Transplantation de la feuille les cellules souches dérivées du tissu adipeux pour réduire les fuites après colectomie partielle dans un modèle de Rat

Résumé

La préparation et la transplantation de feuilles (ASC) les cellules souches dérivé du tissu adipeux sur les anastomoses colorectal insuffisamment suturées dans un modèle de rat est présenté. Cette nouvelle application montre que feuilles de NCP peuvent réduire les fuites d’anastomose colorectal.

Résumé

Une fuite anastomotique est une complication désastreuse après chirurgie colorectale. Bien que les méthodes actuelles pour la prévention de fuites ont différents niveaux d’efficacité clinique, ils sont jusqu'à présent imparfaites solutions. Thérapie de cellules souches en utilisant des feuilles de l’ASC pourrait constituer une solution à ce problème. CRA est considérés comme des candidats aussi prometteurs pour la promotion des tissus de guérison en raison de leurs propriétés trophiques et immunomodulatrices. Ici, nous fournissent des méthodes pour produire des feuilles de ASC haute densités, qui sont transplantés sur une anastomose colorectal dans un modèle de rat pour réduire les fuites. CRA formé de feuilles de cellule dans les récipients de culture thermo sensible qui pourraient facilement être enlevés. Le jour de la transplantation, une colectomie partielle avec une anastomose colorectal 5-suture a été réalisée. Animaux ont été transplantés immédiatement avec 1 feuille de NCP par rat. Feuilles de l’ASC ont adhéré spontanément à l’anastomose sans colle, suture ou tout biomatériau. Groupes d’animaux ont été sacrifiés 3 et 7 jours après l’opération. Par rapport aux animaux transplantés, l’incidence d’abcès anastomotiques et la fuite était plus élevé chez les animaux témoins. Dans notre modèle, la transplantation de feuilles ASC après colorectaux anastomose était réussie et associé à un débit de fuite inférieur.

Introduction

Colectomie partielle avec une anastomose primaire est une intervention couramment pratiquée qui peut être faite pour de nombreuses maladies touchant le côlon telles que le cancer colorectal, maladie de Crohn et diverticulite^1,2. Le plus redoutable complication après que anastomose colorectal est fuite anastomotique³. Bien que plusieurs facteurs de risque associés aux fuites anastomotiques ont été identifiées, des solutions pour prévenir les fuites restent inconnu^4,5.

Cellules stromales dérivées de tissu adipeux (ASCs) sont associés aux propriétés anti-inflammatoires et trophiques^6,7, qui rend ces cellules promettant des candidats pour les thérapies régénératives⁸. L’efficacité des CRA pour favoriser la guérison des tissus a été montrée dans différents tissus comme le muscle cardiaque, peau et oesophage^{9,10,11,12,13}. Cependant, il y a peu de rapports sur l’utilisation des CRA pour favoriser la guérison intestinale. Locale transplantation des CRA à expérimentales anastomoses colorectal via biosutures ASC-enduit ou injections séreux des CRA ont montré ni aucune amélioration dans la guérison¹⁴ ou n’a pas empêché les fuites anastomotiques malgré un résultat plus favorable anastomotique ¹⁵la guérison.

Locale transplantation des CRA en suspension ou combinée avec des biomatériaux peut-être être associés à une rétention cellulaire insuffisante ou une répartition inadéquate des cellules transplantées¹¹. Cellules feuille technologie^16,17 propose une méthode innovante de NCP livraison^18,19. Par conséquent, dans une étude antérieure, une nouvelle approche a été proposée dans lequel ASCs organisés dans une cellule feuille pourrait être appliquée sur expérimental colorectaux anastomose²⁰. Cette étude a démontré que transplantation feuille ASC a réussi à réduire les fuites colorectaux anastomose après colectomie partielle dans un modèle de rat. Cet article rapporte ASC feuille préparation et technique de la transplantation chirurgicale.

Protocole

Du tissu adipeux sous-cutané abdominal proviennent de donneurs humains avec l’approbation du Comité d’éthique médicale (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Pays-Bas. Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité éthique d’expérimentation animale, centre médical universitaire Erasmus MC, Rotterdam, Pays-Bas (133-14-01).

1. culture et l’isolement de l’ASCs humaines

1. Préparer 3 mL de milieu d’isolement pour 1 g de tissu adipeux. Mix faible concentration de glucose Dulbecco de milieu Eagle modification (LG-DMEM) avec 10 g/L Bovine Serum albumine (BSA) et collagénase de 1 g/L de type 1.
2. Disséquer les humains du tissu adipeux sous-cutané abdominal (n = 8, toutes les femmes, moyenne d’âge 40 ± 9 ans) en petits morceaux (0,5 cm) à l’aide d’une lame chirurgicale stérile taille 10, les forceps tissue Adson-Brown et les ciseaux de Metzenbaum dans un stérile SafetyCabinet biologiques.
3. Stocker le tissu découpé dans un flacon de verre stériles médias. Peser la quantité totale de tissu disséqué et commencer la digestion par le milieu d’isolement préparés (50 g de tissu adipeux avec 150 mL de milieu d’isolement par bouteille). Le protocole peut être suspendu ici en stockant la bouteille avec le disséqué le tissu adipeux et le milieu d’isolement à 4 ° C sur un mélangeur à rouleaux du jour au lendemain. Ensuite, préchauffer la bouteille le lendemain à la température ambiante 25 ° C pendant 15 min avant de passer à l’étape suivante.
   NOTE : Le tissu adipeux sous-cutané abdominal a été obtenu comme matière restante des donateurs devant subir une chirurgie de reconstruction mammaire avec l’approbation de la Commission éthique Erasmus MC médicale (# MEC-200) et selon le Code de conduite : « bonne utilisation secondaire de tissus humains » (< http://www.federa.org>). Retailles de tissu adipeux servait seulement de donneurs qui ne pas opt-out à usage secondaire.
4. Digérer le tissu adipeux disséqué dans un flacon de verre stériles médias dans un shaker-incubateur à 150 tr/min et 37 ° C pendant 1 h.
5. Diviser la solution digérée en tubes de 50 mL et centrifuger les tubes pendant 10 min à 390 x g.
6. Préparer le milieu de culture : LG-DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B.
7. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 20 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B). Centrifuger les cellules à nouveau pendant 5 min à 390 x g et éliminer le surnageant.
8. Resuspendre le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % FBS, 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B) et la suspension cellulaire filtrer sur un filtre de 100 µm.
9. Ajouter 50 µL de solution de 3 % d’acide acétique/méthylène bleu (par lyse des globules rouges) dans 50 µL de la suspension cellulaire, mélanger la solution et 10 µL permet de compter les cellules non vides. Effectuer des cellules avec un hémocytomètre. Puis plaque les cellules à une densité de 40 000 cellules/cm² dans le milieu de culture (LG-DMEM supplémenté avec 30 % FBS, 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B).
10. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO₂ pendant 24 h.
11. Après l’incubation, laver les cellules avec du phosphate tiède (37 ° C) solution saline tamponnée (PBS) pour enlever les débris cellulaires et remplacer les médias avec milieu de culture pour le BF 10 % avec fraîchement ajouté phosphate-2-acide ascorbique (25 µg/mL) et la croissance de fibroblastes recombinante humaine le facteur 2 (FGF2, 1 ng/mL).
12. CRA de sous-culture à confluence de 90 % à l’aide de la solution d’EDTA trypsine standard 0,25 % (3 mL pour une fiole T175). Après 3-5 min, neutraliser la solution d’EDTA trypsine 0,25 % avec 10 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % FBS, 50 gentamicine µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B).
    NOTE : Flow cytometry analyse à l’aide de marqueurs de surface communes ASC et différenciation de la lignée tri essais a eu lieu auparavant et a révélé que ASCs isolement à l’aide de ce protocole affichée ASC spécificités^21,22.
13. Laver les cellules avec 10 mL de milieu de culture (LG-DMEM additionné de 10 % FBS, gentamicine 50 µg/mL et 1,5 µg/mL ampothericin B) pour une fiole T175 et centrifuger les cellules pendant 8 min à 250 x g. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de culture. Compter les cellules avec un hémocytomètre.
14. Plaque de cellules dans les flacons de culture T175 à une densité de 8 000 cellules/cm².
15. Congeler l’ASCs restants dans l’azote liquide avec 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) en milieu de culture avant d’utiliser.

2. ASC feuille préparation

1. Manteau pré Pétri thermo-sensible (3,5 cm de diamètre) avec 1 mL de FBS, puis placez la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 min avant l’ensemencement de la cellule.
2. Trypsinize ASC à l’aide de solution de EDTA étalon 0,25 % trypsine pendant 3-5 min (3 mL pour un flacon de culture T175). S’il y a tout amas cellulaire après trypsinisation, filtrer les cellules à travers un filtre 100µm avant le dépouillement.
3. Neutraliser la solution de trypsine avec LG-DMEM supplémenté de 10 % SVF (10 mL pour une fiole T175) et centrifuger la suspension cellulaire pendant 8 min à 250 x g. éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de LG-DMEM supplémenté de 10 % FBS.
4. Après avoir enduit le thermo-responsive Pétri avec FBS, déplacer les plats de l’incubateur d’une plaque chauffante à 37 ° C et retirer le plat FBS.
5. CRA de semences à 400 000 cellules/cm² (au total, 3,52 × 10⁶ cellules dilués dans 2 mL de milieu de culture par plat).
6. Avec soin de distribuer aussi régulièrement que possible les cellules en balançant doucement le plat.
7. Feuilles de NCP culture pendant 48 h à 37 ° C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO₂.
   NOTE : Essayez de réduire au minimum l’ouverture de la porte de l’incubateur après l’ensemencement ASCs pour éviter les baisses de température qui peuvent interférer avec la formation de feuille de NCP ou causer le détachement prématuré des feuilles formées de NCP.

3. partielle colectomie et colorectaux anastomose

1. Induire et maintenir des rats Wistar mâles (pesant entre 250-350 g) avec 1 L/min d’isoflurane (inhalation de 1.5-5%)/oxygen et injecter la buprénorphine 0,05 mg/kg par voie intramusculaire.
2. Une fois que les animaux sont sous anesthésie générale, évaluer la profondeur anesthésique, un test de réflexe. Appliquer pommade ophtalmique contenant de vitamine A sur les yeux pour prévenir le dessèchement. Lorsque l’anesthésie est considéré comme suffisant pour la chirurgie, préparer aseptiquement l’abdomen en rasant les poils et pulvériser la zone chirurgicale deux fois avec l’éthanol à 70 %. Drapé de l’abdomen avec papier stérile drape. Utilisez une technique aseptique et maintenir un champ stérile pendant toute l’intervention chirurgicale.
3. Faire une incision abdominale médiane de 5 cm avec une taille de lame chirurgicale stérile 10 et prolonger l’incision avec des ciseaux de Metzenbaum. Identifier et extérioriser le côlon et emballer le colon du reste de la cavité abdominale avec des gazes humides salines. Identifier le milieu droit et gauche artères coliques dans le mésentère, carrément disséquer autour de chaque navire à l’aide de moustique Halsted et ligaturer individuels de chaque bateau avec 4/0 soie tressé non résorbable.
4. Isoler le segment colique entre 1,0 cm aborally pour le caecum et 0,5 cm au-dessus de l’artère mésentérique caudale. Transect par le biais de côlon sain à l’aide de ciseaux de Metzenbaum. Après la résection du segment colique, réunir les extrémités proximales et distales du côlon en introduisant deux écouvillons en coton long trans-anale dans le côlon distal, puis dans l’extrémité du côlon proximal.
5. À l’aide d’un microscope chirurgical, créer une anastomose bout à bout insuffisamment suturée en une couche inversant la suture à l’aide de sutures interrompus 5 (polyamide 8/0 de monofilament non résorbable). Placer les sutures interrompus à travers toutes les couches de la paroi du côlon et l’extraluminairernent de noeuds.
6. Diviser les rats aléatoirement en contrôle ou groupe de feuille de NCP.

4. ASC feuille Transplantation

1. Laissez les récipients de culture se refroidir à température ambiante 40 min avant la transplantation in vivo , afin de faciliter le détachement de feuille de NCP.
   Remarque : Après le détachement, feuilles de l’ASC se réduire à environ 2 cm de diamètre. Viabilité de feuille ASC reste élevée pendant au moins 3 à 6 h après le détachement de²⁰.
2. Enlever le milieu de culture et de la remplacer avec 1 mL de sérum gratuitement LG-DMEM.
3. Doucement, prenez les jantes de la feuille de l’ASC avec une pince atraumatique et placer le côté plat de la feuille de l’ASC sur le dessus de la ligne anastomotique.
4. Soigneusement Etends de l’ASC feuille environ 0,25 cm au-dessus et au-dessous de la ligne anastomotique à l’aide de la pince atraumatique et enrouler la feuille autour du côlon. Soulevez le côlon jusqu'à envelopper la feuille ASC autour de la face dorsale.
   NOTE : Feuilles de NCP adhèrent spontanément à la ligne anastomotique, il n’y a pas besoin d’utiliser de la colle tissu ou tout autre biomatériau. Le groupe de contrôle ne reçoit pas de traitement supplémentaire.
5. Retirer les cotons-tiges et changer les gants et les instruments. Remplacez le signe deux-points dans l’abdomen. Fermer l’abdomen-linea alba avec une couche d’en cours d’exécution à l’aide de sutures résorbables tressées polyglycolique acide 5/0. L’hypoderme de suture et le cutis ensemble en une seule couche d’en cours d’exécution à l’aide de sutures résorbables tressées polyglycolique acide 5/0.

5. suivi et évaluation post-opératoire

1. Immédiatement, réhydrater les animaux avec une injection sous-cutanée de 5 mL de solution saline tiède après l’opération. Placer les animaux sous une lampe de chaleur pour maintenir la température du corps et de surveiller les signes vitaux jusqu'à ce que les animaux reprendre conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
   NOTE : Les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale ont été pas retournés à la société des autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri. Après récupération, laisser libre accès à l’eau et chow rat ordinaire. Pour le soulagement de la douleur post-opératoire, administrer la buprénorphine 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée toutes les 6-8 h pendant 3 jours. Sans traitements antibiotiques ont été administrés à tout moment dans cette étude.
2. Obtenir des évaluations cliniques quotidiennes de bien-être et de poids. Dans le cas d’un score très faible de bien-être ou des pertes de poids, les animaux doit être euthanasiés par exsanguination par ponction cardiaque tandis que toujours sous anesthésie.
3. Le jour postopératoire 3 ou jour 7, anesthésier les rats avec 1 L/min d’isoflurane (inhalation de 1.5-5%)/oxygen sans la buprénorphine et effectuer une re-laparotomie avec une incision en forme de U. Vérifier l’abdomen pour les signes de péritonite, sténose, adhérences fibreuses et la présence d’abcès. Marquer la gravité des adhérences et abcès tant dans l’abdomen et à la zone anastomotique.
4. Déterminer la pression de rupture anastomotique par l’insufflation d’air dans un segment fermé du côlon dont l’anastomose. Enregistrer la pression atmosphérique et l’endroit de la rupture lorsque le premier air de fuite sous la pression de rupture.
5. Retirer le côlon de chaque animal sacrifié et fixer le segment Coupe du côlon - contenant l’anastomose colorectal - avec 4 % tamponnée de formaldéhyde, suite de paraffine incorporation et coupant le côlon en coupes épaisses de 4 μm.
6. Euthanasier les animaux alors que sous anesthésie directement après le prélèvement du segment anastomose par exsanguination par ponction cardiaque. Confirmer l’animale mort avec l’absence de respiration mouvement et un battement de coeur.
7. Effectuer des salissures histochimiques comme l’hématoxyline et éosine et Picro Sirius rouge et salissures immunohistochimie avec des anticorps dirigés contre les mitochondries humaines, cellules endothéliales rat (anti-CD34) et du système immunitaire (CD3 +, CD163 +).
8. Numériser les diapositives pour analyse informatisée et de comparer les groupes d’animaux.

Résultats

Un organigramme de cette étude décrivant les ASC fiche culture et la procédure de la résection du côlon et anastomose est illustré à la Figure 1. La figure 2 illustre la morphologie microscopique des ASC feuille et l’aspect macroscopique de la feuille de l’ASC pendant et après le détachement. La figure 3 montre les différentes étapes du détachement de feuille d’ASC et de la transpla...

Discussion

Une fuite anastomotique est l’évènement perturbateur plus grave après la résection du côlon avec une anastomose primaire. Techniques optimales pour éviter les fuites et rupture anastomotique manquent encore. L’application locale d’un tableau des biomatériaux a été réalisée, avec des résultats^25,26,27. Le but des thérapies cellulaires est de faciliter la réparation des tissus de remplacement de tissus ou de la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LG DMEM	Gibco, Life technologies	22320022	ASC isolation and culture
Collagenase type I	Gibco, Life technologies	17100-01	ASC Isolation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418	ASC Isolation
Fetal bovine serum	Gibco, Life technologies	10270-106	FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue	Stemcell Technologies	7060	ASC Isolation
Gentamicin	Gibco, Life technologies	15750-037	ASC isolation and culture
Ampothericin B	Gibco, Life technologies	15290-018	ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400)	Akribis Scientific	F240	ASC Isolation
Centrifuge	Hettichlab	Rotina380	ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline	Gibco, Life technologies	14190-094	PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2	AbD Serotec	AF-100-15	FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA	Gibco, Life technologies	25200-056	ASC culture
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650-5x	DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes	Nunc Thermo scientific	174904	ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0	B Braun	21151042	surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0	B Braun	G1118170	surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0	B Braun	C1048207	surgery