Transplante de células-tronco derivadas de tecido adiposo folha para reduzir o vazamento após colectomia parcial em um modelo do rato

Resumo

A preparação e a transplantação de lençóis de células-tronco (ASC) derivado de tecido adiposo para anastomoses Colorretais insuficientemente suturados em um modelo do rato é apresentado. Esta aplicação romance mostra que folhas ASC podem reduzir o vazamento de anastomose colorretal.

Resumo

Anastomótica escapamento é uma complicação catastrófica após cirurgia colorectal. Embora os métodos atuais para prevenção de vazamento tem diferentes níveis de eficácia clínica, eles são até agora imperfeitas soluções. Terapia de células-tronco, usando folhas de ASC poderia fornecer uma solução para este problema. ASCs são considerados candidatos mais promissores para a promoção do tecido de cicatrização devido às suas propriedades tróficas e imunomoduladores. Aqui, nós fornecemos métodos para produzir folhas ASC de alta densidade, que são transplantadas para uma anastomose colorretal em um modelo do rato para reduzir o vazamento. ASCs formaram folhas de célula em pratos de cultura thermo-responsivo que poderiam facilmente ser desanexados. No dia do transplante, foi realizada uma colectomia parcial com uma anastomose colorretal 5-sutura. Os animais foram transplantados imediatamente com 1 folha ASC por rato. Folhas ASC aderiram espontaneamente para a anastomose sem qualquer cola, sutura ou qualquer biomaterial. Grupos de animais foram sacrificados 3 a 7 dias no pós-operatório. Em comparação com animais transplantados, a incidência de abscessos anastomótica e escapamento foi maior nos animais controle. Em nosso modelo, o transplante de folhas ASC após anastomose colorretal foi bem sucedida e associado uma menor taxa de fugas.

Introdução

Colectomia parcial com uma anastomose primária é comumente realizada cirurgia que pode ser feita para muitas doenças que afetam o cólon como câncer colorretal, doença de Crohn e diverticulite^1,2. A mais temida complicação após anastomose colorretal é fuga anastomótica³. Embora tenham sido identificados vários factores de risco associados a vazamentos anastomótica, soluções para a prevenção de vazamento permanecem unkown^4,5.

Tecido adiposo-derivado de células do estroma (ASCs) estão associadas com propriedades anti-inflamatórias e trófico^6,7, que faz com que estas células prometendo candidatos para terapias regenerativas⁸. A eficácia de ASCs para promover a cicatrização tecidual foi mostrada em vários tecidos como o músculo cardíaco, pele e esôfago^{9,10,11,12,13}. No entanto, existem poucos relatos sobre o uso de ASCs para promover a cicatrização intestinal. Transplante de local de ASCs para anastomoses Colorretais experimentais através de biosutures ASC-revestido ou serosas injeções de ASCs não mostraram nenhuma melhora ou na cura de¹⁴ ou não impediu a fuga anastomótica apesar de um mais favorável anastomótica cura de¹⁵.

Transplante de local de ASCs em suspensão ou combinado com biomateriais podem ser associados com retenção insuficiente ou uma distribuição inadequada de células transplantadas¹¹. Célula folha tecnologia^16,17 oferece um método inovador de ASC entrega^18,19. Portanto, em um estudo anterior, uma nova abordagem foi proposta na quais ASCs organizados em uma célula de folha poderá ser aplicada na anastomose colorretal experimental²⁰. Este estudo demonstrou que o transplante de folha ASC é bem sucedido em reduzir o vazamento de anastomose colorretal após colectomia parcial em um modelo do rato. Este artigo relata a elaboração de folha ASC e técnica cirúrgica de transplante.

Protocolo

Tecido adiposo abdominal subcutâneo foi obtido de doadores humanos com aprovação do Comité de ética médica (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Holanda. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê ético da experimentação Animal, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Países Baixos (133-14-01).

1. cultura e isolamento de ASCs humana

1. Prepare-se 3 mL de meio de isolamento para 1 g de tecido adiposo. Mix baixa glicose Dulbecco está meio modificado águia (LG-DMEM) com 10 g/L bovina albumina de soro (BSA) e colagenase 1 g/L do tipo 1.
2. Dissecar o tecido adiposo subcutâneo abdominal de humano (n = 8, todos do sexo feminino, média de idade 40 ± 9 anos de idade) em pedaços pequenos (0,5 cm) usando um tamanho de lâmina cirúrgica estéril 10, pinça de Adson-Brown tecido e tesoura Metzenbaum em uma SafetyCabinet biológica estéril.
3. Armazene o tecido dissecado em uma garrafa de armazenamento de mídia de vidro estéril. Pesar a quantidade total de tecido dissecado e iniciar a digestão com o meio de isolamento preparado (50 g de tecido adiposo com 150 mL de meio de isolamento por garrafa). O protocolo pode ser pausado aqui armazenando a garrafa com a dissecado de tecido adiposo e meio de isolamento a 4 ° C durante a noite em um misturador de rolos. Em seguida escaldar a garrafa no dia seguinte à temperatura de 25 ° C durante 15 minutos antes de continuar com a próxima etapa.
   Nota: Tecido adiposo abdominal subcutâneo obteve-se como material de sobra de doadores submetidos à cirurgia de reconstrução de mama com aprovação do Erasmus MC médica ética Comitê (# MEC-200) e de acordo com o código de conduta: "uso secundário adequado de tecido humano"(< http://www.federa.org>). Utilizou-se apenas restos de tecido adiposo de doadores que não opt-out para uso secundário.
4. Digeri o tecido adiposo dissecado em uma garrafa de armazenamento de mídia de vidro estéril em uma abanador-incubadora a 150 rpm e 37 ° C, durante 1 h.
5. Divida a solução digerida em tubos de 50 mL e centrifugar os tubos por 10 min a 390 x g.
6. Preparar o meio de cultura: LG-DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), a 50 µ g/mL gentamicina e a 1,5 µ g/mL ampothericin B.
7. Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), a 50 µ g/mL gentamicina e a 1,5 µ g/mL ampothericin B). Centrifugar as células novamente por 5 min a 390 x g e remover o sobrenadante.
8. Ressuspender as células com 10 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) e filtrar a suspensão através de um filtro de 100 µm.
9. Adicionar 50 µ l de solução de ácido acético 3% / azul de metileno (para lise de células vermelhas do sangue) de 50 µ l de suspensão de células, misturar a solução e usar 10 µ l para contar as células. Execute célula contando com um hemocytometer. Então as células em uma densidade de 40.000 células/cm² em meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 30% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) da placa.
10. Incube as células a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO₂ por 24 h.
11. Após a incubação, lavar as células com fosfato quente (37 ° C) tampão salino (PBS) para remover detritos celulares e substituir os meios de comunicação com meio de cultura FBS 10% com recém adicionaram ácido ascórbico-2-fosfato (25 µ g/mL) e crescimento do fibroblasto recombinante humana fator 2 (FGF2, 1 ng/mL).
12. Subcultura ASCs na confluência de 90% usando padrão solução de EDTA de tripsina 0,25% (3 mL para um balão de T175). Após 3-5 min, neutralize a solução de EDTA de tripsina 0,25% com 10 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B).
    Nota: Flow cytometry análise usando marcadores de superfície comuns ASC e diferenciação de tri-linhagem ensaios foram realizados anteriormente e revelou que ASCs isolaram usando este protocolo exibido ASC características específicas^21,22.
13. Lavar as células com 10 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) para um balão de T175 e centrifugar as células durante 8 min em x 250 g remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio de cultura. Conte as células com um hemocytometer.
14. As células em frascos de cultura T175 em uma densidade de 8.000 células/cm²da placa.
15. Congele os restantes ASCs em nitrogênio líquido, com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) em meio de cultura antes de nova utilização.

2. preparação de folha de ASC

1. Pre-casaco pratos de cultura thermo-responsivos (3,5 cm de diâmetro) com 1 mL de FBS e, em seguida, coloque os pratos em uma incubadora a 37 ° C durante pelo menos 30 minutos antes da semeadura de célula.
2. Trypsinize ASCs usando a solução padrão de EDTA de tripsina 0,25% para 3-5 min (3 mL para um frasco de cultura T175). Se houver qualquer aglomerados de células após tripsinização, filtre as células através de um filtro de 100 µm antes da contagem.
3. Neutralizar a solução de tripsina com LG-DMEM suplementado com 10% FBS (10 mL para um balão de T175) e centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 8 min em x 250 g. remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de DMEM-LG suplementado com 10% FBS.
4. Após o revestimento os pratos de cultura thermo-responsivo com FBS, mover os pratos de incubadora para uma placa de aquecimento a 37 ° C e remover FBS do prato.
5. Sementes ASCs em 400.000 células/cm² (no total, 3,52 × 10⁶ células diluídas em 2 mL de meio de cultura por prato).
6. Cuidadosamente, distribua as células mais uniformemente possível balançando suavemente o prato.
7. Folhas ASC cultura por 48 h a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO₂.
   Nota: Tente minimizar a abrir a porta de incubadora após semeadura ASCs para evitar quedas de temperatura que possam interferir com a formação de folha ASC ou causar descolamento prematuro de folhas ASC formados.

3. parcial colectomia e anastomose colorretal

1. Induzir e manter ratos machos Wistar (pesando entre 250-350 g) com 1 L/min de isoflurano (inalação de 1.5-5%)/oxygen e injetar buprenorfina 0,05 mg/kg por via intramuscular.
2. Uma vez que os animais estão sob anestesia geral, avalie a profundidade anestésica usando testes de reflexo. Aplica a pomada contendo vitamina A para os olhos para evitar ressecamento. Quando a anestesia é considerada suficiente para a cirurgia, assepticamente prepare o abdômen, raspar os cabelos e pulverizar a área cirúrgica duas vezes com etanol a 70%. Armar o abdômen com cortinas de papel estéril. Use uma técnica asséptica e manter o campo estéril durante todo o ato cirúrgico.
3. Fazer uma incisão abdominal de 5 cm, com um tamanho de lâmina cirúrgica estéril 10 e estender a incisão com uma tesoura de Metzenbaum. Identificar e exteriorize o cólon e embalar o cólon do restante da cavidade abdominal com solução Salinas gazes umedecidas. Identificar o meio certo e deixou as artérias cólica no mesentério, sem rodeios dissecar ao redor de cada vaso utilizando mosquito de Halsted e ligar cada nave individual com seda trançada não absorvível 4/0.
4. Isole o segmento do cólon entre 1,0 cm aborally ao ceco e 0,5 cm acima da artéria mesentérica caudal. Transecto através do cólon saudável com uma tesoura de Metzenbaum. Após a ressecção do segmento do cólon, unir as extremidades proximais e distais do cólon introduzindo dois cotonetes longos trans-anal através do cólon distal e em seguida na extremidade proximal do cólon.
5. Usando um microscópio cirúrgico, crie uma anastomose to-end insuficientemente suturada invertendo-se uma camada suturar usando 5 suturas interrompidas (poliamida monofilamento não absorvível 8/0). Coloque as suturas interrompidas através de todas as camadas da parede do cólon e posicione o extraluminally knots.
6. Divida os ratos aleatoriamente em controle ou grupo de folha ASC.

4. ASC folha transplante

1. Permitir que os pratos de cultura arrefecer à temperatura ambiente 40 min antes no vivo transplante, a fim de facilitar o desprendimento de folha ASC.
   Nota: Após o desprendimento, folhas ASC encolhem a aproximadamente 2 cm de diâmetro. Viabilidade de folha ASC permanece elevada pelo menos 3-6 h após o desprendimento de²⁰.
2. Retire do meio de cultura e substitui-lo com 1 mL de soro livre LG-DMEM.
3. Delicadamente, pegue as bordas da folha ASC com Pinças atraumáticas e coloque o prato do lado da folha em cima da linha anastomótica de ASC.
4. Cuidadosamente, para esticar o ASC folha cerca de 0,25 cm acima e abaixo da linha anastomótica usando as Pinças atraumáticas e envoltório da folha em torno do cólon. Levante o cólon até envoltório de folha de ASC em torno do lado dorsal.
   Nota: Folhas ASC espontaneamente aderirem à linha anastomótica, não há nenhuma necessidade de usar cola de tecido ou qualquer outro biomaterial. O grupo de controle não recebe qualquer tratamento adicional.
5. Remover os cotonetes de algodão e trocar as luvas e instrumentos. Substitua o cólon no abdômen. Fechar o abdome-linea alba com uma camada de execução usando de Suturas absorvíveis trançado polyglycolic ácido 5/0. Suture subcutis e juntos em uma camada de execução suturas usando poliglicólico trançado absorvível ácido 5/0 a cútis.

5. acompanhamento e avaliação pós-operatório

1. Imediatamente Re-hidratar os animais com uma injeção subcutânea de solução salina quente 5ml no pós-operatório. Coloque os animais sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal e monitorar os sinais vitais até animais recobrar a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
   Nota: Os animais que tinham sido submetidos a cirurgia não foram devolvidos para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente. Após a recuperação, permitem o livre acesso à água e comida de rato normal. Para alívio da dor pós-cirúrgica, administre a buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea cada 6-8 h por 3 dias. Sem antibióticos foram administrados a qualquer momento neste estudo.
2. Obter avaliações clínicas diárias de peso e bem-estar. No caso de uma pontuação muito baixa de bem-estar ou perda de peso severa, animais deveriam ser sacrificados por perda de sangue através de punção cardíaca enquanto ainda está sob anestesia.
3. No dia 3 ou dia 7 de pós-operatório, anestesiar os ratos novamente com 1 L/min de isoflurano (inalação de 1.5-5%)/oxygen sem a buprenorfina e realizar uma re-laparotomia com uma incisão em forma de U. Verifique o abdómen para os sinais de peritonite, estenose, aderências fibrosas e a presença de abscessos. Marcar a severidade das adesões e abscesso no abdômen e na área anastomótica.
4. Determine a pressão de rotura anastomótica, a insuflação de ar em um segmento fechado do cólon incluindo a anastomose. Grave a pressão do ar e o local da ruptura, quando o ar a primeiro fuga como estourando a pressão.
5. Remover os dois pontos de cada animal sacrificado e consertar o corte segmento do cólon - contendo a anastomose colorretal - com formol 4% tamponado, seguindo por parafina incorporação e corte do cólon em 4 μm de seções espessas.
6. Eutanásia dos animais enquanto sob anestesia diretamente após a colheita do segmento anastomose por perda de sangue através de punção cardíaca. Confirme a morte de animais com ausência de respiração, movimento e num piscar de olhos.
7. Realize colorações histoquímicas como hematoxilina & eosina e Picro Sirius vermelho e colorações imuno-histoquímica com anticorpos contra mitocôndrias humanas, células endoteliais de rato (anti-CD34) e células do sistema imunológico (CD3 +, CD163 +).
8. Digitalizar slides para análise computadorizada e comparar os grupos de animais.

Resultados

Um fluxograma deste estudo descrevendo tanto cultura folha ASC e o procedimento de ressecção do cólon e anastomose é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra a morfologia microscópica de folha ASC e a aparência macroscópica da folha ASC durante e após o desprendimento. A Figura 3 mostra os diferentes passos do destacamento de folha ASC e transplante de órgãos. A Figura 4...

Discussão

Escapamento anastomótica é o efeito adverso mais grave após a ressecção do cólon com uma anastomose primária. Técnicas ideais para impedir fugas e ruptura anastomótica ainda estão faltando. Aplicação local de uma matriz de biomateriais tem sido conduzida, com resultados variados^25,26,27. O objetivo das terapias com células é facilitar o reparo do tecido por substituição de tecido ou a estimulação da cicatrizaç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LG DMEM	Gibco, Life technologies	22320022	ASC isolation and culture
Collagenase type I	Gibco, Life technologies	17100-01	ASC Isolation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418	ASC Isolation
Fetal bovine serum	Gibco, Life technologies	10270-106	FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue	Stemcell Technologies	7060	ASC Isolation
Gentamicin	Gibco, Life technologies	15750-037	ASC isolation and culture
Ampothericin B	Gibco, Life technologies	15290-018	ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400)	Akribis Scientific	F240	ASC Isolation
Centrifuge	Hettichlab	Rotina380	ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline	Gibco, Life technologies	14190-094	PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2	AbD Serotec	AF-100-15	FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA	Gibco, Life technologies	25200-056	ASC culture
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650-5x	DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes	Nunc Thermo scientific	174904	ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0	B Braun	21151042	surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0	B Braun	G1118170	surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0	B Braun	C1048207	surgery