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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.

Abstract

Modelli murini di malattia sono indispensabili alla ricerca scientifica. Tuttavia, molti strumenti diagnostici quali l'endoscopia o formazione immagine tomografica non sono abitualmente impiegati nei modelli animali. Letture sperimentali convenzionali spesso si basano su analisi post-mortem ed ex vivo , che impediscono gli esami di follow-up intra-individuali e aumentano il numero di animali di studio necessari. Fluorescenza-mediata tomografia consente la valutazione non invasiva, ripetitiva, quantitativa e tridimensionale di sonde fluorescenti. È altamente sensibile e consente l'utilizzo di produttori di molecolare, che permette la rilevazione specifica e caratterizzazione di bersagli molecolari distinte. In particolare, sonde mirate rappresentano uno strumento innovativo per l'analisi di espressione genica della proteina e l'attivazione in infiammazione, malattia autoimmune, infezione, malattia vascolare, migrazione cellulare, tumorigenesi, ecc. In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate su questa sofisticata tecnologia di imaging per la rilevazione in vivo e la caratterizzazione di infiammazione (cioè, l'infiltrazione del macrofago di F4/80-positivo) in un modello murino ampiamente usato di infiammazione intestinale. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche in altre aree di ricerca, quali il rilevamento delle cellule o cellule staminali immune.

Introduzione

Modelli animali sono ampiamente utilizzati nella ricerca scientifica, ed esistono molte procedure non invasive per monitorare l'attività della malattia e vitalità, come la quantificazione delle variazioni di peso corporeo o l'analisi del sangue, delle urine e le feci. Tuttavia, questi sono solo i parametri di surrogati indiretti che sono anche soggetti a variabilità inter-individuale. Essi frequentemente devono essere accompagnate da analisi post-mortem del campione di tessuto, che impedisce l'osservazione seriale in momenti ripetitivi e diretta osservazione del fisiologico o patologico elabora in vivo. Sofisticate tecniche di imaging di piccoli animali sono emersi, tra cui croce componibile imaging, imaging ottico e l'endoscopia, che consente la visualizzazione diretta di questi processi e consente anche analisi ripetitivi della stessa animali1 , 2 , 3. Inoltre, la possibilità di monitorare in modo ripetitivo vari Stati di malattia nello stesso animale potrebbe diminuire il numero di animali necessari, che potrebbe essere desiderabile da un punto di vista etico degli animali.

Diverse tecniche di imaging ottici differenti esistono per in vivo imaging di fluorescenza. Originariamente, imaging confocale è stata impiegata per studiare la superficie e di sottosuolo eventi fluorescente4,5. Recentemente, tuttavia, tomografiche sistemi che consentono per le valutazioni quantitative del tessuto tridimensionale sono stati sviluppati6. Questo è stato compiuto attraverso lo sviluppo di sonde fluorescenti che emettono luce nello spettro infrarosso vicino (NIR), che offre a basso assorbimento, rivelatori sensibili e sorgenti di luce monocromatica7. Mentre le tecniche di imaging cross-sectioning tradizionali, come la tomografia computata (CT), la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) o ecografia (US), si basano principalmente su parametri fisici e visualizzare la morfologia, imaging ottico può fornire ulteriori informazioni sui processi molecolari sottostanti utilizzando endogene o esogene fluorescenti sonde8.

Progressi della biologia molecolare hanno contribuito a facilitare la generazione di sonde molecolari fluorescenti e mirate per un crescente numero di bersagli. Ad esempio, ricevitore-ha mediato l'assorbimento e la distribuzione in una zona di destinazione specificata può essere visualizzati utilizzando carbocyanine derivato-etichettato anticorpi9. L'abbondanza di anticorpi disponibili, che possono essere etichettati come elementi traccianti specifici in zone altrimenti inaccessibili del corpo, fornisce approfondimenti senza precedenti di processi cellulari e molecolari in modelli di tumorigenesi e neurodegenerative, malattie cardiovascolari, immunologica e infiammatoria7.

In questo studio, descriviamo l'uso di tomografia fluorescenza-mediata in un modello murino di colite. Destrano solfato di sodio (DSS)-colite indotta è un modello standard del mouse chimicamente indotta di infiammazione intestinale simile infiammatorie intestinali (IBD) la malattia10. È particolarmente utile valutare il contributo del sistema immunitario innato allo sviluppo dell'intestino infiammazione11. Poiché il reclutamento, l'attivazione e infiltrazione di monociti e macrofagi rappresentano passaggi cruciali nella patogenesi delle IBD, visualizzazione della loro assunzione e la cinetica di infiltrazione sono essenziali per monitoraggio, ad esempio, l'effetto di sostanze terapeutiche potenziali in un' impostazione preclinici12. Descriviamo l'induzione di colite DSS e dimostrare la caratterizzazione tomografia-mediata di infiltrazione dei macrofagi nella mucosa dell'intestino usando la fluorescenza molecolare tomografia per la visualizzazione di specifica del marcatore del monocito/macrofago F4/80 13. Inoltre, ci illustrano le procedure ausiliari e supplementari, come l'etichettatura dell'anticorpo; la messa a punto sperimentale; e analisi e interpretazione delle immagini ottenute, in correlazione con le letture convenzionali quali gli indici di attività di malattia, flusso cytometry e l'analisi istologica e immunoistochimica. Discutiamo le limitazioni di questa tecnica e i confronti con altre modalità di formazione immagine.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen secondo la legge di protezione animale tedesco (Tierschutzgesetz).

1. materiali e messa a punto sperimentale

  1. Cura degli animali.
    1. Utilizzare topi di pari età e del sesso di qualsiasi ceppo DSS-sensibili (ad es., C57BL/6) a 20-25 g di peso corporeo.
    2. Pianificare almeno cinque o più topi per ogni gruppo sperimentale e casa i topi secondo linee guida locale cura degli animali.
    3. Fornire un cibo del roditore standard dieta e sterilizzato nell'autoclave acqua potabile ad libitum.
    4. Rimuovere il cibo standard e sostituirlo con chow privo di erba medica, almeno tre giorni prima della scansione per ridurre endoluminal auto-fluorescenza.
  2. Induzione di colite acuta indotta da DSS.
    1. Sciogliere 2 g di DSS (peso molecolare ~ 40.000 Da) in 100 mL di acqua potabile in autoclave per ottenere un 2% (p/v soluzione).
    2. Riempire il potabile dei topi esclusivamente con la soluzione DSS e stimare 5 mL di liquido per topo al giorno. Fornire la stessa acqua potabile senza DSS per i topi di controllo10.
      Nota: Monitorare i topi al giorno fino alla fine dell'esperimento. I topi che perdono più del 20% del loro peso corporeo iniziale o che diventano moribondi di eutanasia (vale a dire, con insistenza postura, riduzione del movimento curvo, lavorarono respirazione, marcatamente erigere cappotto) secondo le linee guida locali applicabili su animale benessere degli animali.
  3. Preparazione di tomografia fluorescenza-mediata.
    1. Etichettare l'anticorpo desiderato (ad es., ratto anti-topo F4/80) con la tintura di fluorescenza (ad es., Cyanine7, λeccitazione: 750 nm, λemissione: 776 nm) come descritto nel protocollo del produttore. Dializzare anticorpo purificato in una membrana di dialisi appropriato (dimensione dei pori < 50-100 kDa) contro 1 L di cloruro di sodio 0,15 M per almeno 2 ore o durante la notte.
      1. Trasferire l'anticorpo a 1 L di 0.1 M NaHCO3 e Dializzare per almeno 2 h.
      2. Sciogliere la quantità necessaria di tintura fluorescente in dimetilsolfossido (DMSO) (10,8 µ l/mg di anticorpo) e aggiungerlo alla soluzione di anticorpo. Utilizzare il colorante fluorescente in eccesso molare di 20 volte per ottenere un tintura / proteine in rapporto di 1:3.
      3. Incubare al buio a 4 ° C per 1 h. rimuovere anticorpo adenoide dialisi contro 1 L di sodio 0,15 M o utilizzando una colonna di dissalazione PD-10 e risolvere in tampone fosfato salino (PBS) per applicazione in vivo .
      4. Determinare la concentrazione di anticorpi finale e il rapporto d'etichettatura mediante spettrofotometria.
      5. Misurare la concentrazione di proteina ad un assorbimento di 250-330 nm e prendere in considerazione ulteriore assorbimento dal colorante. Correggere il massimo assorbimento a 280 nm (proteina) dell'11% dell'assorbimento massimo a 750 nm (passo successivo) per l'etichettatura di Cyanine7.
      6. Misurare una diluizione del composto (in genere 01:10) a 250-800 nm ed estrarre la concentrazione di Cyanine7 a 750 nm.
      7. Determinare il rapporto di tintura / proteine come: tintura/anticorpo = assorbimento massimo a 750 nm / 200.000 / (massimo assorbimento a 280 nm - 0,11 x max assorbimento a 750 nm) / 170.000.
      8. Mantenere la soluzione di anticorpo a 4 ° C e protetto da luce per evitare di imbianchimento prima dell'iniezione.
    2. Caricare il volume di soluzione di anticorpo necessarie in una siringa sterile immediatamente prima dell'iniezione e scudo dalla luce fino a quando non viene utilizzato.
    3. Determinare la tempistica ottima dell'iniezione di sonda e la procedura di scansione, a seconda della farmacocinetica di tracciante.
    4. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurane 1.5-2.5% per inalazione di ossigeno o metterli in modo sicuro in un dispositivo di ritenuta dedicato per l'iniezione della vena della coda degli anticorpi con etichettati.
    5. Per gli anticorpi del full-length, iniettare l'anticorpo marcato almeno 24 h prima della scansione, ad esempio per visualizzazione di macrofago F4/80 anti-topo nella colite murina. Iniettare topi per via endovenosa (i.v.) tramite la coda della vena con anticorpo marcato in un importo corrispondente a 2,0 nmol di colorante.
    6. Uso ugualmente etichettato anticorpi non specifici (ad es., IgG di topo o un altro isotipo corrispondente al patrimonio anticorpo primario) come un controllo di isotipo in dosi equivalenti a quelle della sonda specifica.
      Nota: I risultati in vivo di scansioni dopo iniezione del controllo composto può servire come riferimento per l'interpretazione della sonda specifica dati di imaging.
    7. Utilizzare un rasoio elettrico per radere il pelo animale nella regione addominale per ridurre al minimo assorbimento e riflessione della luce.

2. technical Equipment

  1. Utilizzare un dispositivo di veterinaria fluorescenza-mediata tomografia (FMT) per piccoli animali fluorescenza ( Figura 4).
  2. Creare un nuovo studio per ogni progetto facendo clic su "nuovo studio" pulsante e includere nella descrizione studio i traccianti pertinenti, compresi i parametri di imaging e dosi per riferimento futuro.
  3. All'interno di questo studio, creare gruppi di studio secondo il disegno di studio rispettivo (ad es., per il tracer specifico e non specifico isotipo controllo) facendo clic su "nuovo gruppo di studio" pulsante. Dotare ogni gruppo di studio con il rispettivo numero di animali.
  4. Calibrazione del sistema per i costrutti di tracciante.
    1. Eseguire la calibrazione per ogni batch di traccianti per normalizzare la variazione nell'etichettatura e consentono una misurazione quantitativa da dati OI.
    2. Seguire le indicazioni del produttore dello strumento per la calibrazione di ogni singolo impianto; Se si seleziona "Aggiungi nuovo elemento tracciante", il sistema fornirà una guida attraverso i passi. Fornire la diluizione della soluzione applicata dell'anticorpo e la concentrazione assoluta calcolata dell'elemento tracciante nella sonda.
    3. Per FMT, utilizzare un fantasma che imita il tessuto delle caratteristiche definite di spessore e assorbimento (simile a tessuto vitale) e riempirlo con un volume specifico della soluzione anticorpo utilizzato. Misurare questo sul dispositivo FMT.
      Nota: Il sistema utilizzerà la misura di riferimento della sonda fornita, insieme con la data concentrazione, per calcolare le concentrazioni di tracciante assoluta da futuri in vivo misure.
  5. Utilizzare una cassetta di esame riscaldabile con una temperatura di 42 ° C.
    Nota: Questo impedisce i topi di diventare ipotermica durante l'esame.

3. animale anestesia

  1. Utilizzare un flusso continuo di 1.5-2% vol % isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) e 1,5 L O2/min per anestetizzare i topi.
Utilizzare sistemi di inalazione appositamente progettati per l'anestesia del roditore (isoflurano vaporizzatore) per controllare facilmente la profondità anestetica e per minimizzare l'esposizione personale.
  • Posizionare il mouse nella camera di tenuta induzione e accendere il vaporizzatore per fornitura di isoflurane (100% (v/v), 5 vol % di ossigeno, 3 L/min). Monitorare il mouse fino a quando è distesa e inconscio.
  • Posizionarlo nella cassetta esame per tomografia, con isoflurano continua inalazione tramite naso a cono ad una dose di 100% v/v, 1,5% in volume di ossigeno, 1,5 L/min per ridurre artefatti di movimento durante l'esame. Per le procedure che durano più di 5 min, applicare unguento oculare agli occhi del mouse per prevenire danni alla cornea.
  • Valutare profondità anestetica controllando i riflessi. Appoggiare il mouse sul dorso; Se l'anestesia è sufficiente, il mouse non dovrebbe girare intorno. Pizzicare il mouse dolcemente tra le sue dita; Se l'anestesia è sufficiente, la gamba non sarà ritirato (fase di tolleranza chirurgica).

    • 4. fluorescenza-mediata di tomografia

    Nota: Adattare i seguenti dettagli, che sono specifici del sistema FMT utilizzato in questo studio (Vedi la Tabella materiali) per dispositivi di imaging di fluorescenza alternativi riflettanza o sistemi di FMT, come necessario.

    1. Posizionare il mouse anestetizzato sul dorso nel cassetto l'esame.
    2. Eseguire la procedura di scansione.
      1. Inserire la cassetta nel sistema di formazione immagine e chiudere immediatamente per garantire l'anestesia continua. Selezionare l'esempio appropriato dal gruppo di studio creato in precedenza. Selezionare il tracer amministrato dal menu a discesa per garantire che i valori di concentrazione del tracciante vengono calcolati correttamente.
      2. Acquisire l'immagine di riflettanza di fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata (720 nm per Cyanine7) per la pianificazione di scansione e muta il campo di scansione facendo clic sul pulsante "acquisizione immagine".
      3. Vedere che il campo di scansione viene visualizzata come una sovrapposizione dell'immagine di riflettanza di fluorescenza. Regolarlo nella regione di interesse (ad esempio, due punti o addome), evitando di aria o aree di pelliccia resto. A seconda del target di immagine, impostare il numero di immagine punti dati all'interno del campo di scansione scegliendo tra la grossa media e fine campo di scansione risoluzione nel menu sulla destra.
        Nota: Tenere presente che un campo di scansione potrebbe offrire la migliore risoluzione spaziale al costo di un tempo significativamente più lungamente scansione.
      4. Avviare l'acquisizione di dati/immagini alla lunghezza d'onda selezionata facendo clic su "scansione".
        Nota: Il tempo di scansione per una scansione medio-fine dell'intero addome sarà circa 5 min; in questo tempo, ogni punto di dati separatamente è illuminato dal laser di eccitazione, e la fluorescenza risultante viene registrata.
      5. Rimuovere l'animale dal cassetto imaging alla fine della scansione e permettere all'animale di recuperare completamente prima di inserirlo nuovamente dentro la gabbia.
      6. Se ritenuto necessario in vari momenti durante l'esperimento, ripetere il FMT (ad es., i giorni 0, 5 e 9-10 (fine dell'esperimento)), ma considera l'accumulo di anticorpi nel corpo, perciò aumentando il segnale di fluorescenza di fondo.

    5. post-scansione

    1. Posizionare il mouse in una gabbia separata su un tovagliolo di carta sotto una lampada riscaldante a luci rosse e monitorare il mouse per i segni di disagio o di difficoltà fino al completo recupero. Posizionare il mouse indietro nella sua gabbia rispettivo quando completamente sveglio.
    2. Eutanasia il mouse alla fine dell'esperimento per la consegna di CO2 per l'isolatore ad una dose di 100% (v/v), 100% in volume e 3 L/min. Non pre-riempire la camera con CO2, come un improvviso esposizione ad alte concentrazioni di CO2 potrebbe causare angoscia. Verificare la morte dopo che il mouse ha smesso di respirare da una modalità secondaria successiva dell'eutanasia come rapida dislocazione cervicale.
    3. Explant colon tramite la laparotomia addominale ed eseguire una scansione ex vivo del colon espiantato, come spiegato nella procedura 4.2.1 - 4.2.4. Aprire ogni colon longitudinalmente usando forbici chirurgiche Metzenbaum e sciacquare abbondantemente con soluzione salina prima di prepararlo per ulteriori analisi.
    4. Utilizzare un bisturi per tagliare un frammento di 0,5 cm dal colon distale e metterlo immediatamente in un tubo criogenico di 1,5 mL. Congelamento in azoto liquido e conservare a-70 ° C fino all'ulteriore utilizzo (ad es.,myeloperoxidase (MPO) misure).
    5. Utilizzare un bastoncino di legno e arrotolare il restante colon longitudinalmente aperto dal distale alla estremità prossimale, con il verso l'esterno di mucosa "(tecnica Swiss roll"), per le analisi istologiche. Posizionare la preparazione in un fissativo (Vedi la Tabella materiali) e congelare a-80 ° C14.

    6. interpretazione e ricostruzione di dati

    1. Utilizzare lo strumento di ricostruzione del rispettivo software di imaging per creare mappe 3D della distribuzione fluorescenza dai dati grezzi di imaging; scansioni vengono aggiunti automaticamente per lo strumento di ricostruzione, quando dopo la scansione, la funzione "Aggiungi alla coda di ricostruzione" è selezionata.
      1. In caso contrario, selezionare le scansioni dal menu a discesa sotto il rispettivo studio e gruppo di studio, pulsante destro del mouse la scansione e selezionare "Aggiungi alla ricostruzione".
    2. Per ulteriori analisi, è possibile caricare un set di dati nel software di analisi. Dal menu a discesa nella barra in alto, selezionare il rispettivo studio e quindi selezionare il gruppo di studio e il singolo animale dal menu sulla destra; tutte le scansioni eseguite per questo animale verranno mostrate. Selezionare la corretta scansione e fare clic su "carica".
      Nota: La ricostruzione 3D della distribuzione dell'elemento tracciante apparirà sulla sinistra come una sovrapposizione dell'immagine di riflettanza di fluorescenza inizialmente acquistata. Il modello può essere ruotato e ingrandito per semplificarne l'analisi.
    3. I fuochi di accumulazione di etichetta non specifico (ad es., fegato o urina vescica) su mappe 3D ricostruite di identificare e differenziare da tessuti bersaglio (ad es., intestino o intestino).
    4. Dalla barra in alto, selezionare la forma ROI più appropriata per il target. Etichetta tessuto bersaglio come regioni di interesse (ROI) inserendo i rispettivi strumenti di misurazione del software di analisi; il software fornirà un'intensità di fluorescenza per il ROI, come pure (pico-) quantità molare del tracciante che la scansione è stata calibrata per.
    5. Selezionare l'importo totale dell'elemento tracciante nel ROI appropriato, normalizzato per la dimensione ROI, come l'equivalente più adatto per la valutazione dell'attività di malattia in correlazione con l'infiltrato infiammatorio (istologia).
      Nota: Altre caratteristiche del ROI possono essere scelto se appropriato come rappresentante del modello particolare.

    7.Ex Vivo Analisi

    1. Ematossilina ed eosina e colorazione di immunofluorescenza.
      1. Deparaffinizzare sezioni ponendoli in 70% di etanolo (EtOH) per 2 min; Sciacquare con acqua distillata. Macchia con la soluzione di ematossilina per 5 min e successivamente risciacquare con acqua calda di rubinetto per 10 min.
      2. Sciacquare con acqua distillata, colorante di contrasto con soluzione di eosina per 2 minuti e sciacquare nuovamente con acqua distillata.
      3. Posto in 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH e xilene (2 volte) per 2 minuti ciascuno per disidratare e deselezionare le sezioni. Montare con mezzo di montaggio resinoso.
    2. Colorazione di immunofluorescenza.
      1. Utilizzare le sezioni di tessuto ottenuti in precedenza ("Swiss roll") per la colorazione di immunofluorescenza e preparare sezioni cryo-taglio di 7 µm.
      2. Bloccare le sezioni del colon acetone-fisso e congelato nel siero di ratto 5,0% per 10 min e incubare per una notte con anticorpo diluito (1/500 v/v) biotinylated del ratto primario anti-topo F4/80. Lavare le sezioni tre volte in soluzione fisiologica tamponata (TBS) ed incubare con Streptavidin-FITC (1: 100 v/v) in PBS/BSA (0,1% p/v) overnight a 4 ° C.
      3. Lavare le sezioni in TBS e macchia con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) per ottenere il contrasto. Analizzare le immagini di fluorescenza sotto un microscopio confocale (Vedi la Tabella materiali; ingrandimento 40x; cubo filtro N2.1 con filtro di eccitazione 515-560) e contare le celle F4/80-positivo per campo ad alta potenza.
        Nota: È consigliabile utilizzare gli anticorpi dello stesso clone e formato quando si combinano in vivo FMT e post-mortem istologia analisi quali immunoistochimica o colorazione di immunofluorescenza, a seconda del target previsto. Per la rilevazione di F4/80-positivi macrofagi in vivo ed ex vivo, sono stati utilizzati diversi formati.
    3. Misurazioni di MPO in campioni di due punti.
      1. Uso appena ottenuto, PBS-è risciacquata del colon campioni o campioni scongelati per misurazioni di MPO. Pesare tutti i campioni e omogeneizzare il tessuto in tampone di lisi fornito nell'ELISA kit (Vedi la Tabella materiali) ad un volume di 20 µ l di tampone di lisi per mg di tessuto.
      2. Sonicare per 15 s (frequenza di sonicazione: 20 kHz, potenza: 70 W) e centrifugare i campioni per 10 min a 200 x g e a 4 ° C.
      3. Uso una ELISA disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) secondo la descrizione di manufatti. Eseguire il test in duplicati.

    Risultati

    Valutazione di colite:

    Colite DSS indotta è un modello murino chimicamente indotto di infiammazione intestinale che assomiglia a IBD umana e conduce alla perdita di peso, sanguinamento rettale, ulcerazione superficiale e danno mucoso in topi suscettibili15. È particolarmente utile studiare il contributo del sistema immunitario innato per lo sviluppo di infiammazione intestinale

    Discussione

    Anche se le tecniche di imaging medicale si sono evolute rapidamente negli ultimi anni, siamo ancora limitati nella nostra capacità di rilevare processi infiammatori o tumori, nonché altre malattie, nelle loro prime fasi di sviluppo. Tuttavia, questo è fondamentale per la crescita del tumore di comprensione, invasione, o lo sviluppo di metastasi e processi cellulari, nello sviluppo di patologie infiammatorie e malattie degenerative, cardiovascolari e immunologiche. Mentre le tecniche di imaging tradizionale si basano ...

    Divulgazioni

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Riconoscimenti

    Ringraziamo la sig. ra Sonja Dufentester, Sig. ra Elke Weber e la signora Klaudia Niepagenkämper per l'eccellente assistenza tecnica.

    Materiali

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Reagents
    Alfalfa-free dietHarlan Laboritories, Madison, USA2014
    Bepanthen eye ointmentBayer, Leverkusen, Germany80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
    EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 4382
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)                         Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, GermanyB506
    Haematoxylin                                                    Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyHHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583fixative for histological analyses
    Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
    Sodium Chloride 0,9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
    Sodium bicarbonate powderSigma Aldrich Deisenhofen, GermanyS5761
    Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
    Hemoccult (guaiac paper test)Beckmann Coulter, Germany3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibodySerotec, Oxford, UKMCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg Germany553125
    Streptavidin-Alexa546Molecular Probes, Darmstadt, GermanyS-11225excitation/emission maximum:  556/573nm
    Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TCCalteg, Burlingame, USAR2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibodyBioLegend, London, UK123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyD9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibodyBD Pharmingen, Heidelberg, Germany553104
    FACS bufferBD Pharmingen, Heidelberg, Germany342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare Europe, Freiburg, GermanyPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, GermanyK 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibodyBioLegend, London, UK123127ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, USA45-4801-80ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany67-68-5
    IsofluraneSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany792632
    EthanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany64-17-5
    Bovine Serum Albumins (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyA4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanySRE0032
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry SystemBD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
    FMT 2000 In Vivo Imaging SystemPerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis SoftwarePerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAincluded in FMT2000
    Leica DMLB Fluorescent MicroscopeLeica,  35578 Wetzlar, Germany DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, GermanyHD 2070ultrasonic homogenizer
    Disposable scalpel No 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ692395-10EA
    Metzenbaum scissors 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany22398330
    luer lock syringe 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ248010
    syringe needlesSigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ192368 
    Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070

    Riferimenti

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

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