dissoudre 2 g de DSS (poids moléculaire ~ 40 000 Da) dans 100 mL de l’eau potable autoclavé pour obtenir un 2 % (solution w/v).
   2. Remplir l’alimentation boire des souris exclusivement avec la solution DSS et estimer les 5 mL de liquide par souris par jour. Fournir l’eau potable même sans DSS au contrôle souris¹⁰.
      NOTE : Surveiller les souris tous les jours jusqu'à la fin de l’expérience. Euthanasier les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids corporel initial ou qui deviennent moribonds (c.-à-d., constamment penché posture, mouvement, une respiration, dressés nettement manteau) conformément aux directives applicables locales sur animal protection sociale.
3. Préparation de la fluorescence induite par la tomographie.
   1. L’anticorps désiré (par exemple, rat anti-souris F4/80) avec de la teinture de la fluorescence de l’étiquette (par exemple, Cyanine7, λ_excitation: 750 nm, λ_émission: 776 nm) tel que décrit dans le protocole du fabricant. Dialyser anticorps purifiés dans une membrane de dialyse approprié (taille des pores < 50-100 kDa) contre 1 L de chlorure de sodium 0.15 M au moins 2 heures ou toute une nuit.
      1. Transférer l’anticorps dans 1 L de 0,1 M NaHCO₃ et dialyser pendant au moins 2 h.
      2. Dissoudre la quantité nécessaire de colorant fluorescent dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) (10,8 mg/µL d’anticorps) et l’ajouter à la solution d’anticorps. Utiliser le colorant fluorescent en excès molaire 20 fois pour atteindre un ratio de colorant-à-protéine de 1:3.
      3. Incuber dans l’obscurité à 4 ° C pendant 1 h. éliminer les anticorps non étiqueté en dialyse contre 1 L de 0,15 M de sodium ou en utilisant une colonne de dessalement PD-10 et résoudre dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour in vivo de l’application.
      4. Déterminer la concentration en anticorps final et le ratio étiquetage par spectrophotométrie.
      5. Mesurer la concentration de protéine à une absorption de 250-330 nm et envisager une absorption supplémentaire de la teinture. Corriger le maximum d’absorption à 280 nm (protéine) de 11 % de l’absorption maximale à 750 nm (prochaine étape) pour l’étiquetage des Cyanine7.
      6. Mesurer une dilution du composé (typiquement 01:10) à 250-800 nm et extraire la concentration de Cyanine7 à 750 nm.
      7. Déterminer le ratio de colorant-à-protéine comme : colorant/anticorps = absorption maximale à 750 nm / 200 000 / (maximum d’absorption à 280 nm - 0,11 x maximum d’absorption à 750 nm) / 170 000.
      8. Conserver la solution d’anticorps à 4 ° C et protéger de la lumière pour éviter le blanchiment avant l’injection.
   2. Charger le volume de solution d’anticorps nécessaire dans une seringue stérile juste avant l’injection et le bouclier de lumière, jusqu'à ce qu’il est utilisé.
   3. Déterminer le moment optimal de l’injection de la sonde et la procédure de numérisation, selon pharmacocinétique de traceur.
   4. Anesthésier les souris à l’aide de 1,5 à 2,5 % par inhalation isoflurane en oxygène ou placer en toute sécurité dans une drisse dédié pour l’injection dans la veine queue des anticorps marqués.
   5. Pour les anticorps pleine longueur, injecter l’anticorps marqué au moins 24 h avant l’analyse, par exemple pour anti-souris F4/80 macrophage visualisation dans la colite murine. Injecter des souris par voie intraveineuse (i.v.) par l’intermédiaire de la queue de la veine avec des anticorps marqués d’un montant correspondant à 2,0 nmol de colorant.
   6. Utilisation tout aussi imprécises anticorps marqués (p. ex. rat IgG ou un autre isotype correspondant à l’héritage de l’anticorps primaire) comme un contrôle d’isotype à des doses équivalentes à celles de la sonde spécifique.
      Remarque : Les résultats de in vivo analyse après que injection du contrôle composé peut servir de référence pour l’interprétation de la sonde spécifique de données d’imagerie.
   7. Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure animale dans la région abdominale afin de minimiser l’absorption et la réflexion de la lumière.

2. technique matériel

1. Utiliser un dispositif de tomographie de fluorescence induite par la vétérinaire (FMT) pour petits animaux de fluorescence ( Figure 4).
2. Créer une nouvelle étude pour chaque projet en cliquant sur la « nouvelle étude » bouton et inclure dans la description de l’étude les traceurs pertinentes, y compris les paramètres d’imagerie et les doses pour un usage ultérieur.
3. Dans cette étude, créer des groupes d’études selon le plan d’étude respectifs (par exemple, pour le traceur spécifique et non-spécifique isotype contrôle) en cliquant sur le « groupe de la nouvelle étude » bouton. Équiper de chaque groupe d’étude avec le nombre respectif des animaux.
4. Calibrer le système pour les constructions de traceur.
   1. Effectuer l’étalonnage pour chaque lot de traceurs pour normaliser la variation dans l’étiquetage et permettre des mesures quantitatives de données OI.
   2. Suivre les indications du fabricant de l’instrument pour l’étalonnage de chaque système individuel ; après la sélection de « ajouter un nouveau traceur », le système fournira un guide à travers les étapes. Fournir la dilution de la solution d’anticorps appliquée et de la concentration absolue calculée du traceur dans la sonde.
   3. Pour FMT, utilisez un tissu imitant le fantôme de caractéristiques définies de l’épaisseur et l’absorption (qui ressemble à tissu vital) et remplissez-le avec un volume spécifique de la solution d’anticorps utilisée. Mesurer sur le périphérique de la FMT.
      Remarque : Le système utilise la mesure de référence de la sonde fournie, ainsi que la concentration donnée, pour calculer les concentrations de marqueurs absolue de future in vivo des mesures.
5. Utiliser une cassette d’examen pouvant être chauffé à une température de 42 ° C.
   Remarque : Cela évite les souris ne se hypothermie lors de l’examen.

3. animaux anesthésie

1. Utiliser un flux continu de 1,5 à 2 % vol % isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) et 1,5 L O2/min à anesthésier les souris.

Utiliser systèmes spécialement conçus par inhalation pour l’anesthésie rongeur (vaporisateur isoflurane) pour contrôler plus facilement la profondeur de l’anesthésie et pour minimiser l’exposition du personnel.

Placez votre souris dans la chambre étanche induction et allumez le vaporisateur isoflurane approvisionnement (100 % (v/v), vol 5 % d’oxygène, 3 L/min). Contrôler la souris jusqu'à ce qu’il est allongé et inconscient.

Placez-le dans la cassette de l’examen de tomographie, avec inhalation isoflurane continue via le cône de nez à une dose de 100 % v/v, 1,5 % en volume d’oxygène, 1,5 L/min pour réduire les artefacts de mouvement lors de l’interrogatoire. Pour les procédures qui dure plus de 5 min, s’appliquent onguent pour les yeux de la souris pour éviter les lésions cornéennes.

Évaluer la profondeur anesthésique en vérifiant les réflexes. Posez la souris sur son dos ; Si l’anesthésie est suffisante, la souris ne devrait pas tourner. Pincer la souris doucement entre ses orteils ; Si l’anesthésie est suffisante, la jambe ne sera pas retirée (stade de tolérance chirurgicale).

4. fluorescence induite par la tomographie Scan

NOTE : Adapter les informations suivantes, qui sont spécifiques au système FMT utilisé dans cette étude (voir la Table des matières) pour les appareils d’imagerie de fluorescence alternative réflectance ou systèmes FMT, selon les besoins.

1. Placez votre souris anesthésiée sur son dos dans la cassette de l’examen.
2. Effectuez la procédure de numérisation.
   1. Insérez la cassette dans le système d’imagerie et de fermer immédiatement pour assurer une anesthésie continue. Sélectionnez l’échantillon approprié dans le groupe d’étude créé précédemment. Sélectionnez le traceur administré dans le menu déroulant pour s’assurer que les valeurs de la concentration du traceur sont correctement calculés.
   2. Obtenir l’image de réflectance de fluorescence à la longueur d’onde appropriée (720 nm pour Cyanine7) pour la planification du scan et esquisse le domaine de l’analyse en cliquant sur le bouton « obtenir l’image ».
   3. Vérifier que le champ de balayage apparaît en surimpression sur l’image de réflectance de fluorescence. Ajuster à la zone d’intérêt (p. ex., du côlon ou l’abdomen), éviter air ou zones de fourrure restant. Selon la cible de l’image, définissez le nombre d’image points de données dans le domaine de la numérisation en choisissant de la grossière de moyenne et fine résolution de scan-champ dans le menu sur la droite.
      Remarque : N’oubliez pas qu’un champ d’analyse fine pourrait offrir meilleure résolution spatiale au prix d’un temps de balayage nettement plus longtemps.
   4. Démarrer l’acquisition de données/images à la longueur d’onde sélectionnée en cliquant sur « Rechercher ».
      NOTE : Le temps de scan pour une analyse moyenne-fine de l’abdomen entier sera autour de 5 min ; pendant ce temps, chaque point de données est allumé séparément par le laser d’excitation et la fluorescence qui en résulte est enregistrée.
   5. Retirez la cassette d’imagerie à la fin de l’analyse de l’animal et permettre à l’animal de récupérer entièrement avant de le placer dans la cage.
   6. Répéter le FMT si jugé nécessaire à divers moments au cours de l’expérience (par exemple, les jours 0, 5 et 9-10 (fin de l’expérience)), mais tenir compte de l’accumulation des anticorps dans le corps, augmentant ainsi le signal de fluorescence de fond.

5. après analyse

1. Placez la souris dans une cage séparée sur une serviette en papier sous une lampe de réchauffement de la planète rouge-lumière et contrôler la souris des signes d’inconfort ou de détresse jusqu'à la guérison complète. Replacez la souris dans sa cage respective lorsqu’il est pleinement éveillé.
2. Euthanasier la souris à la fin de l’expérience de la prestation de CO₂ à l’isolateur à une dose de 100 % (v/v), 100 % en volume et 3 L/min. Ne pas pré remplir la chambre avec le CO_2, comme une exposition soudaine à des concentrations élevées de CO₂ peut-être causer une détresse. Vérifier la mort après que la souris a cessé de respirer par un mode secondaire subséquent de l’euthanasie comme rapide dislocation cervicale.
3. Explantation du côlon par laparotomie abdominale et effectuer une analyse ex vivo du côlon explanté, comme cela est expliqué dans les étapes 4.2.1 - 4.2.4. Ouvrez chaque colon longitudinalement à l’aide de ciseaux chirurgicaux Metzenbaum et rincer avec du sérum physiologique avant de préparer pour une analyse plus approfondie.
4. Utiliser un scalpel pour couper un fragment de 0,5 cm dans le côlon distal et le placer immédiatement dans un tube cryogénique de 1,5 mL. Congelez-la en azote liquide et le magasin à-70 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure (par exemple,les mesures contre la myéloperoxydase (MPO)).
5. Utilisez un bâton en bois et retrousser le côlon restant ouvert longitudinalement de distale jusqu'à l’extrémité proximale, avec à l’extérieur la muqueuse (« technique de Swiss roll »), pour des analyses histologiques. Placer la préparation dans un fixateur (voir la Table des matières) et congeler à-80 ° C¹⁴.

6. interprétation et Reconstruction de données

1. Utilisez l’outil de reconstruction du logiciel d’imagerie respectif pour créer des cartes 3D de la distribution de fluorescence à partir des données brutes d’imagerie ; balayages sont automatiquement ajoutés à l’outil reconstruction, quand à la numérisation, la fonction « ajouter à la file d’attente de la reconstruction » est sélectionné.
   1. Dans le cas contraire, sélectionnez les scans dans le menu déroulant sous l’étude respective et groupe d’étude, cliquez-droit sur le scan et sélectionnez « Ajouter à la reconstruction ».
2. Pour une analyse ultérieure, charger un ensemble de données dans le logiciel d’analyse. Dans le menu déroulant dans la barre du haut, sélectionnez l’étude respective, puis sélectionnez le groupe d’étude et de l’animal dans le menu sur la droite ; tous les scans effectués pour cet animal seront montrés. Sélectionnez l’analyse correcte et cliquez sur « charger ».
   Remarque : La reconstruction 3D de la distribution du traceur s’affiche sur la gauche en surimpression de l’image de réflectance de fluorescence initialement acquis. Le modèle peut être pivoté et amplifié pour une analyse plus facile.
3. Identifier les foyers d’accumulation d’étiquette non spécifique (p. ex., vessie de foie ou de l’urine) sur des cartes 3D reconstituées et différencier des tissus cibles (p. ex., l’intestin ou l’intestin).
4. De la barre du haut, sélectionnez la forme ROI plus appropriée pour la cible. Tissu de cible d’étiquette en tant que région d’intérêt (ROI) en plaçant les outils de mesure respectifs dans le logiciel d’analyse ; le logiciel fournira une intensité de fluorescence pour le ROI, ainsi que (pico-) quantités molaires du traceur qui le scan a été étalonné pour.
5. Sélectionnez la quantité totale de traceur dans le retour sur investissement approprié, normalisée pour la taille ROI, comme l’équivalent plus approprié pour l’évaluation de l’activité de la maladie en corrélation avec l’infiltrat inflammatoire (histologie).
   Remarque : Autres caractéristiques du ROI peuvent être choisies si approprié comme représentant du modèle particulier.

7.Ex Vivo Analyses

1. L’hématoxyline et éosine coloration et immunofluorescence souillant.
   1. Déparaffiner sections en les plaçant dans 70 % d’éthanol (EtOH) pendant 2 min ; Rincer à l’eau distillée. Tache avec la solution de l’hématoxyline pendant 5 min et ensuite rincer à l’eau chaude du robinet pendant 10 min.
   2. Rincer à l’eau distillée, contre-colorant avec solution d’éosine pendant 2 minutes et rincer à nouveau avec de l’eau distillée.
   3. Lieu à 70 % EtOH, 96 % EtOH, 99 % EtOH et xylène (2 fois) de 2 min chacun pour déshydrater et effacer les sections. Monter avec le milieu de montage résineuse.
2. Immunofluorescence souillant.
   1. Utiliser les sections de tissus obtenus antérieurement (« Swiss roll ») pour immunofluorescence souillant et préparer des sections de cryo-coupe de 7 µm.
   2. Bloquer les sections colon-correction d’acétone et surgelés dans le sérum de rat de 5,0 % pendant 10 min et incuber pendant la nuit avec dilué (1/500 v/v) primaires de rat anti-souris F4/80 biotinylé. Laver trois fois les sections tampon Tris salin (SCT) et incuber avec streptavidine-FITC (au 1/100 v/v) dans PBS/BSA (0,1 % p/v) durant la nuit à 4 ° C.
   3. Laver les sections au SCT et tache au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1/1000 v/v) pour atteindre le contraste. Analyser les images de fluorescence sous un microscope confocal (voir la Table des matières, un grossissement de 40 x ; cube filtre N2.1 avec filtre d’excitation 515-560) et compter les cellules F4/80-positif par champ à haute puissance.
      Remarque : Pensez à utiliser les anticorps du même clone et du format lors de la combinaison en vivo FMT et post-mortem histologie analyses comme immunohistochemistry ou immunofluorescence souillant, selon le but visé. Pour la détection des macrophages F4/80-positive in vivo et ex vivo, différents formats ont été utilisés.
3. Mesures de MPO dans les échantillons du côlon.
   1. Utilisation fraîchement obtenue, préalablement rincé PBS des échantillons du côlon ou décongelé spécimen pour les mesures de la FTU. Peser tous les échantillons et homogénéiser les tissus dans le tampon de lyse fourni dans le test ELISA kit (voir la Table des matières) à un volume de 20 µL de tampon de lyse par milligramme de tissu.
   2. Laisser agir pendant 15 s (fréquence de sonication : 20 kHz, puissance : 70 W) et centrifuger les échantillons pendant 10 min à 200 x g et 4 ° C.
   3. Utiliser un ELISA commercial nécessaire (voir la Table des matières) selon la description de la fabrique. Effectuer l’essai en double.

Résultats

Évaluation de colite :

La colite induite par le DSS est un modèle murin induit chimiquement de l’inflammation intestinale qui ressemble à EIA humain et mène à la perte de poids, des saignements rectaux, ulcération superficielle et altération de la muqueuse dans des souris sensibles¹⁵. Il est particulièrement utile étudier la contribution du système immunitaire inné au dével...

Discussion

Bien que les techniques d’imagerie médicale ont rapidement évolué ces dernières années, nous sommes encore limités dans notre capacité à détecter des processus inflammatoires ou tumeurs, ainsi que d’autres maladies, dans leurs premiers stades de développement. Cependant, c’est crucial pour la croissance tumorale compréhension, invasion, ou développement de métastases et des processus cellulaires dans le développement de troubles inflammatoires et maladies dégénératives, cardiovasculaires et immunol...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Alfalfa-free diet	Harlan Laboritories, Madison, USA	2014
Bepanthen eye ointment	Bayer, Leverkusen, Germany	80469764
Dextran sulphate sodium (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
Eosin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 4382
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Germany	B506
Haematoxylin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	HHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek compound	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583	fixative for histological analyses
Phosphate buffered saline, PBS	Lonza, Verviers, Belgium	4629
Sodium Chloride 0,9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
Sodium bicarbonate powder	Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany	S5761
Standard diet	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Hemoccult (guaiac paper test)	Beckmann Coulter, Germany	3060
Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody	Serotec, Oxford, UK	MCA497B
Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg Germany	553125
Streptavidin-Alexa546	Molecular Probes, Darmstadt, Germany	S-11225	excitation/emission maximum:  556/573nm
Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC	Calteg, Burlingame, USA	R2b06
Purified anti-mouse F4/80 antibody	BioLegend, London, UK	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	D9542
FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	553104
FACS buffer	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	342003
Cy7 NHS Ester	GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany	K 6631B
Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody	BioLegend, London, UK	123127	ready to use labelled Antibodies (alternative)
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Waltham, USA	45-4801-80	ready to use labelled Antibodies (alternative)
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	67-68-5
Isoflurane	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	792632
Ethanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	64-17-5
Bovine Serum Albumins (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	A4612
Tris Buffered Saline Solution (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	SRE0032
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
FACS Calibur Flow Cytometry System	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
FMT 2000 In Vivo Imaging System	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	FMT2000
True Quant 3.1 Imaging Analysis Software	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	included in FMT2000
Leica DMLB Fluorescent Microscope	Leica,  35578 Wetzlar, Germany	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Germany	HD 2070	ultrasonic homogenizer
Disposable scalpel No 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z692395-10EA
Metzenbaum scissors 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany	22398330
luer lock syringe 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z248010
syringe needles	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z192368
Falcon Tube 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070