Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive

Résumé

L’objectif du protocole est de construire un modèle d’inflammatoire gencive humaine in vitro. Ce modèle de tissu co cultive trois types de cellules humaines, HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, dans des conditions en trois dimensions. Ce modèle peut être appliqué à une enquête sur les maladies parodontales, telles que la gingivite et la parodontite.

Résumé

Les maladies parodontales (telles que la gingivite et la parodontite) sont les principales causes de la perte des dents chez les adultes. Inflammation de la gencive est la fondamentale physiopathologie des maladies parodontales. Les modèles expérimentaux actuels des maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments pour les maladies parodontales. Nous présentons ici un protocole détaillé pour reconstruire les équivalents humains inflammatoires des tissus de la gencive (iGTE) in vitro. Nous avons tout d’abord créer des équivalents de tissus humains de la gencive (GTE) en utilisant deux types de cellules humaines, y compris les fibroblastes gingivaux humains (HGF) et les kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT), dans des conditions en trois dimensions. Nous créons un modèle de la plaie à l’aide d’un perforateur de tissu pour percer un trou dans le GTE. Ensuite, humaines monocytes THP-1 mélangés avec du gel de collagène sont injectées dans le trou dans le GTE. Par adimistration de 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pendant 72 h, THP-1 cellules se différencient en macrophages aux foyers inflammatoires de la forme en GTE (iGTE) (IGTE peut également être stumilated avec 2 µg/mL de lipopolysaccharides (LPS) pendant 48 h initier l’inflammation ). IGTE est le premier modèle in vitro de la gencive inflammatoire utilisant des cellules humaines avec une architecture en trois dimensions. IGTE reflète des changements pathologiques principaux (immunocytes activition, interactions intracellulaires chez les fibryoblasts, les cellules épithéliales, les monocytes et les macrophages) dans les maladies parodontales. GTE, GTE blessé et iGTE utilisable comme outils polyvalents pour étudier la cicatrisation, régénération des tissus, l’inflammation, interaction cellule-cellule et médicaments potentiels écran des maladies parodontales.

Introduction

Les maladies parodontales sont la principale cause de la perte des dents chez les adultes. La gingivite et la parodontite est des maladies parodontales les plus courantes. Les deux induite par le biofilm aiguës ou chroniques inflammatoires changements actuels dans la gencive. La gingivite est caractérisée par une inflammation aiguë, tandis que la parodontite se présente généralement comme une inflammation chronique. Sur le plan histologique, les composantes bactériennes déclenchent l’activation des cellules immunitaires, tels que les macrophages, lymphocytes, plasmocytes et mastocytes^1,2. Ces cellules immunitaires, en particulier les macrophages, interagissent avec les cellules locales (y compris les cellules épithéliales gingivales, fibroblastes, cellules endothéliales et les ostéoblastes) entraînant des lésions inflammatoires dans les tissus parodontaux^3,4. Modèles expérimentaux de maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux, comme les rats, hamsters, lapins, furets, chiens et des primates. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments des maladies parodontales⁵. Co-culture de bactéries parodontales et cellules épithéliales humaines orale de monocouche a été utilisé pour étudier le mécanisme de l’infection parodontale⁶. Néanmoins, des cultures monocouches de cellules par voie orale n’ont pas l’architecture cellulaire d’en trois dimensions (3D) de tissus intacts ; par conséquent, ils ne peuvent pas imiter la situation in vitro .

Ici, équivalents 3D inflammatoires des tissus humains de la gencive (iGTE) sont mis en place pour représenter les maladies parodontales in vitro. Ce modèle 3D des maladies parodontales occupe une position intermédiaire entre des cultures monocouches de cellules et des modèles animaux. Trois types de cellules humaines, y compris HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, sont conjointement cultivés sur gel de collagène et stimulées par les initiateurs inflammatoires de construire iGTE. IGTE simule étroitement les conditions in vivo de la différenciation cellulaire, interaction cellule-cellule et activation des macrophages dans la gencive. Ce modèle a de nombreuses applications possibles pour drogue préliminaire et d’essai de nouvelles approches pharmacologiques dans les maladies parodontales, ainsi que pour analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires dans la guérison des blessures, l’inflammation et la régénération des tissus.

Protocole

Ce protocole est conçu pour créer des tissus gingivaux humains équivalents, blessure gingivale modèles et modèles de gingivite. Kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT) ont été gracieusement fournis du professeur Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Allemagne)⁷. Les fibroblastes gingivaux humains (HGFs) ont été isolés des tissus gingivaux selon les protocoles publiés précédemment⁸. Le consentement éclairé a été obtenu au préalable et l’étude a été approuvée selon les lignes directrices établies par le Comité d’éthique, l’Université dentaire Nippon School of Life Dentistry à Tokyo (numéro d’autorisation : NDU-T2012-35). Protocole, étapes 1-3 devraient être effectuées sous une hotte de culture cellulaire.

1. préparation du tissu humain 3D équivalents de la gencive (GTE) (Figure 1 a)

1. Mélange collagène type I-A gel 10 % concentré MEM-alpha et tampon de reconstruction de 10 % (2,2 g de NaHCO₃ et 4,47 g HEPES dans 100 mL 0,05 N NaOH) dans un tube stérile de 15 mL de pipetage. Conserver la solution mixte de collagène sur la glace jusqu'à utilisation.
2. Placer les inserts de culture 24 puits (pore taille 3,0 µm) dans une plaque de 24 puits.
3. Enlever HGFs de la surface de la culture à l’aide de la solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Suspendre les cellules dans 10 mL de milieu de culture A (MEM-alpha + 20 % BF + 1 % GlutaMAX). Compter les cellules par un compteur de cellules Bürker-Türk.
   1. Extraire la quantité désirée de cellules (1-5 x10⁵ cellules/mL), puis centrifuger pendant 4 min à 190 x g.
   2. Suspendre les cellules dans la solution mixte de collagène. Garder le mélange sur la glace jusqu’au niveau suivant.
4. Ajouter 0,5 mL du mélange cellulaire-collagène (0,5 à 2,5 x 10⁵ cellules/puits) dans l’insert de culture sans produire toutes les bulles. Incuber le mélange pendant 10 à 30 min en atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ à 37 ° C, pour coaguler le mélange dans un gel.
   NOTE : Ajouter le mélange de collagène dans le centre de l’insert de culture afin d’éviter la formation inégale de gel de collagène.
5. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans le puits et 0,5 mL dans l’insert. Incuber la plaque de culture pendant 24 h ou toute la nuit dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ à 37 ° C.
6. Éliminer les cellules HaCaT de la surface de la culture à l’aide de la solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Suspendre les cellules dans 10 mL de milieu B (DMEM + 10 % BF + 1 % GlutaMAX) et compter les cellules non vides. Extrait la quantité nécessaire de cellules (1 – 5 x 10⁵ cellules/mL) avec une pipette, centrifuger pendant 4 min à 190 x g. suspendre les cellules de B. moyen
7. Retirez le support les inserts de culture, contenant le mélange de HGF-collagène, par aspiration. Ajouter 0,5 mL de suspension de cellules HaCaT (0,5 à 2,5 x 10⁵ cellules/puits) sur le dessus le mélange de HGF-collagène. Incuber les cultures pour 24 h ou toute une nuit.
   Remarque : À ce moment, le milieu de la culture bien devrait être A moyen, tandis que le milieu dans le foyer de la culture devrait être moyen B.
8. Remplacer le milieu de culture avec support KSR (milieu de culture Co) (MEM-alpha + 15 % KnockOut remplacement de sérum + 1 % GlutaMAX) + 5 % FBS. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans la culture bien et 0,5 mL dans le foyer de la culture. Incuber les cultures pendant 24 à 48 h.
9. Remplacer le milieu de culture avec moyen KSR + 1 % FBS. Ajouter 1 mL dans la culture bien et 0,5 mL dans l’insert de la culture. Incuber les cultures pour 24 h ou toute une nuit.
10. Remplacer le milieu de culture dans la culture bien avec 0,7 – 1 mL de milieu KSR. Retirez complètement le milieu de l’insert de culture (la surface de culture doit être exposée à l’air). Incuber les cultures pendant 1 à 2 semaines. Modifier le milieu dans la culture bien deux fois par semaine.
    Remarque : Ne laissez pas la montée de niveau moyenne au-dessus de la surface de culture (la couche supérieure composée de kératinocytes). Gardez toujours la surface de culture sèche.

2. préparation du GTE blessé (Figure 1 b)

1. Préparer un perforateur de tissus 1 à 3 mm de diamètre. Stériliser à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
2. Poussez le perforateur de tissu perpendiculairement dans GTE environ 300 µm de profondeur et percer un trou dans le tissu pour simuler une blessure.
3. À cette étape, utilisez le GTE blessé pour enquêter sur la régénération de tissus et la cicatrisation plaie. Vous pouvez également fixer GTE en utilisant la solution tampon neutre de 10 % de formol pour effectuer une analyse histologique.

3. préparation du GTE inflammatoires (iGTE) (Figure 1 b)

1. Cultiver des cellules THP-1 selon le précédent rapport⁹.
2. Mélange collagène type I-A gel 10 % concentré RPMI 1640, tampon de reconstruction de 10 % (2,2 g de NaHCO₃ et 4,47 g HEPES dans 100 mL 0,05 N NaOH) et 10 ng/mL PMA. Conserver la solution mixte de collagène sur la glace jusqu'à l’utilisation.
3. Nombre 1-2 x 10⁶ THP-1 cellules et centrifuger pendant 4 min à 190 x g. suspendre les cellules dans 1 mL de la solution mixte de collagène. Garder le mélange sur la glace jusqu’au niveau suivant.
4. Ajouter 10 – 30 µL THP-1-collagène mélange dans la zone blessé de GTE. Remplacer le milieu de culture à 0,7 – 1 mL de milieu KSR contenant 10 ng/mL de PMA.
5. Incuber le mélange dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ à 37 ° C pendant 72 h.
6. Utiliser le modèle pour l’étude de gingivite ou parodontopathie (par exemple, ajouter potentiel anti-inflammatoire à iGTE pour voir ses effets sur la libération de cytokines¹⁰). Vous pouvez également omettre 72 h PMA-traitement, ajouter 2 µg/mL de LPS dans la culture et incuber le tissu dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ à 37 ° C pendant 48 h^11,12.

4. fixation et immunomarquage de monter ensemble de GTE et iGTE Cultures

1. Fixation des cultures.
   1. Retirer le milieu de culture de la plaque 24 puits. Laver les tissus 2 fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
   2. Ajouter 1 mL de solution tampon neutre de 10 % de formol à l’insert et 1 mL de la culture. Laisser la plaque 24 puits dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit.
   3. Enlever la solution de tampon neutre de formol 10 % le lendemain.
   4. Pour toute monture immunostaining, laver les tissus 3 - 4 fois avec du PBS après fixation.
   5. Pour l’hématoxyline et éosine (H & E) souillant et immunostaining régulière, procéder avec déshydratation, enrobage de paraffine et de sectionnement.
      Remarque : Pour toute monture immunostaining, cette étape peut être omise.
2. Toute monture immunostaining
   Remarque : Ce protocole a été modifié de celle de référence 13.
   1. Laver les tissus 3 x dans du PBS 0,5 – 1 % Triton, 10 – 30 min chaque fois.
   2. Incuber les tissus deux fois pendant 30 min dans un tampon bloquant (PBS 1 % Triton + 10 % de BSA), à la température ambiante.
   3. Laver les tissus 2 × dans un tampon bloquant, 5 – 10 minutes chaque fois.
   4. Ajouter 50 µL de solution d’anticorps primaire à la dilution/concentration requise pour les inserts. Utiliser un film mince en plastique autocollant pour envelopper les inserts pour éviter le dessèchement des tissus.
   5. Incuber le tissu pendant 1 à 2 jours à 4 ° C.
   6. Laver les tissus 3 fois, pendant 30 min dans du PBS 1 % Triton + 10 % de BSA. Lavez à nouveau 3 fois, pendant 5 min dans du PBS 1 % Triton.
   7. Ajouter 50 µL d’anticorps secondaire dans un tampon bloquant (PBS 1 % Triton + 10 % de BSA) et 5 µL de solution de Hoechst 33342 (tache NucBlue vivre cellule) à chaque insertion. Utiliser un film mince en plastique autocollant pour envelopper les inserts pour éviter le dessèchement des tissus.
   8. Incuber pendant 1 à 2 jours à 4 ° C. Enrouler la plaque 24 puits dans une serviette de papier humide et puis le mettre dans un paquet en plastique à utiliser tout au long de l’incubation.
   9. Laver les tissus 3 fois, pendant 10 min dans triton de PBS 1 %
   10. Utilisez une aiguille fine pour couper la membrane de l’insert de culture pour obtenir le tissu. Placer la membrane sur une lame.
       Remarque : Le tissu doit être sur la membrane.
   11. Ajouter 2 à 3 gouttes de milieu de montage de fluorescence. Couvrir le tissu avec une lamelle couvre-objet et conserver à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à l’analyse.
   12. Découvre les tissus avec un laser confocal, microscopie (LSM).

Résultats

Cellules HaCaT affichent la morphologie typique de kératinocytes sous observation au microscope à contraste de phase (Figure 2 a). Images de scanner électronique microscopiques (SEM) ont montré que les surfaces de cellules HaCaT étaient couverts de nombreuses microvillosités. Liens intercellulaires entre les cellules HaCaT ont été véhiculées par des procédés à membranes (Figure 2 b). HaCaT cellules expriment l’épi...

Discussion

Ce protocole est basé sur les méthodes de création d’équivalents de tissu gingival et les équivalents de-le tissu adipeux sous-cutané décrits par les précédents rapports^8,21,22. Bien qu’il s’agit d’une méthode simple et facile, certaines étapes nécessitent une attention particulière. Par exemple, le mélange collagène doit être maintenu sur la glace jusqu'à l’utilisation afin d’éviter la formation de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen type I-A	Nitta Gelatin Inc		For making dermis of GTE
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	11900073	Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm	Corning, Inc.	353096	For tissue culture
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Cell culture reagent
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31600034	Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Cell culture reagent
Tissue puncher	Shibata system service co., LTD	SP-703	For punching holes in GTE
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	31800022	Cell culture medium
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)	Thermo Fisher Scientific	R37605	For labeling nuclei
Fluorescence mount medium	Dako		For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]	abcam	ab17139	For identifying epithelium
Scaning electron microscope	Hitachi, Ltd.	HITACHI S-4000	For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy	LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.	LSM 700	For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody	abcam	ab52625	For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody	abcam	ab92547	For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody	Millipore	CBL271	For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody	Sigma-Aldrich	SAB2700244	For identifying macrophages
Human CD14 Antibody	R&D Systems	MAB3832-SP	For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A11012	For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11001	For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific		For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells	Riken BRC cell bank	RCB1189	For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)	Sigma-Aldrich	P8139	For differentiatting THP-1 cells