Caracterização de Polímeros Sintéticos via Espectrometria de Massa por Ionização a Laser com Matriz Assistida por Tempo de Voo (MALDI-TOF)

Resumo

Um protocolo para o tempo de ionização de dessorção do laser assistida por matriz de caracterização de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) de polímeros sintéticos é descrita, incluindo a otimização da preparação da amostra, espectral aquisição e análise de dados de voo.

Resumo

Existem muitas técnicas que podem ser empregadas na caracterização de homopolímeros sintéticos, mas poucos fornecem tão útil de informações para análise de grupo final como tempo de ionização de dessorção do laser assistida por matriz de espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF-MS). Este tutorial demonstra métodos para otimização da preparação amostra, aquisição espectral, e análise de dados de polímeros sintéticos, usando parâmetros críticos de MALDI-TOF MS. durante a preparação da amostra incluem a seleção da matriz, identificação de um sal de cationization apropriado e ajuste as proporções relativas da matriz, cação e analito. Os parâmetros de aquisição, tais como o modo (linear ou refletor), polarização (positiva ou negativa), tensão de aceleração e tempo de atraso, também são importantes. Espectros dado algum conhecimento da química envolvida na síntese do polímero e otimizando tanto os parâmetros de aquisição de dados e as condições de preparação de amostra, devem ser obtidos com precisão em massa e resolução suficiente para permitir a inequívoca determinação dos grupos final da maioria dos homopolímeros (massas abaixo de 10.000), além da unidade de repetição em massa e a distribuição de peso molecular geral. Embora demonstrado em um conjunto limitado de polímeros, estas técnicas gerais são aplicáveis a uma gama mais ampla de polímeros sintéticos para determinar a distribuição em massa, apesar de determinação de grupo final só é possível para homopolímeros com dispersity estreita.

Introdução

Com melhorias em visitas técnicas de polimerização, polímeros de precisão com grupos quantitativamente funcionalizados final são cada vez mais disponível¹. O desenvolvimento simultâneo de azida-alquino e thiolene clique químicas permitiu o acoplamento quase quantitativo de macromoléculas para outras partes, fornecendo acesso a uma gama de híbridos materiais^2,3,4 . No entanto, são necessárias técnicas de analíticas precisas para caracterizar tanto a partida materiais e produtos destas reações de conjugação de polímero. Tempo de dessorção/ionização do laser assistida por matriz de espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF MS) é uma técnica analítica de ionização suave valioso para caracterizar polímeros porque pode gerar íons de polímero em um estado de carga única com mínimo fragmentação de^5,6. MALDI-TOF MS tem grandes vantagens sobre outros métodos convencionais de caracterização de polímeros, porque pode fornecer espectros de massa com resolução da n-mers individuais dentro da distribuição em massa de polímero. Como consequência, tais espectros de massa pode fornecer informações precisas sobre o peso molecular médio, repita a unidade de massa e peso molecular dispersity⁷, que por sua vez pode elucidar mecanismos de polimerização concorrentes tais como transferência de cadeia⁸ . No entanto, MALDI-TOF MS é particularmente poderoso para fornecer informações sobre o polímero final grupos^9,10, que pode ser usado para confirmar o final grupo modificações^10,11 e outros transformações¹² como polímero cyclizations^11,13. Igualmente importante, a relativamente pequena quantidade do analito (submicrogramas) necessários para espectrometria de massa análise torna esta técnica útil para a caracterização, quando somente quantidades de traço de material estão disponíveis.

A análise de MALDI-TOF MS de polímeros pode ser dividida em quatro etapas distintas: preparação, calibragem, aquisição espectral e análise dos dados da amostra. Preparação da amostra é o mais essencial passo para gerar otimizado de espectros de massa MALDI-TOF e ocorre antes que a amostra é introduzida o instrumento^14,15. A seleção de um apropriado matriz com parâmetros de solubilidade semelhantes como o analito de polímero é fundamental para obter espectros de massa MALDI-TOF da alta qualidade e diretrizes para a seleção da matriz têm sido relatados em outros lugares^{14,15, 16,17}. Um banco de dados de polímero MALDI "receitas" para a preparação da amostra também foi publicado on-line¹⁸. Para polímeros romance, seleção de matriz pode ser abordada primeiro compreender a solubilidade do polímero e selecionando uma matriz com solubilidade similares parâmetros^14,19. Polímeros com afinidade protônica alta podem ser protonados pela maioria das matrizes¹⁴ (que frequentemente contêm grupos carboxila), mas para outros polímeros, um agente de cationization é necessário¹⁴. Íons alcalinos aduto bem com oxigênio-contendo espécies (EG. poliésteres e poliéteres), Considerando que hidrocarbonetos insaturados (ex. poliestireno) aduto com metais de transição como íons de prata e cobre^{14, 19}. porque as amostras de polímero neste experimento continham átomos de oxigênio na espinha dorsal, de sódio ou potássio contra-íons (TFA) foram usados como o agente cationization. Uma vez que os agentes de matrix e cationization foram selecionados, as proporções relativas de analito, agente cação e matriz devem ser cuidadosamente otimizadas para garantir alto sinal de ruído. Neste procedimento, os parâmetros para a preparação da amostra já foram otimizados, no entanto um procedimento de otimização de amostra empírica (passo 1.4.1., Figura 1) que varia sistematicamente as concentrações dos três componentes (analito, cações e matriz) é eficaz para determinar rapidamente suas proporções ideais.

Aquisição de dados também exige a otimização de um número de parâmetros. Os parâmetros mais importantes incluem o modo de íon positivo ou negativo do aparelho, o modo de operação do instrumento (linear versus refletor), a tensão de aceleração e o tempo de atraso de extração. Outra forma que a resolução pode ser aumentada é através da utilização de "reflectron" modo^20,21,22,23. Reflectron modo essencialmente duplica a trajetória dos íons ao detector refletindo os íons na extremidade do tubo de voo para um detector perto da fonte enquanto reorientação íons com diferentes ímpetos, e, portanto, aumentando a resolução embora diminuindo a intensidade do sinal. Além disso, espectros de resolução mais elevados podem ser obtidos, diminuindo a potência do laser que minimiza a relação sinal-ruído, diminuindo o número e a energia das colisões e, portanto, reduzindo a fragmentação e heterogeneidades cinética²⁴. Por tuning todos esses parâmetros, os íons podem ser focados para minimizar o efeito de qualquer homogeneidade na posição inicial ou a velocidade que ocorre durante o processo de dessorção do laser. Quando os parâmetros de aquisição são otimizados, resolução isotópica muitas vezes pode ser alcançada para íons com massas superiores a 10.000 Da, embora este também é dependente do comprimento do tubo de voo e o design do instrumento. Mais orgânicos compostos que contêm pelo menos um heteroátomo são propensos a complexantes com cátions alcalinos, tais como lítio, sódio e potássio. Muitos dos metais alcalinos são monoisotopes ou isótopos limitado e, portanto, não ampliar a distribuição.

Enquanto os parâmetros do instrumento podem ser ajustados para otimizar a precisão de dados, precisão dos dados só é alcançado com uma calibração adequada¹¹. Proteínas e peptídeos foram originalmente usados como calibrants devido à sua monodispersity e disponibilidade, mas sofrem de estabilidade variável e a prevalência de impurezas²⁵. Alternativas mais rentáveis e estáveis incluíram aglomerados inorgânicos e polydisperse polímeros^26,,^27,28,29. Infelizmente, estes apresentam alternativas dispersar massas, que complicam atribuições em massa, bem como massas menores, em geral, tornando-os úteis apenas para calibrações abaixo de 10.000 Da. Para combater estes problemas, Grayson et al. ²⁵ desenvolveu um sistema de calibração MS baseado em dendrímeros, poliéster que é monodisperso e possui tanto ampla matriz e solvente compatibilidade, estabilidade de vida útil (> 8 anos) e menor custo de produção. Com base nos pontos fortes deste sistema, foi selecionado como o calibrant para estas experiências.

Existem dois tipos principais de calibração: interno e externo de³⁰. Quando calibrar externamente, um padrão com massas que suporte isso do analito são colocados sobre a placa de destino MALDI numa posição diferente da amostra que o analito para gerar um espectro de massa separado do qual pode ser gerado um arquivo de calibração. Por outro lado, maior precisão, muitas vezes pode ser conseguido com uma calibração interna, que envolve a mistura de calibrant com o analito para obter um espectro de híbrido com sinais de calibrant e de analito. O procedimento descrito abaixo, foi implementada uma calibração externa. Após a calibração adequada da escala maciça, podem ser adquiridos em massa dados precisos do analito. Para garantir a calibragem mais precisa, é importante que a aquisição de dados ocorre logo após a calibração.

Finalmente, uma vez calibrado o otimizado, conjuntos de dados foram adquiridos, e os dados foram analisados para fornecer informações estruturais sobre os exemplos de polímero. O espaçamento entre n-mers dentro da distribuição do polímero pode fornecer uma medida exata da unidade de repetição em massa. O número de massa molecular média (M_n) e outros cálculos de distribuição de massa (por exemplo, M_w (peso molecular médio de peso) e Đ (dispersity)) também pode ser determinada a partir da distribuição do sinal no espectro de massa ( Passo 4.2 para cálculos). Talvez mais excepcionalmente, no caso de homopolímeros, a soma das massas do grupo da final pode ser confirmada por determinar o deslocamento da distribuição do polímero com relação a massa das unidades de repetição sozinhos. Os espectros de massa MALDI-TOF ricos em informação fornecem dados valiosos de caracterização que são complementares às técnicas de caracterização de polímeros mais tradicionais tais como cromatografia de exclusão, espectroscopia de infravermelho-transformada de Fourier, e ressonância nuclear magnética.

Protocolo

Atenção: Todas as reações foram executadas em uma coifa. Por favor, leia todo Material segurança dados folhas (MSDS) para qualquer produto químico usado e tomar as devidas precauções.

1. preparação da amostra

1. Preparação das soluções estoque matriz
   1. Dissolva 20 mg de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (HCCA) em 1 mL de tetrahidrofurano instabilizados (THF) e vórtice até dissolver.
   2. Dissolva 20 mg de ácido benzoico-2,5 (DHB) em 1 mL de THF e vórtice até dissolver.
2. Preparação da solução-mãe do alcaloide cação
   1. Dissolva 2 mg de sódio contra-íons (NaTFA) em 1 mL de THF e vórtice até dissolver.
   2. Dissolva 2 mg de potássio contra-íons (KTFA) em 1 mL de THF e vórtice até dissolver.
3. Preparação das soluções estoque de analito
   1. Exemplo 1: Dissolver 2 mg de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético (M_n = 5000) em 0,5 mL de THF e vórtice até dissolver.
   2. Exemplo 2: Dissolver 2 mg de bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000) em 0,5 mL de THF e vórtice até dissolver.
   3. Exemplo 3: Dissolver 2 mg de poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) em 0,5 mL de THF e vórtice até dissolver.
4. Preparação de misturas de amostra para análise
   1. Prepare uma série de soluções através da mistura de solução de matriz, o analito e o cátion enquanto variando as proporções relativas dos componentes, tal que as misturas de nove amostras originais são feitas. Por exemplo, manter a quantidade de constante de solução-mãe de matriz adicionado (EG., 10 µ l), variar a quantidade de solução de analito por um fator de três (EG., 45, 15 e 5 µ l), enquanto também, variando a quantidade de solução de cação por um fator de três (ex. ., 9, 3 e 1 µ l). Estas amostras efetivamente produzem uma grade de 3x3 de amostras com as duas variáveis de concentração diferente em x e y eixos (Figura 1).
   2. Para o exemplo representativo, combine 15 µ l da solução de poly(L-lactide), com 15 µ l da solução DHB e 1 µ l da solução NaTFA.
   3. Adicionar 1 μL de cada mistura de solução em uma amostra individual bem sobre a placa-alvo MALDI (Figura 2). Adicione as amostras incrementalmente em pequenas porções para evitar que a amostra fluindo para fora do poço de amostra, permitindo que cada alíquota evaporar a seco antes de adicionar a amostra adicional.
      Nota: Para maior ponto de ebulição de solventes, uma pistola de ar pode ser necessária para acelerar a evaporação do solvente, mas cuidado deve ser usado para evitar o aquecimento da placa da amostra, que pode causar a placa para dobra.
5. Preparação de amostras-padrão para calibração
   1. Prepare os padrões de calibração usando o protocolo fornecedor sugerido.
      Nota: Foram selecionados para este estudo dendrímeros calibrants e estão disponíveis como os puros dendrímeros ou pré-misturado com matrix, calibrant e cação em rácios otimizados.

2. otimização de aquisição de dados

1. Iniciando a aquisição de dados
   1. Abra o software de aquisição de dados "FlexControl".
   2. Ejete a plataforma para permitir o carregamento da placa alvo pressionando o "" botão.
   3. Coloque delicadamente a placa-alvo com as amostras de calibrant e analito carregadas na plataforma na orientação adequada.
   4. Use o software de aquisição para injetar a placa-alvo na plataforma, pressionando o "" novo botão.
   5. Selecione um método de aquisição de dados apropriado (método de aquisição de modo positivo) pressionando arquivo | Selecione o método.
      Nota: Para a maioria das amostras de polímero, incluindo nossos representante analitos, ionização está prevista através de complexação com um cátion e, portanto, um método de aquisição de modo positivo é mais adequado. Dependendo do instrumento, para intervalos de massa inferiores (500-10.000 Da) ou quando a resolução maior é desejada, selecione um arquivo de método de modo reflector. Para maior peso molecular amostras ou quando a maior sensibilidade do sinal é necessária e baixa resolução é aceitável, selecione um arquivo de método de modo linear.
   6. Antes da aquisição de dados, certifique-se de um conjunto adequado de massa para a coleta de dados é selecionado-idealmente que o intervalo de massa metade da menor massa incluirá a distribuição esperada, bem como dobrar a massa mais alta na distribuição esperada. Verificar isso clicando na guia detecção e visualização Intervalo de massa.
      Nota: Isso ajuda a garantir aquele sinal de fragmentos de degradação de peso molecular mais baixos ou mais alto peso molecular agregados (dímero) que possam estar presentes na amostra estão incluídos no conjunto de dados. Além disso, observe que oligómeros de matriz são frequentemente notados com intensidades de sinal elevado na maioria dos espectros de massa MALDI-TOF, fornecendo o ruído de alta intensidade com massas tão altas quanto Da 1.000, complicando a análise abaixo esta massa. Embora a calibração será necessário antes de obter um conjunto de dados final, um arquivo de calibração precisa só pode ser adquirido se parâmetros de aquisição idênticos são usados como aqueles otimizado para o analito específico. Portanto, uma otimização preliminar do espectro de massa do analito é necessário antes da calibração, seguida pela reaquisição de um espectro de massa do analito calibrado.
2. Aquisição de dados preliminares
   1. O software de aquisição, selecione a posição da placa de destino que corresponde ao analito desejado.
   2. Inicie a coleta de dados ao mover o alvo do laser ao redor da amostra para maximizar o sinal. Para iniciar a coleta de dados, pressione Iniciar.
      Nota: O laser pode esgotar a matriz em uma localidade específica após a amostragem repetida.
   3. Usando a barra deslizante no lado esquerdo da janela da câmera, ajuste a potência do laser, tal que a potência mínima necessária para obter uma resolução isotópica é alcançada.
      Nota: Ao analisar várias amostras para confirmar a proporção ideal de analito, cação e matriz, use a mesma potência do laser em cada uma das amostras de analito para determinar qual amostra apresenta a melhor relação sinal/ruído para os parâmetros de aquisição. Continue a otimização de aquisição futura com a amostra que aparece para expor o melhor sinal à relação de ruído.
3. Otimização de aquisição de dados
   1. Zoom em um pico individual no meio da faixa de massa de interesse, otimizar a resolução ajustando a diferença em tensões de aceleração (para os instrumentos neste estudo, isto envolve o ajuste o valor de "IS2"), que é o espectrômetro guia.
      Nota: Isto mais rapidamente é otimizado, variando o valor de IS2 em grandes passos, tomando nota de que o valor gera a melhor resolução (i. e., o menor completa a largura do pico a meia intensidade de sinal máximo) e em seguida, otimizando ainda mais em passos menores de o valor de IS2. Normalmente, o valor ideal de IS2 é maior (mais perto IS1) para polímeros de massa baixos e inferior para a massa de altos polímeros.
   2. Se desejar, aumente a resolução usando o modo reflectron.
      Nota: Reflectron modo permite a compensação de discrepâncias na velocidade inicial de íons do mesmo m/z , forçando os íons de velocidade mais elevados do mesmo valor m/z em um caminho mais longo para o detector. Este aumento no caminho para o detector permite que íons mais lentos do mesmo valor de m/z chegam ao detector simultaneamente, efetivamente, focando os íons para maior resolução. Embora reflectron modo tipicamente melhora a resolução do sinal, para amostras com intensidade de sinal fraco, modalidade linear pode ser necessário a fim de visualizar os dados.
   3. Finalmente, otimizar a potência do laser, reduzindo a potência do laser mais baixa possível enquanto ainda gerando um sinal razoável à relação de ruído (ex., o sinal à relação de ruído de aproximadamente 10).
      Nota: Porque maiores potências do laser, geralmente, reduzem a resolução e podem induzir a fragmentação, os espectros de massa com melhor qualidade são adquiridos usando o poder do laser reduzida, mas um número maior de exames.
   4. Uma vez que os parâmetros de aquisição são otimizados, salve os espectros de massa não calibrados, selecionando o arquivo e, em seguida, Salvar o espectro de arquivo como. Para calibração externa, uma nova aquisição do calibrant sob esses parâmetros idênticos, otimizados deve ser efectuada antes de uma nova aquisição é iniciada para gerar o espectro de massa calibrado do analito.

3. MALDI calibração

1. Aquisição do espectro de massa de calibração
   1. Usando os parâmetros de aquisição já otimizados para o analito, adquira um espectro otimizado em massa da amostra de padrões em massa.
      Nota: Idealmente, o conjunto de calibração deve incluir um padrão acima da faixa de interesse, um abaixo e pelo menos um na faixa de interesse. A exatidão da calibração é melhor se todos os parâmetros de aquisição são idênticos para ambas as amostras.
2. Criar um arquivo de calibração
   1. Certifique-se que qualquer calibração existente é anulada ou em posição de ser sobrescritos pressionando Invalidar a calibração sob o espectrômetro guia.
   2. Usando os mesmos parâmetros de aquisição (EG., poder, tensão IS2 laser), passar o laser para o poço de amostra contendo o calibrant (EG., padrão, peptídeo dendrímeros) selecionando o correspondente bem com o cursor e adquirir um espectro, pressionando Iniciar.
3. Uma vez que adquiriu sinal suficiente, pressione começar para terminar a aquisição de dados.
4. Uma vez que adquiriu um espectro de massa da calibrant, selecione o menu dropdown de Lista de controle de massa na guia de calibração que corresponde a esse padrão de calibração. A lista de controle de massa adequado terá as massas de referência do calibrant selecionado com o cátion apropriado.
   Nota: Estas devem estar disponíveis ao fornecedor de calibrant e certifique-se de usar os valores de massa monoisotópico quando resolução isotópica é alcançada (EG., modo reflector abaixo m/z = 5000), e uma massa média quando os valores isotópica resolução Não pode ser alcançado (por exemplo, o modo linear acima m/z = 5000),
5. Antes de combinar o pico de referência correspondentes a cada pico de calibrant selecionado, certifique-se de que um pico apropriado escolher protocolo está sendo usado, selecionando a guia de processamento .
   Nota: Os protocolos de colheita do pico podem variar de acordo com resolução espectral. Para um cálculo da massa médio, o software deve tomar a massa média em toda a série dos picos isotópicas. Para um cálculo de monoisotópico em massa, o software deve ser definido para calcular a massa exata de somente o primeiro pico isotópica.
6. Aplica a massa de referência de lista de controle de massa para o sinal correspondente para o espectro de massa calibrant selecionar a área à esquerda do pico de interesse e clicando sobre a massa correspondente na lista de controlo para aplicar. Continue o processo para os restantes picos de calibrant.
   Nota: Para a calibragem mais exata e precisa, coloque as amostras do analito e calibrant tão próximos quanto possível sobre a placa-alvo, porque sutis variações na altura do prato de destino podem afetar a exatidão da calibração.
7. Readquirir o espectro da substância a analisar, uma vez que a escala de massa para os parâmetros de aquisição otimizada foram calibrados.

4. interpretação e análise de dados

1. Pico de colheita
   1. Abra o espectro de analito do software de análise de dados (FlexAnalysis).
   2. Zoom em um pico para identificar se isotópica resolução foi conseguida, selecionando o botão de Zoom no intervalo de X .
   3. Pressione lista de massa | Encontrar para selecionar picos. Se o pico monoisotópico é resolvido, selecione este primeiro pico na distribuição isotópica para determinar sua massa usando um protocolo de pico-colheita monoisotópico. Se não for resolvido o pico monoisotópico, use um pico de massa médio, escolher o protocolo e determinar a massa média da distribuição isotópica inteira.
   4. Continue este pico escolhendo o processo para cada n-mer na distribuição do polímero.
2. Cálculos de análise caracterização e participante do grupo polímero
   Nota: Quando usado corretamente, MALDI-TOF MS pode fornecer dados valiosos, precisos para cálculos de distribuição em massa de polímeros. Note-se que dados de distribuição em massa só são precisos quando o dispersity da amostra do polímero é relativamente baixa (EG., aproximadamente Đ= 1.3 ou abaixo).
   1. Calcule o peso molecular médio número, a massa média em relação ao número de moles de cada fração em massa, usando a fórmula:
      
      onde N_eu = número de moléculas de peso molecular específico e M_eu = o peso molecular específico dessas moléculas.
   2. Calcule o peso molecular médio do peso, a massa média em relação ao peso de cada fração em massa, usando a fórmula:
      
      onde N _eu = número de moléculas de peso molecular específico e M _eu = o peso molecular específico dessas moléculas.
   3. Uma vez que tanto a M_w e M_n foram calculados, quantificar a amplitude da distribuição do peso molecular, usando a relação Mw/m_n que é chamado de dispersity, Đ.
   4. A característica mais única e poderosa de análise de dados de MALDI-TOF MS é a capacidade de determinar ou confirmar os grupos fim de homopolímeros. Determine o fim de grupo rearranjando-se a seguinte fórmula para a massa observada de um n-mer no espectro de massa (M_n-mer):
      M de_mer-n = n (M_RU ) M_EG1 + M_EG2 + M_íon
      onde n = grau de polimerização,
      M_EG1 = massa do grupo α-fim,
      M_EG2 = massa do grupo ω-fim,
      M_RU = a massa da unidade de repetição do polímero,
      e M_íon = massa do íon que complexos com o polímero.

Resultados

Exemplo 1: Uma amostra de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido (M_n = 5000) (Figura 3) foi analisada usando contra-íons de potássio como um agente cationization com HCCA como a matriz. O espectro exibiu a esperada K⁺ adutos bem como aqueles observados de residual at⁺.

MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita (Figura 3) de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido (M_n = 5000). Porque o pico de monoisotópico (que compreende exclusivamente os mais abundantes elementais isótopos, ou seja ¹²C, ¹H ¹⁶O e ¹⁴N) não é suficientemente resolvido para permitir a sua identificação, é usado um protocolo de pico de escolha que determina a massa média em toda a distribuição isotópica inteira para cada pico de n-mer. Da mesma forma, todos os cálculos teóricos são determinados usando a média, ao invés de monoisotópico, massas para cada elemento. Utilizando as equações da etapa 4, software de análise foi usado para calcular as seguintes características da distribuição em massa do polímero: M_n: 4700, M_w: 4710, Đ: 1,00.

A fim de confirmar a identidade dos grupos final, um n-mer individual (104) foi selecionado para posterior análise (Figura 4). Como com os cálculos de distribuição em massa, porque o pico de monoisotópico não pôde ser resolvido, valores médios de massa foram usados para cálculos posteriores. O valor teórico de massa do mer-104 de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido é composto pela massa das unidades de repetição (44.0530 × 104) e mais a massa do α-amino grupo final (+ 16.02300) e a massa do grupo final ω-carboxila (+ 59.0440), mais o massa do cátion potássio (+ 39.09775) que produz uma massa total 104-mer de 4695.67675. O valor observado em massa para o mer-104 + K⁺ é 4695.5, que corresponde ao valor teórico, dado a precisão dos cálculos de massa médias. A série de picos menores, deslocamento do espectro corresponde ao polímero ionizantes sódicas, onde o valor teórico de massa do mer-104 é composto pela massa das unidades de repetição (44.0530 × 104) mais a massa do grupo α-amino extremidade (+ 16.02300), mais o massa do grupo final ω-carboxila (+ 59.0440) mais a massa do cátion sódio (+ 22.98922), dando uma massa total 104-mer de 4679.56822. O valor observado em massa para o mer-104 + nd⁺ é 4679.4 que é apenas 0,2 Da diferente do valor teórico. Determinações mais precisas do fim do grupo massa pode ser determinada medindo-se a média em vários picos e tem sido discutido em outra parte¹¹.

O poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético (M_n = 5000) amostra mantida sua distribuição estreita quando seletivamente acrescida pela reação (Figura 5), com 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) (Figura 6). O sódio de espectro exibido adutos e usado HCCA como a matriz.

MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita (Figura 6) de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido (M_n = 5000) quando modificado com DNFB. Utilizando as equações da etapa 4, software de análise foi usado para calcular as seguintes características da distribuição em massa do polímero: M_n: 4940, M_w: 4950 Đ: 1,00.

A fim de determinar se completa functionalization do poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido (M_n = 5000) tinha ocorrido com DNFB, um n-mer individual da distribuição foi selecionado para análise (Figura 7). A massa teórica do funcionalizados 104-mer de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido reagiu com 2,4-dinitrofluorobenzene é composto de 44.0530 × 104 (a massa das unidades de repetição) + 182.115 (massa do grupo α-amino reagiu com 2,4 - dinitrofluorobenzene) + 59.044 (massa do grupo carboxila) + 22.98922 (massa de cátion sódio) = 4845.66022. O valor observado em massa para n = 104 é 4845.8 que é-0.1 Da diferente do valor teórico. Este acordo próximo entre os valores observados e teóricos é indicativo de uma modificação completa da matéria-prima ao produto, mas mais significativamente, a falta de sinais associados com matérias-primas, 4811.72722 e 4855.78022 por isso intervalo de massa ou qualquer adicionais subprodutos confirma o quantitativo functionalization seletiva de amina. Um segundo pico é observado em 4823.8, que corresponde a 103-mer do polímero funcionalizado, mas com a perda do próton sobre o ácido carboxílico final grupo que complexos com outro íon de sódio com uma massa teórica de 4823.58899 que tem a diferença de-0.2 Da.

Exemplo 2: Uma amostra de bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000) (Figura 8) foi analisada usando contra-íons de sódio como um agente cationization e HCCA como a matriz e só exibiu o esperado adutos at⁺ .

Por causa da resolução alcançada neste intervalo de massa inferior, os picos de monoisotópico para cada um da n-mers poderiam ser facilmente resolvidos, e então um pico de monoisotópico escolher o protocolo foi selecionado (em média apenas o sinal de massa do primeiro pico na distribuição isotópica ) e todos os cálculos correspondentes utilizaram as massas monoisotópico de cada elemento. MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita (Figura 8) de bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000). Utilizando as equações da etapa 4, software de análise foi usado para calcular as seguintes características da distribuição em massa do polímero: M_n: 1940, M_w: 1950, Đ: 1.01.

Para confirmar o final grupo functionalization, foi selecionado um indivíduo n-mer (42) (Figura 9). Tal como acontece com as distribuições em massa determinada acima, monoisotópico massas foram usadas porque os picos de monoisotópico foram bem resolvidos na distribuição isotópica do cada n-mer. O valor teórico de massa do 42-mer de polioxietileno bis(azide) corresponde a 44.02621 × 42 (a massa das unidades de repetição), 42.00922 (massa do grupo azido final) + 70.04052 (massa do grupo final azidoethyl) + 22.98922 (massa de cátion sódio) = 1984.13978. O valor observado em massa para n = 42 é 1983.95 que é diferente do valor teórico 0,19 Da. Note-se que, especialmente em maiores potências do laser, a funcionalidade de azida pode exibir fragmentos metaestáveis; no entanto, isto não foi observado neste caso específico³¹.

O bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000) amostra mantida sua distribuição estreita quando seletivamente acrescida por uma reação de cicloadição cobre catalisada azida-alquino (Figura 10) com 1-ethynyl-4-fluorobenzene(EFB) (,Figura 11) para produzir um grupo de 4-fluorophenyltriazolyl (FPT). Os espectros exibiram o esperado at⁺ adutos de usar contra-íons de sódio como um agente cationization e HCCA como a matriz.

MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita (Figura 11) de bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000) após functionalization com EFB. Utilizando as equações da etapa 4, software de análise foi usado para calcular as seguintes características de polímero: M_n: 2240, M_w: 2250, Đ: 1,00.

Para confirmar functionalization completa da amostra, monoisotópico massas foram utilizadas para analisar um selecionados individual n-mer (42) (Figura 12). O valor teórico de massa do 42-mer de polioxietileno bis(azide) reagiu com 1-ethynyl-4-fluorobenzene corresponde a 44.02621 × 42 (a massa das unidades de repetição), 162.04675 (massa do grupo final FPT) + 190.07805 (massa da fim de grupo de etilo FPT com 1-ethynyl-4-fluorobenzene) + 22.98922 (massa de cátion sódio) = 2224.21484. O valor observado em massa para n = 42 é 2224.16 que é diferente do valor teórico 0,05 Da.

Exemplo 3: Uma amostra de poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) (Figura 13) foi analisada usando contra-íons de sódio como agente de cationization e só exibiu o esperado at⁺ adutos e DHB como a matriz.

MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita de poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) (Figura 13). Utilizando as equações da etapa 4, o programa de análise foi usado para calcular as seguintes características de polímero: M_n: 2310, M_w: 2360, Đ: 1.02.

Para confirmar functionalization completa da amostra, monoisotópico massas foram utilizadas para analisar um selecionados individual n-mer (26) (Figura 14). O valor teórico de massa do mer-26 de poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) corresponde à 72.02113 × 26 (a massa das unidades de repetição), 17.00274 (massa do grupo hidroxila) + 61.0112 (massa de fim de grupo de ω-tiol) + 22.98922 (massa do sódio cátion) = 1973.55254. O valor observado em massa para n = 26 é 1973.62 que é-0.07 Da diferente do valor teórico. Um pequeno sinal é observado em 2045.74 que corresponde a 72.02113 × 27 (a massa das unidades de repetição), 17.00274 (massa do grupo hidroxila final) + 61.0112 (massa de fim de grupo de ω-tiol) + 22.98922 (massa de cátion sódio). A massa teórica é 2045.57367 que é uma diferença de 0,17 da massa observada. Esta pequena intensidade, ímpares repetir unidade é indicativa de transesterificação durante abertura de polimerização do ácido láctico do anel. Uma terceira, pico muito menor é observado em 2057.73. Este é o-0.14 Da diferente do que a massa teórica de um poly(L-lactide) com o fim de um grupo de ácido carboxílico (ao invés do fim de grupo tiol) com uma massa teórica de 72.02113 × 27 (a massa das unidades de repetição), 17.00274 (massa do grupo hidroxila final) + 73.02895 (massa de ácido carboxílico) + 22.98922 (massa de cátion sódio) = 2057.59142. Esta impureza menor adicional é provável que a consequência da iniciação da água durante a polimerização do monómero do lactidas de abertura do anel.

O poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) amostra mantida sua distribuição estreita quando seletivamente acrescida por uma reação de thiol-ene (Figura 15) com maleimide (Figura 16). Os espectros exibiram o esperado at⁺ adutos de usar contra-íons de sódio como um agente cationization e DHB como a matriz.

MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita da poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) depois de uma reação de thiol-ene com maleimide (Figura 16). Utilizando as equações da etapa 4, software de análise foi usado para calcular as seguintes características de polímero: M_n: 2310, M_w: 2340, Đ: 1.01. Deve notar-se que a diminuição de M,_n e M_w em comparação com matérias-primas é devido ao preconceito de ionização (uma das deficiências de MALDI-TOF-MS). Quando a modificação para a matéria-prima é relativamente pequeno (~ 97 nesta modificação particular) e o dispersity diminui pós-modificação, MALDI-TOF MS cálculos de peso molecular médio podem tornar-se menos precisos.

Para confirmar a completa functionalization do poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) com maleimide através de uma reação de thiol-ene, monoisotópico massas foram utilizadas para analisar um selecionados individual n-mer (26) (Figura 17). O valor teórico de massa do 26-mer de poly(L-lactide) tiol finalizado corresponde a 72.02113 × 26 (a massa das unidades de repetição), 17.00274 (massa do grupo hidroxila final) + 158.02757 (massa de ω-tiol final grupo ligado ao maleimide) + 22.98922 (massa do cátion sódio) = 2070.56891. O valor observado em massa para n = 26 é 2070.54 que é diferente do valor teórico 0,03 Da. A mesma espécie ionizantes com potássio é também observada em 2086.49, que corresponde a uma forma de diferença Da 0,05 a massa teórica. Observa-se um pico muito pequeno no 2167.58 que corresponde a 72.02113 × 28 (a massa das unidades de repetição) + 17.00274 (massa do grupo hidroxila final) + 72.02168 (massa de ânion carboxilato) + 22.98922 (massa de cátion sódio), 38.96371 (massa de cátion potássio). A massa teórica é 2167.56844 que é uma-0.01 diferença da massa observada e é indicativo da mesma impureza de rastreamento de iniciação de água que foi observada em matérias-primas. Este polímero apresenta ionização com um equivalente de sódio, um de potássio e a perda de um próton. A perda do próton ácido carboxílico e complexação com dois cátions é um modo comum de ionização para monocarboxílicos ácido polímeros funcionalizados. É importante notar que a mesma mudança em massa que é observada para os produtos de reação thiol-ene não ocorre para este composto de ácido carboxílico-terminada que mais indica que faltou a fim de grupo tiol para submeter-se a reação de functionalization.

Figura 1:3 x 3 grade para determinação do rácio de amostra. Usando uma grade de 3x3 de amostras, as concentrações relativas de cationization agente-analito-matriz podem ser sistematicamente variadas para determinar empiricamente uma preparação de amostra otimizada. Isso normalmente é feito por uma participação da constante de três variáveis (15 µ l de solução de analito) enquanto aumenta a quantidade dos outros dois (agente cationization (eixo y) e matriz (eixo x)) componentes de um conjunto múltiplo (3 vezes no exemplo retratado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: placa-alvo MALDI-TOF MS. A placa-alvo MALDI-TOF MS é uma placa de metal que prende as amostras Martins-TOF MS em poços individuais para análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: espectro de massa MALDI-TOF da amostra 1. Este espectro completo mostra a distribuição geral de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético (M_n= 5000) ionizado com at⁺ e K⁺. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: espectro de massa MALDI-TOF de uma unidade de repetição individual da amostra 1. Este espectro mostra uma unidade de repetição individual de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido (M_n = 5000) para análise de grupo final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: esquema de reação para modificação da amostra 1. Para confirmar os grupos final das matérias-primas, poly(ethylene glycol) 2-aminoetil éter acético ácido foi reagiu com 2,4-dinitrofluorobenzene (também conhecido como reagente de Sanger). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: espectro de massa MALDI-TOF da amostra 1 modificação. Este espectro completo mostra a distribuição geral de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético (M_n = 5000) acrescida com 2,4-dinitrofluorobenzene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: espectro de massa MALDI-TOF de uma unidade de repetição individual de amostra 1modification. Para confirmar o final grupo functionalization, este espectro mostra uma unidade de repetição individual de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético ácido (M_n = 5000) após reação com 2,4-dinitrofluorobenzene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: espectro de massa MALDI-TOF da amostra 2. Este espectro completo mostra a distribuição geral de bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000) ionizado com at⁺ adutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: espectro de massa MALDI-TOF de uma unidade de repetição individual da amostra 2. Este espectro mostra uma unidade de repetição de polioxietileno bis-azida (M_n = 2000) para confirmar o fim de grupos , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: esquema de reação para modificação da amostra 2. Para confirmar os grupos de fim da partida material, polioxietileno bis-azida (M_n = 2000) foi reagido com 1-ethynyl-4-fluorobenzene através de uma cicloadição azida-alquino catalisada por cobre (CuAAC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: espectro de massa MALDI-TOF de modificação da amostra 2. Este espectro completo mostra a distribuição geral de bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000) acrescida com 1-ethynyl-4-fluorobenzene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: espectro de massa MALDI-TOF de uma unidade de repetição individual da amostra 2 modificação. Este espectro mostra uma unidade de repetição individual de bis(azide) de polioxietileno (M_n = 2000) reagiu com 1-ethynyl-4-fluorobenzene via cicloadição cobre azida-alquino catalisada para confirmar o final grupo functionalization. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: espectro de massa MALDI-TOF da amostra 3. Este espectro completo mostra a distribuição geral de poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 14: espectro de massa MALDI-TOF de uma unidade de repetição individual da amostra 3. O espectro mostra uma unidade de repetição individual de poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) para confirmar o fim de grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 15: esquema de reação para modificação de amostra 3. Para confirmar os grupos do final da matéria-prima, poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) foi reagiu com maleimide através de um acoplamento de thiol-ene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 16: espectro de massa MALDI-TOF de modificação de amostra 3. Este espectro completo mostra a distribuição geral do produto da reação entre poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) e maleimide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 17: espectro de massa MALDI-TOF de uma unidade de repetição individual da amostra 3 modificação. Para confirmar o final grupo functionalization, este espectro mostra uma unidade de repetição individual de poly(L-lactide), tiol finalizado (M_n = 2500) após a reação de thiol-ene com maleimide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Espectrometria de massa MALDI-TOF é uma ferramenta analítica inestimável para a caracterização do polímero devido à sua capacidade de gerar íons de polímero no estado isoladamente carregado e com mínima fragmentação. Esta técnica de ionização suave utiliza pulsos de laser curto para desorb estado sólidas amostras do analito polímero incorporado em uma matriz composto para gerar íons de polímero na fase gasosa. Normalmente, as macromoléculas são ionizadas por complexação com cátions são adicionados à matriz para permitir sua análise por espectrometria de massa. Estes íons macromoleculares são então acelerados por uma tensão de extração para trazê-los para a região de campo-livre do tubo do voo que pode habilitar seus m/z a ser determinado com base em seu tempo de voo entre a fonte de íon e o detector^{5 , 32}.

Em comparação com outras técnicas de caracterização de polímeros, qualidade de espectros de MALDI-TOF MS é fortemente dependente de parâmetros de aquisição de dados e preparação da amostra. Embora não haja nenhuma fórmula definida para a preparação da amostra, compreendendo a função de cada componente da preparação amostra permite a otimização empírica mais rápida. O fator mais importante na preparação da amostra MALDI é seleção da matriz pois compatibilidade da matriz com o analito de polímero é fundamental para permitir que a matrix animado para gerar macromoléculas dessorvidas, única em um estado ionizado^{5, 15,17,19}. Uma vez apropriado matriz e cationization agentes foram selecionados, deve ser determinada a relação correta de analito, matriz e cationization agente. Isto pode ser conseguido empiricamente, criando uma grade bidimensional de amostras (Figura 1) sobre a placa-alvo MALDI-TOF MS (Figura 2) com o aumento da concentração de matriz em um eixo e aumento da concentração do agente de cationization sobre o outros.

Semelhante à preparação da amostra MALDI, não há nenhuma fórmula definida para a determinação de parâmetros de aquisição de dados; no entanto, certas tendências devem ser consideradas para agilizar a otimização espectral. Modo de Reflectron, que aumenta a resolução, mas diminui o sinal global, normalmente é escolhido para baixa massa varia (nestes exemplos, abaixo Da 4.000) onde será possível resolução isotópica. Nestes casos, cálculos de massa monoisotópico e pico escolher métodos foram utilizados. Para amostras de polímero com massas acima Da 4.000, modalidade linear foi usada com cálculos de massa médios e pico de métodos de colheita. Para melhorar a resolução do sinal, as tensões de fonte do íon devem ser ajustadas em pequenos incrementos, com a tendência geral de maiores massa polímeros com maior tensão diferencial (IS1 contra IS2).

Tempo otimizado a preparação da amostra e aquisição parâmetros podem fornecer precisão, exatidão em massa só pode ser alcançado através da calibração eficaz. O tempo de voo para uma determinada massa pode variar sutilmente com relação a parâmetros de aquisição variável e posições de placa mesmo, portanto uma calibração deve ser efectuada para cada conjunto de parâmetros de aquisição otimizada para produzir massa exata determinações de^5,30. Uma vez que os parâmetros de aquisição e preparação da amostra foram otimizadas, o espectro deve ser calibrado usando essas mesmas condições.

Por causa do excepcional resolução e precisão em massa observada nos espectros de massa MALDI-TOF otimizados de polímeros, essa técnica tornou-se uma valiosa ferramenta gratuita para a determinação de dados de distribuição em massa de polímero. No entanto, sua capacidade de resolver as unidades individuais de repetição dentro da distribuição em massa de polímero fornece uma vantagem específica para análise de grupo final em relação ao outro polímero técnicas de caracterização, como cromatografia de permeação de gel (GPC) e nuclear ressonância magnética (NMR). Isto é particularmente valioso para determinar a fidelidade de reações de functionalization grupo final e a natureza quantitativa de reacções de conjugações de grupo final. Este manuscrito tem demonstrado a capacidade de resolver a massa de repetir unidades individuais de polímero, com até dois pontos decimais de precisão em massa, permitindo a confirmação de modificações de grupo final com um elevado nível de confiança. Com os avanços substanciais que têm sido feitos recentemente no campo da síntese do polímero de precisão, MALDI-TOF MS está se tornando uma ferramenta cada vez mais importante para determinar a estrutura macromolecular e funcionalidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000)	MilliporeSigma (Aldrich)	689696	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en&region=US
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000)	MilliporeSigma (Aldrich)	757918	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en&region=US
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500)	MilliporeSigma (Aldrich)	747386	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide low	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	PFS20	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide medium	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	PFS21	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide high	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	PFS22	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en&region=US
2,4 dinitrofluorobenzene	TCI	A5512
maleimide	MilliporeSigma (Aldrich)	129585	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en&region=US
1-ethynylfluorobenzene	Fisher Scientific	766-98-3
triethylamine	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	471283	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en&region=US
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine	MilliporeSigma (Aldrich)	369497	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en&region=US
Copper(I)Bromide	MilliporeSigma (Aldrich)	254185	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en&region=US
glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38212
sodium metabisulfite	MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)	13459	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en&region=US
potassium trifluoroacetate	MilliporeSigma (Aldrich)	281883	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en&region=US
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile	MilliporeSigma (Aldrich)	727881	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en&region=US
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid	MilliporeSigma (Sigma)	C8982	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en&region=US
tetrahydrofuran	Fisher Scientific	T425-1
dichloromethane	VWR Analytical	BDH1113-4LG