Caractérisation des polymères synthétiques via Matrix Assisted Laser Desorption ionisation temps de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de vol

Résumé

Un protocole pour le temps d’ionisation laser assistée par matrice désorption de la caractérisation des polymères synthétiques de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) est décrit notamment l’optimisation de la préparation de l’échantillon, spectrale acquisition et analyse des données de vol.

Résumé

Il existe de nombreuses techniques qui peuvent être employées dans la caractérisation des homopolymères synthétique, mais peu fournissent aussi utile d’informations pour l’analyse du groupe fin comme du temps d’ionisation laser assistée par matrice désorption vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS). Ce didacticiel illustre les méthodes d’optimisation de la préparation des échantillons, acquisition spectrale, et analyse des données des polymères synthétiques à l’aide de paramètres de MALDI-TOF Mme critique au cours de la préparation de l’échantillon incluent la sélection de la matrice, identification d’un sel de cationisation approprié et tuning les proportions relatives de la matrice, cation et d’analytes. Les paramètres d’acquisition, tels que le mode (linéaire ou réflecteur), polarisation (positive ou négative), la tension d’accélération et temps de retard, sont également importants. Compte tenu des connaissances de la chimie impliquée synthétiser le polymère et optimiser les paramètres d’acquisition de données tant les conditions de préparation d’échantillon, spectres devraient être obtenues avec une résolution suffisante et la précision de masse pour permettre à l’ambiguïté détermination des groupes fin des homopolymères plupart (masses au-dessous de 10 000) en plus de l’unité de répétition de masse et la répartition globale du poids moléculaire. Si a démontré sur un nombre limité de polymères, ces techniques générales sont appliquent à un éventail beaucoup plus large des polymères synthétiques pour la détermination des distributions de massives, se détermination du groupe fin n’est pas possible pour les homopolymères avec dispersion étroite.

Introduction

Avec des améliorations dans la vie techniques de polymérisation, polymères de précision avec groupements terminaux quantitativement fonctionnalisés sont de plus en plus disponible¹. Le développement simultané des chimies de clic azoture-alcyne et thiolene a permis à l’accouplement presque quantitative des macromolécules d’autres moitiés, donnant accès à une gamme d’hybrides matériaux^2,3,4 . Cependant, des techniques analytiques précises sont nécessaires pour caractériser aussi bien les matières premières et produits de ces réactions de conjugaison de polymère. Temps de désorption-ionisation laser assistée par matrice vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) est une technique d’analyse précieux ionisation douce pour la caractérisation des polymères car il peut générer des ions de polymère dans un état de charge simple avec un minimum fragmentation^5,6. MALDI-TOF MS a grands avantages par rapport aux autres méthodes conventionnelles de caractérisation de polymère parce qu’elle peut offrir des spectres de masse avec une résolution de la n-mers individuels au sein de la distribution de masse de polymère. En conséquence, ces spectres de masse peut fournir des informations précises sur la masse moléculaire moyenne, répétez l’unité de masse et poids moléculaire polydispersité⁷, qui peut à son tour élucider les mécanismes de polymérisation concurrentes telles que transfert de chaîne⁸ . Cependant, MALDI-TOF MS est particulièrement puissant à fournir des informations sur polymère fin groupes^9,10, qui peut être utilisé pour confirmer la fin du groupe modifications^10,11 et autres les transformations¹² comme polymère cyclisations^11,13. Tout aussi important, la quantité relativement faible d’analyte (sub-microgrammes) requis pour spectrométrie de masse analyse rend cette technique utile pour la caractérisation lorsque seulement quelques traces de matériel sont disponibles.

L’analyse de MALDI-TOF MS polymères peut être divisée en quatre étapes distinctes : préparation des échantillons, d’étalonnage des instruments, acquisition spectrale et analyse des données. Préparation de l’échantillon est l’étape la plus essentielle pour générer optimisé des spectres de masse MALDI-TOF et se produit avant que l’échantillon est introduit dans l’instrument^14,15. La sélection d’une matrice appropriée avec les paramètres de solubilité similaires comme l’analyte de polymère est essentielle pour obtenir des spectres de masse MALDI-TOF de haute qualité et lignes directrices pour la sélection de la matrice ont été signalés ailleurs^{14,15, 16,17}. Une base de données de polymère MALDI « recettes » pour la préparation de l’échantillon a été également publiée en ligne¹⁸. De nouveaux polymères, sélection de la matrice peut être abordée en première compréhension la solubilité du polymère et en sélectionnant une matrice avec la même solubilité paramètres^14,19. Polymères avec une affinité élevée protons peuvent être protonés par la plupart des matrices¹⁴ (qui contiennent fréquemment des groupes acide carboxylique), mais pour les autres polymères, un agent de cationisation est requis¹⁴. Les ions alcalins adduit avec contenant de l’oxygène espèces (par exemple. polyesters et polyéthers), tandis que les hydrocarbures insaturés (e.g. polystyrène) adduit avec les métaux de transition tels que les ions d’argent et de cuivre^{14, 19}. parce que les échantillons de polymère dans cette expérience contenaient des atomes d’oxygène dans la colonne vertébrale, trifluoroacétate de sodium ou de potassium (TFA) ont été utilisées comme agent cationisation. Une fois que les agents de la matrice et cationisation ont été sélectionnés, les proportions relatives de l’analyte, agent de cation et la matrice doivent être soigneusement optimisées pour assurer un signal au bruit. Dans cette procédure, les paramètres de préparation des échantillons ont déjà été optimisés, toutefois une procédure d’optimisation échantillon empirique (étape 1.4.1., Figure 1) qui varie systématiquement les concentrations des trois composantes (analyte, matrice et cations) est efficace pour déterminer rapidement leur ratio optimal.

Acquisition de données requiert également l’optimisation d’un certain nombre de paramètres. Les paramètres les plus importants incluent le mode ion positif ou négatif du spectromètre, au mode de fonctionnement (linéaire par rapport à réflecteur), la tension d’accélération et le temps de retard d’extraction. Une autre façon que la résolution peut être augmentée est par le biais de l’utilisation du « réflectron » mode^20,21,22,23. Mode réflectron double essentiellement la trajectoire des ions dans le détecteur en reflétant les ions à la fin du tube vol vers un détecteur près de la source tout en ions recentrer avec différents élans et par conséquent augmenter la résolution bien que diminuer l’intensité du signal. On trouvera en outre, les spectres de résolution plus élevées en diminuant la puissance du laser qui minimise le rapport signal sur bruit en diminuant le nombre et l’énergie des collisions et donc réduire la fragmentation et la cinétique inhomogénéités²⁴. Par le réglage de tous ces paramètres, les ions peuvent se concentrer afin de minimiser l’effet de tout manque d’homogénéité dans la position initiale ou de la vitesse qui se produit pendant le processus de la désorption laser. Lorsque les paramètres d’acquisition sont optimisées, résolution isotopique souvent est possible pour les ions de masse supérieure à 10 000 Da, si ce n’est aussi dépendant de la longueur du tube vol et la conception de l’appareil. Plupart des composés organiques qui contiennent au moins un hétéroatome sont sujettes à la complexation avec les cations alcalins tels que lithium, de sodium et potassium. La plupart des métaux alcalins sont monoisotopes ou d’isotopes limitées et par conséquent n’élargissent pas la distribution.

Alors que les paramètres de l’instrument peuvent être ajustés afin d’optimiser la précision des informations, l’exactitude des données n’est possible avec un étalonnage approprié¹¹. Protéines et peptides servaient initialement calibrants en raison de leur monodispersity et leur disponibilité, mais souffrent de stabilité variable et la prévalence des impuretés²⁵. Plus stables et rentables des solutions de rechange ont inclus des agrégats inorganiques et polydispersés polymères^26,27,28,29. Malheureusement, la fonctionnalité de ces alternatives se dispersent masses qui compliquent massives affectations, ainsi que des masses plus petites dans l’ensemble, ce qui les rend utiles uniquement pour les étalonnages au-dessous de 10 000 Da. Pour lutter contre ces problèmes, Grayson et al. ²⁵ a développé un système de calibration de la MS dendrimère-based, polyester monodispersé, qui possède tant large matrice et compatibilité solvant, stabilité de durée de vie (> 8 ans) et moindre coût de production. D’après les points forts de ce système, il a été choisi comme le degré de ces expériences.

Il existe deux principaux types d’étalonnage : internes et externes³⁰. Lors de l’étalonnage externe, une norme dont les masses que celui de l’analyte support sont placés sur la plaque de mire MALDI dans une position de l’échantillon différent que l’analyte pour générer un spectre de masse séparé, d'où un fichier de calibration peut être généré. En revanche, une plus grande précision possible souvent avec un étalonnage interne, ce qui implique le degré de mélange avec l’analyte pour obtenir un spectre d’hybride avec les calibrant analyte signaux et. La procédure décrite ci-dessous, un étalonnage externe est mis en oeuvre. Après un étalonnage approprié de l’échelle de masse, analyte précises données massives peuvent être acquises. Afin d’assurer l’étalonnage plus précis, il est important que l’acquisition des données se produit peu de temps après l’étalonnage.

Enfin, une fois calibré l’optimisée, des ensembles de données ont été acquises, et les données ont été analysées pour fournir des informations structurelles sur les échantillons de polymère. L’espacement entre n-mers dans la distribution de polymère peut fournir une mesure précise de l’unité de répétition de masse. La masse moléculaire moyenne en nombre (_n) et autres calculs de distribution de masse (par exemple, M_w (masse moléculaire moyenne en poids) et Đ (dispersion)) peut également être déterminée par la distribution des signaux dans les spectres de masse ( l’étape 4.2 pour les calculs). Peut-être plus unique, dans le cas des homopolymères, la somme des masses groupe fin peut être confirmée en déterminant le décalage de la distribution de polymère en ce qui concerne la masse de l’unités répétitives seules. Les spectres de masse MALDI-TOF riches en information fournissent des données de caractérisation précieux qui sont complémentaires aux techniques de caractérisation de polymère plus traditionnelles comme la chromatographie d’exclusion, spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, et résonance magnétique nucléaire.

Protocole

ATTENTION : Toutes les réactions ont été exécutées dans une hotte de laboratoire. Veuillez lire toutes les matières fiches signalétiques (FS) pour tout produit chimique utilisé et prendre les précautions appropriées.

1. préparation de l’échantillon

1. Préparation de la solution mère de matrice
   1. Dissoudre 20 mg d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (LCSS) dans 1 mL de tétrahydrofurane-moment (THF) et vortex jusqu'à dissolution.
   2. Dissoudre 20 mg d’acide 2, 5-dihydroxybenzoïque (DHB) dans 1 mL de THF et vortex jusqu'à dissolution.
2. Préparation de la solution mère de cations alcalins
   1. Dissoudre 2 mg de sodium trifluoroacétate (Académie) dans 1 mL de THF et vortex jusqu'à dissolution.
   2. Dissoudre 2 mg de potassium trifluoroacétate (KTFA) dans 1 mL de THF et vortex jusqu'à dissolution.
3. Préparation des solutions mères analyte
   1. Exemple 1 : Dissoudre 2 mg de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) dans 0,5 mL de THF et vortex jusqu'à dissolution.
   2. Exemple 2 : Dissoudre 2 mg de polyoxyéthylène bis(azide) (_n = 2000) dans 0,5 mL de THF et vortex jusqu'à dissolution.
   3. Exemple 3 : Dissoudre 2 mg de lactide, thiol résilié (_n = 2500) dans 0,5 mL de THF et vortex jusqu'à dissolution.
4. Préparation des mélanges de l’échantillon pour analyse
   1. Préparer une série de solutions en solution cation, l’analyte et la matrice de mélange tout en variant les proportions relatives des composants tels que neuf échantillons uniques mélanges sont constitués. Par exemple, garder le montant de constante de solution mère de matrice ajouté (e.g., 10 µL), varier la quantité de solution d’analyte par un facteur de trois (e.g., 45, 15 et 5 µL), tout en également varier la quantité de solution de cation par un facteur de trois (par exemple ., 9, 3 et 1 µL). Ces échantillons donnent effectivement une grille 3 x 3 échantillons avec les deux variables de concentration différents sur le x et le y axes (Figure 1).
   2. Pour l’exemple représentatif, mélanger 15 µL de la solution de lactide, avec 15 µL de la solution DHB et 1 µL de la solution de l’Académie.
   3. Pipetter 1 μL de chaque mélange de solution sur un échantillon individuel bien sur la plaque de mire MALDI (Figure 2). Ajouter progressivement les échantillons en petites portions pour empêcher l’échantillon ne s’écoule du puits échantillon, permettant à chaque aliquote d’évaporer à sec avant d’ajouter l’échantillon supplémentaire.
      Remarque : Pour des solvants de point d’ébullition plus élevés, un pistolet à air peut être nécessaire pour accélérer l’évaporation des solvants, mais soyez prudent afin d’éviter de chauffer la plaque de l’échantillon, susceptible de provoquer la plaque à se déformer.
5. Préparation d’échantillons standards pour l’étalonnage
   1. Préparer les étalons en utilisant le protocole suggéré fournisseur.
      NOTE : Dendrimère calibrants ont été choisis pour cette étude et sont disponibles comme les dendrimères pure ou prémélangée avec matrix, calibrant et cation à des rapports optimisés.

2. optimisation d’Acquisition de données

1. Initiatrice d’Acquisition de données
   1. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données « FlexControl ».
   2. Éjectez la plate-forme pour permettre le chargement de la plaque cible en appuyant sur le "" bouton.
   3. Placez délicatement la plaque cible avec les échantillons chargés en calibrant et l’analyte sur la plate-forme dans l’orientation appropriée.
   4. Utiliser le logiciel d’acquisition pour faire passer la plaque de mire sur la plate-forme en appuyant sur le "" nouveau bouton.
   5. Sélectionnez une méthode d’acquisition de données appropriées (méthode d’acquisition mode positif) en appuyant sur fichier | Sélectionnez la méthode.
      Remarque : Pour la plupart des échantillons de polymère, y compris notre représentant analytes, ionisation est attendue par complexation avec un cation et, par conséquent, une méthode d’acquisition de mode positif est plus appropriée. Selon l’instrument, pour les gammes inférieures de massives (500-10 000 Da) ou lorsque vous souhaitez une résolution plus élevée, sélectionnez un fichier de méthode en mode réflecteur. De poids moléculaire plus élevé échantillons ou lorsque la plus grande sensibilité du signal est nécessaire et basse résolution est acceptable, sélectionnez un fichier de méthode en mode linéaire.
   6. Avant d’acquérir des données, assurer une gamme appropriée de masse pour la collecte de données est sélectionné-idéalement que la gamme masse comprendra la moitié de la masse la plus faible dans la distribution prévue ainsi que double la masse plus élevée dans la distribution attendue. Cochez cette case en cliquant sur l’onglet détection et Regarde un Gamme de masse.
      NOTE : Cela permet de s’assurer que le signal provenant de fragments de dégradation plus bas poids moléculaire ou agrégats de poids moléculaire plus élevés (dimère) qui peuvent être présents dans l’échantillon sont inclus dans l’ensemble de données. Notez également que des oligomères de matrice sont fréquemment remarqués avec des intensités de signal élevé dans la plupart spectres de masse MALDI-TOF, fournissant des bruits de forte intensité avec des masses aussi élevées que 1 000 Da, complication analyse au-dessous de cette masse. Bien que l’étalonnage devra avant d’obtenir un ensemble de données final, un fichier de calibrage précis ne peut être acquise que si les paramètres d’acquisition identiques sont utilisés comme ceux optimisés pour l’analyte particulier. Donc, une optimisation préliminaire de l’analyte spectre de masse est nécessaire avant l’étalonnage, suivie de la nouvelle acquisition d’un spectre de masse analyte calibré.
2. Acquisition de données préliminaires
   1. Dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez la position sur la plaque de mire qui correspond à l’analyte désirée.
   2. Ouvrir la collecte des données pendant le déplacement de la cible laser autour de l’échantillon afin d’optimiser le signal. Pour démarrer la collecte de données, appuyez sur Start.
      Remarque : Le laser peut épuiser la matrice à un endroit donné après échantillonnage répété.
   3. À l’aide de la barre coulissante sur le côté gauche de la fenêtre de la caméra, réglez la puissance du laser telle que la puissance minimale nécessaire pour atteindre la résolution isotopique est obtenue.
      Remarque : Lors de l’analyse des échantillons multiples pour confirmer le rapport optimal de l’analyte, cation et matrice, utilisent la même puissance de laser sur chacun des échantillons d’analyte pour déterminer quel échantillon présente le meilleur rapport signal/bruit pour les paramètres d’acquisition. Continuer l’optimisation de l’acquisition future avec l’échantillon qui semble présenter le meilleur rapport signal sur bruit.
3. Optimisation d’acquisition de données
   1. Zoom sur un pic individuel au milieu de la gamme de masse d’intérêt, d’optimiser la résolution en réglant la différence de tensions d’accélération (pour les instruments dans cette étude, il s’agit ajuster la valeur « IS2 »), qui se trouve dans le spectromètre onglet.
      NOTE : Ceci est optimisé plus rapidement en faisant varier la valeur IS2 en grandes étapes, prenant acte dont la valeur génère la meilleure résolution (i.e., le plus petit pleine largeur du pic à moitié intensité maximale du signal) et puis encore optimiser en petites étapes de la valeur IS2. En général, la valeur optimale de IS2 est plus élevé (proche de IS1) pour les polymères de massives faibles et inférieure pour la masse de hauts polymères.
   2. Si vous le souhaitez, augmenter la résolution en mode réflectron.
      NOTE : Mode réflectron permet la compensation des écarts de vitesse initiale des ions de même m/z en forçant les ions de vitesse plus élevées de la même valeur de m/z dans un chemin plus long au détecteur. Cette augmentation en chemin vers le détecteur permet des ions plus lentes de la même valeur de m/z pour arriver au détecteur simultanément, concentrant efficacement les ions pour une résolution accrue. Bien que le mode réflectron améliore généralement la résolution du signal, pour les échantillons avec une intensité de signal faible, mode linéaire peut être requise afin de visualiser les données.
   3. Enfin, optimiser la puissance du laser en réduisant la puissance du laser aussi faible que possible tout en générant un raisonnable rapport signal sur bruit (e.g., signal / bruit de 10 environ).
      NOTE : Parce que des puissances supérieures de laser généralement réduisent la résolution et peuvent induire une fragmentation, les spectres de masse avec la meilleure qualité sont acquis à l’aide de la puissance du laser réduit mais un plus grand nombre d’analyses.
   4. Une fois que les paramètres d’acquisition sont optimisés, enregistrer les spectres de masse non étalonnées en sélectionnant le fichier , puis Enregistrer le spectre à classer sous. Pour l’étalonnage externe, une nouvelle acquisition de la calibrant selon ces paramètres identiques, optimisés doit effectuer avant une nouvelle acquisition est lancée pour générer le spectre de masse calibré de l’analyte.

3. MALDI étalonnage

1. Acquisition du spectre de masse de calibrage
   1. En utilisant les paramètres d’acquisition déjà optimisées pour l’analyte, acquérir un spectre de masse optimisé de l’échantillon des étalons de masse.
      NOTE : Idéalement, l’ensemble de l’étalonnage doit inclure une norme supérieure à la plage d’intérêt, un au-dessous et au moins un dans la gamme des intérêts. La précision de l’étalonnage est meilleure si tous les paramètres d’acquisition sont identiques pour les deux échantillons.
2. Créez un fichier de calibration
   1. Assurez-vous qu’aucun étalonnage existant est annulée ou en mesure d’être écrasée en appuyant sur Calibration invalider sous le spectromètre tab.
   2. En utilisant les mêmes paramètres d’acquisition (par exemple., puissance, tension IS2 du laser), déplacer le laser sur le puits échantillon contenant le degré (e.g., dendrimère standard, peptide) en sélectionnant la correspond bien avec le curseur et d’acquérir une spectre en appuyant sur Start.
3. Une fois que le signal suffisant a été acquis, appuyez sur Démarrer pour terminer l’acquisition de données.
4. Une fois un spectre de masse de la calibrant a été acquis, sélectionnez le menu déroulant de Liste de contrôle de masse dans l’onglet Calibration qui correspond à cet étalon. La liste de contrôle de masse approprié aura des masses de référence de la calibrant sélectionné avec le cation approprié.
   Remarque : Ces devraient être disponible auprès du fournisseur de degré et assurez-vous d’utiliser les valeurs de Masse monoisotopique lorsque la résolution isotopique est obtenue (e.g., mode réflecteur inférieure à m/z = 5000), et une masse moyenne des valeurs lorsque résolution isotopique ne peuvent être atteints (par exemple, le mode linéaire au-dessus de m/z = 5000),
5. Avant la mise en correspondance le pic de référence correspondant à chaque pic degré sélectionné, veiller à ce qu’un pic approprié cueillette protocole est utilisé en sélectionnant l’onglet traitement .
   NOTE : Protocoles de cueillette de pointe peuvent varier selon résolution spectrale. Pour un calcul de la masse moyenne, le logiciel doit être la masse moyenne dans toute la série des pics isotopiques. Pour un calcul de Masse monoisotopique, le logiciel doit être défini pour calculer la masse exacte d’uniquement le premier pic isotopique.
6. Appliquer la masse de référence dans la liste de contrôle de masse au signal correspondant pour le spectre de masse calibrant en sélectionnant la zone située à gauche du pic d’intérêt, puis en cliquant sur la masse correspondante dans la liste de contrôle à appliquer. Poursuivre le processus pour les sommets de degré restants.
   Remarque : Pour l’étalonnage plus précise et exacte, placer les analyte et calibrant échantillons aussi rapprochées que possible sur la plaque de mire, parce que les subtiles variations de hauteur de plaque cible peuvent affecter la précision de l’étalonnage.
7. Acquérir à nouveau le spectre de l’analyte dès que l’échelle de masse pour les paramètres d’acquisition optimisées ont été calibrés.

4. interprétation et analyse des données

1. Cueillette de pointe
   1. Ouvrir le spectre de l’analyte dans le logiciel d’analyse de données (FlexAnalysis).
   2. Zoom sur un pic pour identifier si la résolution isotopique est parvenue en sélectionnant le bouton Zoom dans l’intervalle-X .
   3. Appuyez sur liste massive de | Trouver pour sélectionner des sommets. Si le pic monoisotopique est résolu, sélectionnez ce premier pic dans la distribution isotopique pour déterminer sa masse en utilisant un protocole de pic-cueillette monoisotopique. Si le pic monoisotopique n’est pas résolu, utilisez une pointe de masse moyenne cueillette protocole et déterminer la masse moyenne de la distribution isotopique ensemble.
   4. Continuer ce pic cueillait des processus pour chaque n-mer dans la distribution de polymère.
2. Calculs d’analyse – groupe polymère caractérisation et fin
   Remarque : Lorsqu’il est utilisé correctement, MALDI-TOF MS peuvent fournir des données utiles et précises pour les calculs de répartition des masses moléculaires de polymères. Il est à noter que les données sur la distribution de masse ne sont exactes que lors de la dispersion de l’échantillon de polymère est relativement faible (p. ex.., environ Đ= 1.3 ou inférieur).
   1. Calculer la masse moléculaire moyenne en nombre, la masse moyenne en ce qui concerne le nombre de moles de chaque fraction de masse, à l’aide de la formule :
      
      où N_j’ai = nombre de molécules de poids moléculaire spécifique et M_j’ai = le poids moléculaire spécifique de ces molécules.
   2. Calculer le poids moléculaire moyen de poids, la masse moyenne en ce qui concerne le poids de chaque fraction massique, selon la formule suivante :
      
      où N _j’ai = nombre de molécules de poids moléculaire spécifique et M _j’ai = le poids moléculaire spécifique de ces molécules.
   3. Une fois que le M_w et_n ont été calculées, quantifier l’ampleur de la distribution de poids moléculaire en utilisant le ratio Mw/m_n qui s’appelle polydispersité, Đ.
   4. La caractéristique plus puissante et unique d’analyse de données de MALDI-TOF MS est la capacité à déterminer ou à confirmer les groupements terminaux des homopolymères. Déterminer le groupe fin en réorganisant la formule suivante pour la masse observée d’un n-mer dans le spectre de masse (M,_n-mer) :
      M_n-mer = n (M_RU ) + M_EG1 + M_EG2 M_ion
      où n = le degré de polymérisation,
      M_EG1 = masse du groupe α-fin,
      M_EG2 = masse du groupe ω-fin,
      M_RU = la masse de l’unité de répétition du polymère,
      et M_ion = masse de l’ion que complexes avec le polymère.

Résultats

Exemple 1 : Un échantillon de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) (Figure 3) a été analysé à l’aide de trifluoroacétate de potassium comme agent cationisation avec LCSS comme matrice. Le spectre expose les attentes des adduits ainsi que ceux observés depuis résiduelle Na⁺K⁺ .

MALDI-TOF MS confirme la distribution étroite (Figure 3) de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000). Parce que le pic de monoisotopique (comprenant exclusivement les plus abondants isotopes élémentaires, à savoir ¹²C, ¹H ¹⁶O et ¹⁴N) n’est pas suffisamment résolu permettre son identification, un protocole de pointe de prélèvement est utilisé que détermine la masse moyenne dans l’ensemble de l’aire de répartition isotopique pour chaque pic n-mer. De même, tous les calculs théoriques sont déterminés au moyen de la moyenne, plutôt que monoisotopique, masses pour chaque élément. Logiciel d’analyse en utilisant les équations de l’étape 4, a été utilisé pour calculer les caractéristiques de la distribution de masse de polymère :_n: 4700, M_w: 4710, Đ: 1,00.

Afin de confirmer l’identité des groupes fin, un n-mer individuel (104) a été sélectionné pour une analyse ultérieure (Figure 4). Comme avec les calculs de répartition des masses, car le pic monoisotopique n’a pas pu être résolu, moyennes massives valeurs ont été utilisées pour les calculs ultérieurs. La valeur de masse théorique de la 104-mer de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique est composée de la masse des unités de répétition (44.0530 × 104) plus la masse du groupe α-aminé fin (+ 16.02300) et de la masse de la ω-fin fonction carboxyle (+ 59.0440) et la masse du cation potassium (+ 39.09775) qui donne une masse totale de 104-mer de 4695.67675. La valeur observée de masse pour les 104-mer + K⁺ est 4695.5 qui correspond à la valeur théorique, compte tenue de la précision des calculs de massives moyennes. La série de plus petits, décalage des pics dans le spectre correspond au polymère ionisant avec sodium où la valeur de masse théorique de la 104-mer se compose de la masse des unités de répétition (44.0530 × 104) plus la masse du groupe α-aminé fin (+ 16.02300) et la masse de la ω-fin fonction carboxyle (+ 59.0440) et la masse du cation sodium (+ 22.98922) donnant une masse totale de 104-mer de 4679.56822. La valeur observée de masse pour les 104-mer + Na⁺ est 4679.4, qui est seulement 0,2 Da différente de la valeur théorique. Déterminations plus précises de la fin du groupe masse peut être déterminé en mesurant la moyenne sur plusieurs sommets et a été discuté ailleurs¹¹.

Le poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) échantillon maintenu sa distribution étroite lorsque sélectivement fonctionnalisés par réaction (Figure 5) avec 2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB) (Figure 6). Le sodium de spectre exposé adduits et LCSS sert de la matrice.

MALDI-TOF MS confirme la distribution étroite (Figure 6) de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) lorsque modifié avec DNFB. Logiciel d’analyse en utilisant les équations de l’étape 4, a été utilisé pour calculer les caractéristiques de la distribution de masse de polymère :_n: 4940, M_w: 4950 Đ: 1,00.

Afin de déterminer si complet fonctionnalisation de la poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) avait eu lieu avec DNFB, un n-mer individuel de la distribution a été sélectionné pour l’analyse (Figure 7). La masse théorique du FPE-104 fonctionnalisé de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique acide réagit avec le 2, 4-dinitrofluorobenzene comprend 44.0530 × 104 (la masse des unités de répétition) + 182.115 (masse du groupe α-aminé réagit avec 2, 4 - dinitrofluorobenzene) + 59.044 (masse du groupe carboxyle) + 22.98922 (masse du cation sodium) = 4845.66022. La valeur observée de masse pour n = 104 est 4845.8 qui est de -0,1 Da différente de la valeur théorique. Cette concordance étroite entre les valeurs théoriques et observés est révélateur d’une modification complète de la matière première au produit, mais plus important encore, l’absence de signaux liés aux matières départ, 4811.72722 et 4855.78022 pour cela gamme de masses, ou tout autres sous-produits confirme la fonctionnalisation sélective quantitative de l’amine. Un second pic est observé à 4823.8 qui correspond à la 103-mer du polymère fonctionnalisé, mais avec la perte du proton sur l’acide carboxylique extrémité groupe que complexes avec un autre ion de sodium avec une masse théorique de 4823.58899 qui a la différence de-0,2 % Da.

Exemple 2 : Un échantillon de polyoxyéthylène bis(azide) (_n = 2000) (Figure 8) a été analysé à l’aide de trifluoroacétate de sodium comme agent de cationisation et LCSS comme la matrice et seulement présentaient les attendus des adduits Na⁺ .

En raison de la résolution obtenue dans cette gamme de masse plus faible, les pics monoisotopique pour chacun de la n-mers pourraient facilement être résolus, et donc un pic de monoisotopique cueillette de protocole a été sélectionné (en moyenne, seul le signal masse du premier pic dans la distribution isotopique ) et tous les calculs correspondants utilisés la Masse monoisotopique de chaque élément. MALDI-TOF MS confirme la distribution étroite (Figure 8) de polyoxyéthylène bis(azide) (_n = 2000). Logiciel d’analyse en utilisant les équations de l’étape 4, a été utilisé pour calculer les caractéristiques de la distribution de masse de polymère :_n: 1940, M_w: 1950, Đ: 1.01.

Afin de confirmer la fin groupe fonctionnalisation, un n-mer individuel (42) a été sélectionné (Figure 9). Comme pour les distributions de masse déterminée ci-dessus, Masse monoisotopique ont été utilisés parce que les pics monoisotopique étaient bien résolues à distribution isotopique de chaque n-mer. La valeur de masse théorique de la 42-mer de polyoxyéthylène bis(azide) correspond à 44.02621 × 42 (la masse des unités de répétition), 42.00922 (masse du groupe azido fin) + 70.04052 (masse du groupe fin azidoethyl) + 22.98922 (masse du cation sodium) = 1984.13978. La valeur observée de masse pour n = 42 est 1983.95 qui est différente de la valeur théorique de 0,19 Da. Il est à noter que surtout à des puissances supérieures de laser, la fonctionnalité de l’azoture peut montrer des fragments métastables ; Toutefois, cela n’a pas été observée dans ce cas précis³¹.

Le bis(azide) de polyoxyéthylène (_n = 2000) échantillon maintenu sa distribution étroite lorsque sélectivement fonctionnalisés par une réaction de cycloaddition de cuivre azoture-alcyne catalysée (Figure 10) avec 1-éthynyl-4-fluorobenzène(EFB) ()Figure 11) pour obtenir un groupe de 4-fluorophenyltriazolyl (FPT). Les spectres expose les attentes des adduits Na⁺ d’utiliser le trifluoroacétate de sodium comme agent de cationisation et LCSS comme la matrice.

MALDI-TOF MS confirme la distribution étroite ()Figure 11) de bis(azide) de polyoxyéthylène (_n = 2000) après la fonctionnalisation avec EFB. Logiciel d’analyse en utilisant les équations de l’étape 4, a été utilisé pour calculer les caractéristiques suivantes de polymère :_n: 2240, M_w: 2250, Đ: 1,00.

Pour confirmer une fonctionnalisation complète de l’échantillon, Masse monoisotopique ont été utilisées pour analyser une n-mer individuel sélectionné (42) (Figure 12). La valeur de masse théorique de la 42-mer de polyoxyéthylène bis(azide) réagit avec 1-éthynyl-4-fluorobenzène correspond à 44.02621 × 42 (la masse des unités de répétition) + 162.04675 (masse du groupe FPT fin) + 190.07805 (masse de le groupe éthyle FPT sur la fin avec 1-éthynyl-4-fluorobenzène) + 22.98922 (masse du cation sodium) = 2224.21484. La valeur observée de masse pour n = 42 est 2224.16 qui est différente de la valeur théorique de 0,05 Da.

Exemple 3 : Un échantillon de lactide, thiol résilié (_n = 2500) (Figure 13) a été analysé à l’aide de trifluoroacétate de sodium comme agent cationisation et seulement présentaient les attendus des adduits Na⁺ et DHB comme la matrice.

MALDI-TOF MS confirme la distribution étroite de lactide, thiol résilié (_n = 2500) (Figure 13). En utilisant les équations de l’étape 4, l’analyse de programme a servi à calculer les caractéristiques de polymère suivantes :_n: 2310, M_w: 2360, Đ: 1.02.

Pour confirmer une fonctionnalisation complète de l’échantillon, Masse monoisotopique ont été utilisées pour analyser une n-mer individuel sélectionné (26) (Figure 14). La valeur de masse théorique de la 26-mer de lactide, thiol résilié (_n = 2500) correspond à 72.02113 × 26 (la masse des unités de répétition), 17.00274 (masse du groupement hydroxyle) + 61.0112 (masse du groupe fin ω-thiol) + 22.98922 (masse du sodium cation) = 1973.55254. La valeur observée de la masse de n = 26 est 1973.62 qui est de -0,07 Da différente de la valeur théorique. Un signal plus faible est observé à 2045.74 ce qui correspond à 72.02113 × 27 (la masse des unités de répétition), 17.00274 (masse du groupement hydroxyle fin) + 61.0112 (masse du groupe fin ω-thiol) + 22.98922 (masse du cation sodium). La masse théorique est 2045.57367 qui est une différence de 0,17 par la masse observée. Cette faible intensité, impaires répéter unité est révélateur de la transestérification lors de l’ouverture de la polymérisation de l’acide lactique du cycle. Un troisième pic très mineur est observée à 2057.73. Il s’agit de -0,14 Da différent que la masse théorique d’un lactide avec un groupe acide carboxylique de la fin (plutôt que le groupe de thiol de fin) d’une masse théorique de 72.02113 × 27 (la masse des unités de répétition) + 17.00274 (masse du groupement hydroxyle fin) + 73.02895 (masse d’acide carboxylique) + 22.98922 (masse du cation sodium) = 2057.59142. Cette souillure mineure supplémentaire est probablement la conséquence de l’initiation de l’eau lors de l’ouverture de la polymérisation du monomère lactide du cycle.

Le lactide, thiol résilié (_n = 2500) échantillon maintenu sa distribution étroite lorsque sélectivement fonctionnalisés par une réaction de thiol-ene (Figure 15) avec maléimide (Figure 16). Les spectres expose les attentes des adduits Na⁺ d’utiliser le trifluoroacétate de sodium comme agent de cationisation et DHB comme la matrice.

MALDI-TOF MS confirme la distribution étroite de la lactide, thiol résilié (_n = 2500) après une réaction de thiol-ene avec maléimide (Figure 16). Logiciel d’analyse en utilisant les équations de l’étape 4, a été utilisé pour calculer les caractéristiques suivantes de polymère :_n: 2310, M_w: 2340, Đ: 1.01. Il est à noter que la diminution de_n et M_w par rapport à la matière première est due à des biais d’ionisation (un des défauts de MALDI-TOF MS). Lorsque la modification pour le matériel de départ est relativement petit (~ 97 Da dans cette modification particulière) et la polydispersité diminue après modification, MALDI-TOF MS calculs de poids moléculaire moyen peuvent devenir moins précis.

Pour confirmer la fonctionnalisation complète de la lactide, thiol résilié (_n = 2500) avec maléimide via une réaction de thiol-ene, Masse monoisotopique ont été utilisées pour analyser une n-mer individuel sélectionné (26) (Figure 17). La valeur de masse théorique du 26-mer de lactide thiol résilié correspond à 72.02113 × 26 (la masse des unités de répétition), 17.00274 (masse du groupement hydroxyle fin) + 158.02757 (masse de ω-thiol fin groupe lié aux maléimide) + 22.98922 (masse de la cation sodium) = 2070.56891. La valeur observée de la masse de n = 26 est 2070.54 qui est différente de la valeur théorique de 0,03 Da. La même espèce ionisant avec du potassium est aussi observée à 2086.49, ce qui correspond à une forme de différence 0,05 Da la masse théorique. Un très petit pic est observé à 2167.58 ce qui correspond à 72.02113 × 28 (la masse des unités de répétition), 17.00274 (masse du groupement hydroxyle fin) + 72.02168 (masse de l’anion carboxylate) + 22.98922 (masse du cation sodium) + 38.96371 (masse du cation potassium). La masse théorique est 2167.56844 qui est un -0,01 différence de la masse observée et est révélateur de l’impureté de trace même de l’initiation de l’eau qui a été observée dans le matériel de départ. Ce polymère pièces ionisation avec un équivalent de sodium, un de potassium et la perte d’un proton. La perte du proton de l’acide carboxylique et complexation avec deux cations est un mode d’ionisation pour polymères fonctionnalisés acides monocarboxyliques commun. Il est important de noter que le même déplacement en masse, ce qui est observé pour les produits de réaction de thiol-ene ne se produit pas pour ce composé se terminant par acide carboxylique qui indique également qu’il n’avait pas le groupe thiol de fin de se soumettre à la réaction de fonctionnalisation.

Figure 1:3 x 3 grille pour détermination du ratio échantillon. À l’aide d’une grille de 3 x 3 des échantillons, les concentrations relatives de matrice cationisation agent-analyte systématiquement réglable pour déterminer empiriquement une préparation optimisée. Ceci est généralement fait en tenant une de la constante de trois variables (15 µL de solution d’analyte) tout en augmentant le montant des deux autres (agent de cationisation (axe y) et la matrice (axe x)) composants par un jeu multiple (3 fois dans l’exemple représenté). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : plaque de mire MALDI-TOF MS. La plaque de mire MALDI-TOF MS est une plaque de métal qui maintient les échantillons MALD-TOF MS en puits individuels pour l’analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : spectre de masse MALDI-TOF de l’échantillon 1. Cette gamme complète montre la distribution globale de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n= 5000) ionisés avec Na⁺ et K⁺. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : spectre de masse MALDI-TOF d’une unité individuelle de répétition de l’exemple 1. Ce spectre présente une unité individuelle de répétition de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) pour l’analyse du groupe fin. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : schéma réactionnel pour la modification de l’échantillon 1. Pour confirmer les groupes fin des matières premières, poly(ethylene glycol) 2-aminoéthyl éther acétique acide réagit avec 2, 4-dinitrofluorobenzene (également connu sous le nom réactif de Sanger). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : spectre de masse MALDI-TOF de modification de l’échantillon 1. Cette gamme complète montre la distribution globale de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) fonctionnalisé avec 2, 4-dinitrofluorobenzene. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : spectre de masse MALDI-TOF d’une unité individuelle de répétition de l’échantillon 1modification. Afin de confirmer la fin groupe fonctionnalisation, ce spectre présente une unité individuelle de répétition de poly (éthylène glycol) 2-aminoéthyl éther acétique (_n = 5000) après réaction avec le 2, 4-dinitrofluorobenzene. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : spectre de masse MALDI-TOF de l’échantillon 2. Cette gamme complète montre la distribution globale de polyoxyéthylène bis(azide) (_n = 2000) ionisés avec Na⁺ adduits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : spectre de masse MALDI-TOF d’une unité individuelle de répétition de l’exemple 2. Ce spectre présente une unité de répétition de bis-azide de polyoxyéthylène (_n = 2000) afin de confirmer les groupements terminaux s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : schéma réactionnel pour la modification de l’exemple 2. Pour confirmer les groupes fin le départ matière, polyoxyéthylène bis-azoture (_n = 2000) a fait réagir avec 1-éthynyl-4-fluorobenzène par une cycloaddition d’azoture-alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : spectre de masse MALDI-TOF de modification de l’exemple 2. Cette gamme complète montre la distribution globale de polyoxyéthylène bis(azide) (_n = 2000) fonctionnalisé avec 1-éthynyl-4-fluorobenzène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : spectre de masse MALDI-TOF d’une unité individuelle de répétition de la modification de l’exemple 2. Ce spectre présente une unité individuelle de répétition de polyoxyéthylène bis(azide) (_n = 2000) réagit avec 1-éthynyl-4-fluorobenzène, par l’intermédiaire de cuivre azoture-alcyne catalysée par cycloaddition pour confirmer fin groupe fonctionnalisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 13 : spectre de masse MALDI-TOF d’échantillon 3. Cette gamme complète montre la distribution globale de lactide, thiol résilié (_n = 2500). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 14 : spectre de masse MALDI-TOF d’une unité individuelle de répétition de l’exemple 3. Le spectre présente une unité individuelle de répétition du lactide, thiol résilié (_n = 2500) pour confirmer les groupements terminaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 15 : schéma réactionnel pour la modification de l’exemple 3. Pour confirmer les groupes fin du produit de départ, lactide, thiol résilié (_n = 2500) réagit avec le maléimide via un couplage thiol-ene. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 16 : spectre de masse MALDI-TOF de modification de l’exemple 3. Cette gamme complète montre la répartition globale du produit de la réaction entre le lactide, thiol résilié (_n = 2500) et maléimide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 17 : spectre de masse MALDI-TOF d’une unité individuelle de répétition de la modification de l’exemple 3. Afin de confirmer la fin groupe fonctionnalisation, ce spectre présente une unité individuelle de répétition du lactide, thiol résilié (_n = 2500) après la réaction de thiol-ene avec maléimide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Spectrométrie de masse MALDI-TOF est un outil inestimable analytique pour la caractérisation des polymères en raison de sa capacité à générer des ions polymères à l’État chargé individuellement et avec fragmentation minime. Cette technique d’ionisation douce utilise des impulsions courtes pour désorber des échantillons à l’état solide de l’analyte de polymère noyées dans une matrice composée pour générer des ions de polymère en phase gazeuse. Les macromolécules sont généralement ionisés par complexation avec les cations qui sont ajoutés à la matrice pour permettre leur analyse par spectrométrie de masse. Ces ions macromoléculaires sont ensuite accélérées par une tension d’extraction pour les amener dans la région de champ sans le tube de vol qui permettent leur m/z à déterminer basé sur leur temps de vol entre la source d’ions et le détecteur^{5 , 32}.

Par rapport à d’autres techniques de caractérisation de polymère, qualité de spectres de MALDI-TOF MS est fortement tributaire de paramètres d’acquisition de données et de préparation des échantillons. Bien qu’il n’y a pas de formule établie pour la préparation de l’échantillon, comprendre la fonction de chaque composant de la préparation de l’échantillon permet d’optimisation empirique plus rapide. Le facteur le plus important dans la préparation de l’échantillon MALDI est la sélection de la matrice car la compatibilité de la matrice avec l’analyte de polymère est critique pour permettre à matrice excité générer des macromolécules unique, désorbés dans un État ionisé^{5, 15,17,19}. Une fois que les agents appropriés de matrice et de cationisation ont été sélectionnés, le rapport correct de l’analyte, la matrice et cationisation agent doit être déterminé. Ceci peut être réalisé de façon empirique en créant une grille à deux dimensions des échantillons (Figure 1) sur la plaque de mire MALDI-TOF MS (Figure 2) avec l’augmentation de la concentration de la matrice sur un axe et augmentation de la concentration d’agent de cationisation sur la autres.

Similaire à la préparation de l’échantillon MALDI, il n’y a pas de formule établie pour la détermination des paramètres d’acquisition de données ; Cependant, certaines tendances envisagera d’accélérer spectrale optimization. Mode réflectron, ce qui augmente la résolution, mais diminue le signal global, est généralement choisi pour les gammes inférieures massives (dans ces exemples, au-dessous de 4 000 Da) où isotopique résolution peut être obtenue. Dans ces cas, calculs de Masse monoisotopique et PIC cueillette des méthodes ont été utilisées. Pour les échantillons de polymère avec des masses au-dessus de 4 000 Da, mode linéaire a été utilisé avec des calculs de massives moyennes et pointe des méthodes de cueillette. Pour améliorer la résolution du signal, il convient de modifier la tension de source d’ions par petits incréments avec la tendance générale de plus grands Polymères de massives ayant une plus grande tension différentielle (IS1 versus IS2).

Certain temps optimisé acquisition et préparation des échantillons paramètres peuvent fournir de précision, exactitude de masse n’est possible que par le biais de calibrage efficace. Le temps de vol pour une masse donnée peut varier subtilement en ce qui concerne les paramètres d’acquisition variable et les positions de la même plaque, donc un étalonnage doit se faire pour chaque jeu de paramètres d’acquisition optimisée afin de donner la masse exacte déterminations^5,30. Une fois que les paramètres d’acquisition et de la préparation de l’échantillon ont été optimisés, le spectre doit être étalonné à l’aide de ces mêmes conditions exactes.

En raison de la résolution exceptionnelle et une précision masse observées dans les spectres de masse MALDI-TOF optimisées des polymères, cette technique est devenue un outil gratuit permettant de déterminer les données de répartition des masses moléculaires de polymères. Cependant, sa capacité à résoudre des unités de répétition individuelles au sein de la distribution de masse polymère fournit un avantage particulier pour l’analyse du groupe fin par rapport à d’autres polymères techniques de caractérisation comme la chromatographie par perméation de gel (GPC) et nucléaire résonance magnétique (RMN). Ceci est particulièrement utile pour la détermination de la fidélité des réactions de fonctionnalisation groupe fin et la nature quantitative de réactions de conjugaison pour le groupe fin. Ce manuscrit a démontré sa capacité à résoudre la masse des unités de répétition de polymère individuels avec jusqu'à deux points de décimales de précision de masse, permettant la confirmation des modifications du groupe fin avec un niveau de confiance élevé. Les progrès considérables qui ont été faites récemment dans le domaine de la synthèse de polymère de précision, MALDI-TOF MS devient un outil de plus en plus important pour déterminer la structure macromoléculaire et fonctionnalité.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000)	MilliporeSigma (Aldrich)	689696	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en&region=US
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000)	MilliporeSigma (Aldrich)	757918	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en&region=US
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500)	MilliporeSigma (Aldrich)	747386	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide low	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	PFS20	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide medium	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	PFS21	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide high	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	PFS22	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en&region=US
2,4 dinitrofluorobenzene	TCI	A5512
maleimide	MilliporeSigma (Aldrich)	129585	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en&region=US
1-ethynylfluorobenzene	Fisher Scientific	766-98-3
triethylamine	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	471283	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en&region=US
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine	MilliporeSigma (Aldrich)	369497	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en&region=US
Copper(I)Bromide	MilliporeSigma (Aldrich)	254185	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en&region=US
glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38212
sodium metabisulfite	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	13459	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en&region=US
potassium trifluoroacetate	MilliporeSigma (Aldrich)	281883	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en&region=US
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile	MilliporeSigma (Aldrich)	727881	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en&region=US
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid	MilliporeSigma (Sigma)	C8982	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en&region=US
tetrahydrofuran	Fisher Scientific	T425-1
dichloromethane	VWR Analytical	BDH1113-4LG