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Résumé

Nous décrivons l’utilisation des optogenetics et des enregistrements électrophysiologiques pour des manipulations sélectives des oscillations thêta hippocampique (5 à 10 Hz) chez les souris se comporter. L’efficacité de l’entraînement de rythme est contrôlée au moyen potentiel de champ local. Une combinaison d’opto - et pharmacogénétique inhibition adresses la lecture efférente de synchronisation hippocampe.

Résumé

Des données détaillées sur les relations des oscillations de réseau de neurones au comportement et organisation de la décharge neuronale dans toutes les régions du cerveau réclament de nouveaux outils manipuler sélectivement les rythmes du cerveau. Nous décrivons ici une approche alliant projection spécifique optogenetics en électrophysiologie extracellulaire pour le contrôle de la haute fidélité des oscillations thêta hippocampique (5 à 10 Hz) chez les souris se comporter. La spécificité de l’entraînement d’optogenetic est obtenue en ciblant les channelrhodopsin-2 (ChR2) à la population de GABAergiques des cellules septales médiales, essentiellement impliquées dans la génération d’oscillations thêta hippocampiques, et un local synchronisée activation d’un sous-ensemble des inhibiteurs afférences septales dans l’hippocampe. L’efficacité du contrôle optogenetic rythme est vérifiée par un contrôle simultané du champ local potentiel (LFP) sur le limbe de la région CA1 et/ou de décharge neuronale. À l’aide de cette préparation facilement réalisable nous montrent l’efficacité des différents protocoles de stimulation optogenetic pour l’induction des oscillations thêta et la manipulation de leur fréquence et la régularité. Enfin, une combinaison du rythme thêta contrôle avec projection spécifiques inhibition aborde la lecture de certains aspects de la synchronisation hippocampe par régions efférentes.

Introduction

L’activité neuronale chez les mammifères est coordonnée par des oscillations de réseau, Assistant de transfert de l’information au sein et entre les régions de cerveau1,2,3,4. Rythmes du cerveau parmi les oscillations allant de très lent (< 0,8 Hz) jusqu'à des fréquences ultra rapides (> 200 Hz). Un grand nombre de preuves soutient la participation des oscillations de réseau dans les fonctions cérébrales diverses, y compris la cognition5,6,7,8,9,10 , comportements innés11,12 , mais aussi des troubles neuropsychiatriques tels que la maladie de Parkinson et l’épilepsie13,14,15. Méthodes sélectifs et précis dans le temps pour la manipulation expérimentale des oscillations de réseau sont donc essentielles pour l’élaboration de modèles physiologiquement plausibles de synchronisation et d’établir des liens de causalité avec le comportement.

Synchronisation de réseau est médiée par les divers substrats biologiques et des processus, allant de l’identité moléculaire des canaux ioniques et leur cinétique de neuromodulation d’excitabilité et de la connectivité réseau. La conception biologique du rythme générateurs16 a été révélé de nombreux rythmes du cerveau, des aspects distincts de qui (par exemple, fréquence, amplitude) sont souvent provoquée par la dynamique des réseaux et de types cellulaires distincts. Par exemple, des interneurones inhibiteurs ciblant les corps cellulaires des cellules principales sont les acteurs les plus importants à travers les bandes de fréquences et cerveau régions17,18, y compris thêta19,20, gamma20 , 21et ondulation (140 à 200 Hz)22 oscillations. À son tour, synchronisation de phase de cellules lointains est assurée par robuste feed-forward signalisation des cellules pyramidales, qui réinitialise le tir des interneurones. Un paramètre déterminant des oscillations, la taille de la population neuronale synchronisée, est étroitement lié à l’amplitude de l’oscillation mesurée de la LFP et, au moins pour les oscillations rapides, dépend le lecteur excitateur sur les interneurones2. En revanche, des oscillations plus lentes, comme delta et theta rythmes, sont générées par des boucles réentrantes à longue distance, formées par la cortico-thalamiques23,24 et hippocampe-medial prévisions septaux25, 26,27, respectivement. Oscillations dans ces circuits sont provoquées par des interactions entre les retards de propagation de signal, les réponses excitables et leur préférence de fréquence dans les cellules participant28,29,30, 31 , 32. les projections inhibitrices de GABAergiques parvalbumine (PV)-positives sont des cellules du septum médial (MS) d’interneurones hippocampe25,33, régions parahippocampique et de cortex entorhinal26 indispensable pour la génération d’oscillations thêta dans le lobe temporal médial. Ainsi, les mécanismes physiologiques des oscillations de réseau et synchronisation neuronale peuvent être manipulés à l’aide d’optogenetics avec une précision en temps réel.

Cellule spécifique au type optogenetic manipulations ont été appliquées pour l’étude de l’hippocampe et cortex oscillations en vitro34,35,36,37,38 et in vivo30,39,40,41,42,43,44,45, y compris fonctionnelle enquêtes de gamma5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 et l’ondulation oscillations40,53,54 et sommeil broches55,56. Récemment, nous avons exprimé un virus ChR2 Cre-dépendante dans la MS, une région clé pour la génération du rythme thêta hippocampique, des souris PV-Cre. À l’aide de cette préparation, caractéristiques des oscillations thêta hippocampique (fréquence et stabilité temporelle) étaient contrôlés par la stimulation optogenetic des projections inhibitrices de la MS dans le hippocampe11. En outre, une stimulation optogenetic thêta-fréquence des projections septo-hippocampique inhibitrices évoquée par rythme thêta pendant l’immobilité éveillée. L’optogenetically entraîné rythme thêta affichée des propriétés des oscillations thêta spontanée chez la souris au niveau de l’activité neuronale et de la LFP.

Principales caractéristiques du présent protocole comprennent : (1) utilisation d’une voie inhibitrice qui est physiologiquement essentielle des oscillations thêta spontanée tout en évitant les effets non spécifiques sur l’excitabilité hippocampique ; (2) axonale, c.-à-d., stimulation de la projection spécifique pour réduire au minimum une influence directe sur la non-hippocampique MS efférents ; (3) locale photostimulation thêta-rythmique, assurant une ingérence directe minimale avec thêta-rythmique dynamique septo-hippocampe et un entraînement bilatéral global des oscillations thêta ; (4) paramétrique contrôle de fréquence d’oscillations thêta et la régularité ; et (5) quantification de la fidélité de l’entraînement avec une haute résolution temporelle à l’aide de LFP pour permettre l’analyse quantitative de causalité dans le comportement des animaux. Puisque cette préparation exploite essentiellement le rôle bien connu de la désinhibition septo-hippocampe en thêta génération25,30, il permet le contrôle robuste sur plusieurs paramètres d’oscillations thêta chez les souris se comporter. Études, où d’autres moins voies étudiées et les types de cellules de la circuiterie septo-hippocampe ont été manipulées38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 révèlent davantage les mécanismes du rythme thêta.

Protocole

PV-Cre souris knock-in male59, 10-25 semaines, ont été utilisés. Souris ont été logés dans des conditions normales dans l’animalerie et détenus sur un cycle de lumière/obscurité de 12 h. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices nationales et internationales et ont été approuvées par les autorités sanitaires locales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. virale Injection

  1. Pendant toute la procédure, suivre les directives de sécurité biologique60. Porter une blouse de laboratoire, un masque chirurgical, un filet et deux paires de gants.
  2. Couper le tube avec un scalpel stérile ou des ciseaux à environ 1 m de longueur, insérez-le dans le bloque de seringue de la pompe et fixez-le.
    1. Remplir le tube entièrement avec de l’huile de silicone à l’aide de la seringue.
    2. Vérifier si les bulles d’air apparaissent dans le tube. Si on observe des bulles d’air, remplissez à nouveau le tube avec de l’huile.
    3. Difficulté le piston vers le bloc pousseur.
    4. Avancer lentement le poussoir vers le bloque de seringue jusqu'à ce que l’extrémité du plongeur touche le tube.
    5. Introduire l’embout du piston dans le tube et déplacer automatiquement le bloc pousseur vers l’avant à une vitesse lente en sélectionnant « Infuse » dans la fenêtre de commande et un débit de perfusion faible (p. ex., 500 nL/min) jusqu'à ce qu’il atteigne le bloque de seringue.
  3. Préparer l’aiguille d’injection (34G).
    1. Retirez le hub d’aiguille avec une coupe claire à l’aide d’une perceuse/Meuleuse de précision connectée à un disque à tronçonner. Si nécessaire, utilisez une aiguille pour enlever les résidus de métal de la surface fraîchement coupée.
    2. Enfilez le tube capillaire (3-4 cm de longueur) par l’aiguille.
    3. Coller l’aiguille au tuyau avec de la colle super.
    4. Connecter l’aiguille d’injection à l’extrémité du tuyau, qui relie la pompe microseringue.
  4. Fixer l’aiguille au titulaire stéréotaxique.
  5. Retirer l’air jusqu'à ce qu’une bulle d’air dans le tube transparent au-dessus de l’aiguille est visible.
  6. Anesthésier la souris à l’isoflurane de 1,5 à 3 % d’oxygène. Attendre environ 2-3 min, puis vérifiez que la souris est complètement anesthésiée en évaluant sa réponse à une pincée d’orteil. Tout au long de la chirurgie surveiller la respiration de l’animal et ajuster la concentration en isoflurane si nécessaire.
  7. Placez votre souris dans le cadre stéréotaxique avec les détenteurs de l’oreille non traumatique.
  8. Protéger les yeux de la souris avec un gel de lipides.
  9. Lidocaïne 0,1 mL injecter par voie intradermique sous la peau de tête à l’aide d’un 0,01-1 mL seringue et une canule d’injection de 26G.
  10. Raser et désinfecter la tête de la souris à l’aide de la solution d’éthanol. Puis alternez chlorhexidine 2 % trois fois avec de l’éthanol pour désinfecter le site chirurgical.
  11. Effectuer une incision médiane à l’aide de ciseaux fins et pointus va entre l’arrière des oreilles au niveau des yeux afin que le bregma lambda sont visibles.
  12. Nettoyer le crâne en appliquant environ 50 µL de NaCl à l’aide d’une seringue et sécher avec un mouchoir en papier et une bouffée d’air.
  13. Positionner la tête de souris en ajustant le niveau dorso-ventral de la pince nez afin que le bregma et lambda sont au même niveau dorso-ventral (± 0,3 mm).
  14. Percer un trou au-dessus de la MS (AP 0,98 et L 0,5 mm en ce qui concerne le bregma).
  15. À ce stade, décongeler une partie aliquote du virus (doit contenir au moins 2 µL de AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) pendant environ 5 min à température ambiante (RT).
  16. Centrifuger l’aliquote à environ 4 000 x g à RT pendant 1 min.
  17. Distribuer les 2 µL du virus sur un morceau de Parafilm ; utiliser le côté précédemment protégé.
  18. Plonger l’extrémité de l’aiguille d’injection dans le liquide et retirer avec précaution à environ 500 nL/min tout en observant le niveau du liquide. Pour éviter l’aspiration de l’air, arrêter le retrait avant que le virus est entièrement repris. Ajuster le taux de retrait selon la viscosité de la solution ; un rythme plus rapide peut faciliter le retrait d’un virus avec une viscosité plus élevée.
  19. Nettoyer l’aiguille avec un mouchoir en papier.
  20. Vérifier que le virus est contenu dans le tube et le virus et l’huile sont séparés par une bulle d’air. Marquer le niveau du virus sur le tube afin de contrôler si les virus est infusé avec succès pendant l’injection.
  21. Placez l’aiguille au-dessus de la craniotomie et insérer lentement dans le cerveau au premier point d’injection (AP 0,98, L 0,5, V -5,2, latérale 5,5 °).
  22. Injecter 450 nL du virus à un taux de 100-150 nL/min. attendre 10 min. soigneusement déplacer l’aiguille vers le haut de 0,1 mm et attendre encore 5 min.
    1. Déplacer l’aiguille vers le second point d’injection (AP 0,98, L 0,5, V -4,6) et injecter un autre 450 nL à 100-150 nL/min.
    2. Attendez à nouveau 10 min avant de passer l’aiguille jusqu'à 0,1 mm. attendez encore 5 min avant de retirer l’aiguille.
  23. Suture de l’incision avec suture soie noir tressé à l’aide de carré noeuds. Réchauffer l’animal avec une lampe rouge pour accélérer la récupération. Administrer antibiotiques (0,3 mL Erycinum (1 / 4 dans NaCl stérile)) et carprofène i.p. quotidiennes 2 à 3 jours après la chirurgie.
  24. Couper le tube au-dessus de la barre qui indique le niveau du virus. Le tube peut être utilisé pour les injections plus loin. Préparez une aiguille d’injection frais avant chaque injection.
    Remarque : Cette opération prend environ 1 à 1,5 h. L’animal se réveille en général moins de 5 min après la chirurgie. Attendre un minimum de 6 semaines pour l’expression axonale suffisante mais pas plus de 5 mois avant d’effectuer les implantations stéréotaxiques, alors que les niveaux d’expression commencent à diminuer d’environ 6 mois après l’injection de virus.

2. préparation de fibres optiques (Figure 1 a)

  1. Utiliser la fibre optique multimode (noyau de µm 105, verre doublé à base de silice, 0.22 NA). Revêtement, bande 125 µm d’au cœur de la fibre à l’aide d’un micro-stripper tandis que la fibre est encore attachée à la bobine de fibre.
  2. Couper la fibre sur une longueur d’environ 2-3 cm à l’aide d’un couteau de diamant.
  3. Insérez la fibre dans une virole de bâton en céramique de zircone (ID : 126 µm). Environ 0,5 à 1 mm de la fibre optique doit dépasser du côté convexe de la virole.
  4. À l’aide d’une aiguille, appliquer une goutte de colle époxy à deux extrémités de la bague, mais pas sur les côtés de la virole. Vous pouvez également utiliser de la colle super.
  5. Laisser la colle sécher pendant au moins 30 min.
  6. Polir le côté convexe de l’embout à l’aide de diamant clapotis fibre polissage film (3 µm granulations).
  7. Tester la fidélité de transfert léger à l’aide d’un wattmètre optique.
    1. Sélectionner la longueur d’onde sur le wattmètre à la même longueur d’onde que le laser utilisé.
    2. Positionner le cordon de raccordement avec la pointe vers le centre du capteur. Puissance du laser et lire le rendement lumineux de l’indicateur de puissance. Enregistrer la valeur.
    3. Raccorder la fibre optique pour le cordon de raccordement par un manchon d’accouplement et positionnez-le à l’extrémité de la fibre face au centre du capteur. Puissance du laser et lire le rendement lumineux de l’indicateur de puissance. Enregistrer la valeur.
    4. Calculer le taux de transmission : diviser la deuxième valeur de la première valeur. Si le taux de transmission est inférieur à 0,5, jeter la fibre, sinon l’utiliser pour l’implantation.
    5. Tester la vitesse de transmission de chaque fibre avant l’implantation.
    6. Pour des expériences ultérieures, régler la sortie de l’intensité de la lumière du laser à la vitesse de transmission de la fibre optique : Réglez la valeur de l’extrémité du cordon à 5-15 divisé par le taux de transmission pour atteindre un rendement lumineux final de l’extrémité de la fibre de 5 à 15 mW.
      NOTE : Voir aussi Réf. 61 pour la préparation des fibres optiques.

3. préparation du fil de tungstène de tableaux pour LFP Recordings (Figure 1 b)

  1. Coller plusieurs (par exemple 6) 100 µm silice tube guide en parallèle pour le côté collant d’un morceau de ruban adhésif. Couper un morceau, environ 4 à 6 mm, pour montage de tableau un fil.
  2. Fil isolé formvar 45 µm tungstène fils à travers les tubes de guidage à l’aide de pinces.
  3. Bande six émail isolation fine cuivre liaison des fils (environ 5 mm de long) et un fil de terre (environ 2-3 cm de long) à l’aide d’un scalpel à gratter l’isolation sur les deux extrémités. Souder les broches nanoconnector.
  4. Relier chaque câble de liaison au fil d’un tungstène à l’aide d’une goutte de peinture conductrice argent, respectivement. Laissez sécher pendant au moins 30 min.
  5. Appliquer une quantité minimale de ciment pour couvrir les fils. Ne pas appliquer le ciment sur les fils de tungstène, qui seront insérés dans le tissu cérébral ou sur la partie supérieure de la nanoconnector. Laissez le ciment sec pendant au moins 30 min.
  6. Effectuer une coupe angulaire (5-20°) des conducteurs de tungstène avec émoussé en acier inoxydable ciseaux pour permettre l’implantation fiable des fils ci-dessous ou au-dessus de la zone adjacente sur le ventre à la strate pyramidale, où l’amplitude thêta est trop faible pour l’estimation de la fidélité de l’entraînement.
  7. Deinsulate le bout (environ 2 mm) le fil de terre à l’aide d’un scalpel à gratter l’isolation. Traitez-la avec flux et presolder.
  8. Cocher potentiels Croix-pourparlers entre les électrodes à l’aide d’un appareil photo numérique multimètre. Pour ce faire, connectez les broches du connecteur au multimètre, qui doit être réglé sur le mode de mesure de résistance. Vérifier les combinaisons par paires de canaux ; une lecture sur le multimètre au-dessous de 5 MΩ indique interférence significative.
  9. Vérifier l’impédance de chaque fil-électrode dans la saline à l’aide d’un impédancemètre. Valeurs d’impédance typiques sont inférieurs à 100 kΩ.
  10. Pour faciliter l’implantation, coller une fibre optique vers le tableau de fil pour que l’extrémité de la fibre est au niveau du fil le plus court et l’extrémité de la fibre est à proximité, mais sans toucher les fils de tungstène. Garder l’angle de la fibre aussi petit que possible afin d’éviter des lésions tissulaires au cours de l’implantation.
    NOTE : Voir aussi Réf. 62 pour la fabrication de tableaux de fil de tungstène.

4. stéréotaxiques Implantations

  1. Effectuer des préparations comme décrit aux étapes 1.6-1.13.
  2. Retirez le tissu conjonctif sur le dessus du crâne et abaissez les muscles du cou soigneusement d’environ 2 mm pour éviter les artéfacts musculaires lors de l’enregistrement.
  3. Nettoyez le crâne à l’aide d’un applicateur de coton-Astuce et solution saline et percer 4 trous (2 à l’avant) et 2 ci-dessus le cervelet, 0,8 mm de diamètre pour placer les vis inox (00-96 x 1/16) au sol et la stabilisation de l’implant (Figure 1). Positionner la vis de terre, reliée à un fil de cuivre (environ 2-3 cm de longueur), au-dessus du cervelet.
  4. Couvrir la sol-vis complètement avec du ciment pour éviter les artéfacts musculaires durant les enregistrements électrophysiologiques. Construire un anneau de ciment reliant toutes les vis (Figure 1E).
  5. Effectuer une craniotomie au-dessus du côté de l’implantation (hippocampe, AP-1.94, 1,4 L, V 1.4 en ce qui concerne le bregma). Appliquer environ 5 µL de NaCl stérile sur la surface du tissu cérébral.
  6. Abaissez lentement le tableau de fil à l’aide de stereotaxis dans la craniotomie. Pour les enregistrements unitaires, implanter une sonde en silicone au lieu d’un tableau de fil63; afin d’éviter les légers artefacts OPTOELECTRONIQUE, la fibre optique séparément dans l’hippocampe de l’implant avec l’extrémité de la fibre pas directement en face de la sonde (Figure 1 -I). Pour l’enquête de la coordination de l’entraînement entre les hémisphères, implanter une fibre optique supplémentaire dans la région de CA1 hippocampe controlatérale.
  7. Appliquer environ 5 µL d’huile cire/paraffine liquide chaud, préalablement chauffé à 70 ° C, avec une seringue au-dessus du site d’implantation pour protéger le tissu cérébral.
  8. Appliquer le ciment autour du tableau de fil et couvrir le crâne avec le ciment.
  9. Appliquer une goutte du flux à la référence/sol presoldered et le presoldered fil relié à la vis de la terre en utilisant par exemple une aiguille et fusionner les fils à l’aide d’une machine à souder.
  10. Couvrir le fil de terre entière avec du ciment.
  11. Administrer de 0,3 mL Erycinum (NaCl stérile en 1:4) et i.p. carprofène (5mg/mL) après la chirurgie et au moins les deux jours suivant. La souris se réveille en général moins de 15 min suivant la chirurgie. Réchauffer l’animal avec une lampe rouge pour accélérer la récupération.
  12. Surveiller le poids de la souris tous les jours pendant la première semaine après la chirurgie, ou jusqu'à ce que le poids est stable. Perte de poids ne doit pas dépasser 10 % du poids de la souris, enregistré avant la chirurgie. Pour accélérer la stabilisation de poids, fournir la souris avec la nourriture humide et le lait concentré durant les premiers jours suivant la chirurgie.
  13. Pour enregistrer l’activité cellulaire hippocampe au cours de l’entraînement, l’implant une sonde en silicone dans l’hippocampe (AP-1.94, 1.4 L, 1 V, avec abaissement ultérieur) au Réf. 62 (Figure 1 -I). La fibre optique dans l’hippocampe à AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudale rostrale de l’implant. Implanter une fibre optique supplémentaire à la MS (AP +0.98, L 1, V 3.9, latérale de 15 °) si vous souhaitez la stimulation du corps cellulaire.

5. Optogenetic de Stimulation et d’Acquisition de données électrophysiologiques

  1. S’habituer à la souris pour la configuration de l’enregistrement (par exemple, des séances de 15 min, 1-2 séances par jour pendant 3 jours). Examiner le comportement de l’animal avant de commencer avec les premières expériences. Si la souris se déplace dans la chambre, exploration de l’environnement, renifler, effectuant des élevages, etc., commencez la première session expérimentale.
  2. Placez votre souris dans une chambre familier en l’absence d’autres animaux dans la même pièce.
  3. Fixer une LED sur la tête-scène à l’aide de ruban adhésif pour suivre la position de l’animal. Assurez-vous que le voyant lumineux est capté par la caméra pendant toute la période que l’animal est d’explorer la chambre d’enregistrement avant de commencer les expériences. Enregistrer dans l’obscurité afin de suivre la lumière LED. Placez une caméra au-dessus de la chambre d’enregistrement.
  4. Vérifiez la puissance lumineuse du cordon. Estimer le rendement lumineux de l’extrémité de la fibre après connexion selon les taux de transmission de la fibre implantée. Veiller à ce que l’intensité lumineuse de l’extrémité de la fibre est entre 5-15 mW, pour permettre l’entraînement fiable.
  5. Connectez le préamplificateur préamplificateur au connecteur chroniquement implanté. Connectez le cordon de raccordement de fibres optiques à la fibre hippocampe chroniquement implantée pour des expériences de stimulation optogenetic. Dans les expériences de contrôle de la stimulation lumineuse, raccorder la fibre optique à un embout factice connecté au casque.
  6. Placez votre souris dans la chambre d’enregistrement.
  7. Ouvrez le logiciel pour contrôler le générateur d’impulsion pour générer le protocole de stimulation.
  8. Sélectionnez le canal qui contrôle laser DPSS 473 nm. Dans la première ligne, entrez 3 000 mV (1ère colonne), temps de 30 ms (2e colonne), valeur 0 mV (3ème colonne), 112 ms de temps (4e colonne), 840 répéter le rang et groupe 1 répétition, pour générer un protocole pour 2 min de stimulation 7Hz avec impulsions longues de 30 ms. Ajuster la durée de temps dans la 4e colonne et le nombre de répétitions en ligne si la stimulation à une autre fréquence ou une durée différente est nécessaire. Dans la deuxième rangée sélectionnez 0 mW (1ère colonne), temps de 500 h (2e colonne), ligne répéter 1 et groupe répètent 1, pour s’assurer que le laser soit étant éteint après le protocole de stimulation est terminé.
  9. Cliquez sur « fichier > Enregistrer sous » et enregistrez le fichier sous un nom désiré.
  10. S’assurer que le stimulateur TTL sortie déclenchant le laser est connecté à la carte d’entrée analogique numérique Lynx pour synchroniser l’acquisition d’électrophysiologiques et optogenetic données.
  11. Autrement, pour paramétriquement réglementer la variabilité de la fréquence d’oscillations thêta, appliquer les trains d’impulsions de lumière à différents intervalles inter-impulsions, avec les périodes qui suivent une distribution gaussienne. Modifier la dispersion des intervalles inter impulsions pour différents protocoles, par exemple, de l’étape 3.2 à 15,1 ms2. Appliquer ces protocoles pour générer des époques thêta avec différente variabilité de la fréquence thêta (Figure 6).
  12. Ouvrez le logiciel de système d’enregistrement. Cliquez sur « ACQ » pour acquérir et « REC » pour enregistrer. Attendre avant le démarrage de la stimulation lumineuse pour enregistrer le comportement de base (p. ex., 2 min pour récupérer la vitesse de référence ou 30 min pour extraire les champs lieu planifié).
  13. Ouvrez le logiciel pour contrôler le générateur d’impulsion. Cliquez sur « Fichier > Ouvrir » et sélectionnez le fichier de protocole de choix. Cliquez sur « Télécharger et démarrer » pour lancer la stimulation lumineuse.
    Remarque : L’expérience peut être interrogée, et la stimulation démarré via la télécommande ; Cela exclut l’influence de la présence de l’expérimentateur sur le comportement de l’animal. Selon l’objectif de l’étude, la stimulation peut être initiée et résiliée lors de comportements spécifiques.

6. une approche combinée pour entraînement de Optogenetic et de Projection spécifique l’Inhibition de la sortie de l’hippocampe

  1. Exprimer le ChR2 dans MS GABAergic des cellules de souris PV-Cre, tel que décrit à l’article 1.
  2. En outre, injecter un total de 2,4 µL de halorhodopsin dépendant de CamKIIα (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) dans les deux hémisphères hippocampe dorsales (AP -1,7 ; L ± 1,05 ; V-2.05 et - 1,4 mm ; AP -1,7 ; L ± 1,7 ; V-2.05 et - 1,55 mm ; AP -2,3 ; L ± 1,5 ; V -2,2 et - 1,3 mm ; AP -2,3 ; L ± 2.2 ; V-1.65 et - 2,45 mm).
  3. Permettre à 6 semaines de temps de l’expression.
  4. Implanter un tableau de fil de tungstène avec fibre optique dans la région de l’hippocampe CA1, tel que décrit à l’article 4. En outre, l’implant des fibres optiques au niveau bilatéral dans le septum latéral (LS, AP 0,1, L 0.25 V-2,250 mm et AP 0. 5, L -0,3, V-2,70 mm).
  5. Réaliser des expériences de l’entraînement optogenetic thêta comme décrit aux points 5.4-5.5.
    1. Pour l’inhibition simultanée de la sortie hippocampe à la LS, générer une génération de stimulus de protocole : par exemple, le déclencheur l’apparition de la couche de sortie connecté au 593 nm DPSS laser 15 s avec une impulsion continue dure au total 45 s, avant de déclencher la sortie d’impulsions au laser DPSS 473 nm.
    2. Connectez les deux fibres dans le LS par l’intermédiaire de câbles de jonction à l’aide d’un coupleur optique de fibre multimode à un laser DPSS à 593 nm.
    3. Lancer l’enregistrement et téléchargement et déclencher le protocole pour contrôler la génération de stimulus.

7. traitement des données

  1. Convertir les signaux électrophysiologiques et placer les données de suivi avec le gestionnaire de données neurophysiologiques (ND) vers les formats .dat et .pos, respectivement64.
  2. Obtenir la LFP par filtrage passe-bas et sous-échantillonnage du signal large bande à 1 250 Hz à l’aide de gestionnaire de ND66.
  3. Dans chaque enregistrement, sélectionnez le canal avec l’amplitude maximale de thêta oscillations (via Neuroscope)19.
  4. Détecter les horodatages des impulsions laser et des époques stimulation avec un seuil de détection algorithme (à l’aide de MATLAB fonction findpeaks.m ou similaire)11.
  5. Pour importer le fichier .dat dans un logiciel d’analyse de données multicanal, cliquez sur « Fichier > Importer », sélectionnez « fichiers binaires » comme type de données et sélectionnez le fichier .dat. Dans la boîte de dialogue de configuration, entrez le nombre correct de canaux et une fréquence d’échantillonnage de 1 250 Hz, cliquez sur « OK » et enregistrer dans le fichier .smr. Tracer des spectres de puissance en sélectionnant « Analyse > nouveau résultat vue > PowerSpectrum ». Dans les paramètres, sélectionnez le canal avec la plus haute amplitude de thêta et 16 384 FFT taille, cliquez sur « Nouveau », définit comme « Start time » au début de l’ère de la stimulation et comme « End time » la fin de l’époque de la stimulation, puis cliquez sur « Processus ».
  6. Calculer la fidélité d’entraînement comme le rapport entre la densité spectrale de puissance cumulative (PSD) dans la gamme de fréquences de stimulation optogenetic (fréquence de stimulation ± 0,5 Hz), au PSD dans la bande thêta (5-12 Hz) avec la méthode multitaper cumulatif (NW = 3, taille de la fenêtre 8 192) pour 10 époques s (p. ex., toolkit < http://chronux.org/>).
  7. Exclure les époques d’enregistrement où le sommet dominant le PSD est ≤ 5 Hz de l’analyse (non-theta époques, à l’aide de MATLAB fonction find.m).
  8. Tracer la trame des spectres de puissance du PDD pour toutes les époques enregistrés selon la fidélité d’entraînement calculée (en utilisant pcolor.m et sortrows.m de fonctions MATLAB). Charger les spectres de puissance et entraînement fidélité en cliquant sur « Fichier > Ouvrir », stockées à puissance variable de Type po = sortrows(In,1) ; pColor(Power(:,2:end)).

Résultats

Ciblage des ChR2 aux cellules GABAergiques dans la MS, tel que décrit à l’article 1 est illustrée dans la Figure 2 a. Optogenetic stimulation des axones de MS GABAergic cellules dans l’hippocampe dorsal par une fibre optique qui est implantée au-dessus de la zone CA1 entraîne des oscillations thêta à la fréquence du stimulus dans l’ipsilatéral (Figure 2 b) ainsi que controlatérale hémisphère (

Discussion

Ici, nous avons présenté une méthodologie largement accessible pour monter et susciter des oscillations thêta hippocampiques chez l’animal de se comporter. Cette approche peut être utile pour l’étude des fonctions du rythme thêta dans le traitement de l’information et le comportement. Aspects essentiels de cette méthode incluent : (1) choix de l’opsine et le ciblage des ChR2 aux axones de MS cellules dans l’hippocampe, (2) robustes caractéristiques optiques et électriques des assemblys tableau implan...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Maria Gorbati pour l’aide d’un expert avec analyse des données et Jennifer Kupferman pour commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ; Exc 257 NeuroCure, des savoirs traditionnels et des AP ; Programme priorité 1665, 1799/1-1(2), Programme de Heisenberg, 1799/2-1, AP), la Fondation allemande-israélien pour la recherche scientifique et le développement (GIF ; J’ai-1326-421.13/2015, TK) et le Human Frontier Science Program (HFSP ; RGY0076/2012, TK).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
PV-Cre miceThe Jackson LaboratoryB6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgery
StereotaxisDavid Kopf Instruments, Tujunga, CA, USAModel 963Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mmBijoutil, Allschwil, Switzerland49080HM
0.01-1 ml syringeBraun, Melsungen, Germany9161406V
Sterican cannulasBraun26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissorsFine Science Tools Inc., Vancouver, Canada14060-09
ForcepsFine Science Tools Inc.11210-10Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissorsFine Science Tools Inc.14018-14
Soldering stationWeller Tools GmbH, Besigheim, GermanyWSD 81
ErythromycinRotexmedica GmbH, Trittau, GermanyPZN: 108239321g Powder for Solution for Infusion
NameCompanyCatalog NumberComments
Optogenetics
Hamilton pumpPHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USAmodel 703008PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gaugePHD Ultra, Harvard ApparatusModel 75 RN SYR
Hamilton 5 µL PlungerPHD Ultra, Harvard ApparatusModel 75 RN SYR
TubingFisher Scientific, Pittsburgh, USAPE 20Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulasBraun, Melsungen, Germany27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinderProxxon, Wecker, Luxemburgfbs 240/e
Cutting disksProxxonNO 28812
Cre dependent channelrhodopsinPenn Vector Core, Philadelphia, PA, USAAV-1-18917PContruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsinPenn Vector CoreAV-1-26971PConstruct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiberThorLabs, Dachau, GermanyFG105LCA0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrulePrecision Fiber Products, Milpitas, CA, USACFLC126Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paperThorlabsLF3D6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meterThorlabsPM100DCompact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic couplerThorlabsFCMM50-50A-FC1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cordThorlabsFG105LCA CUSTOM-MUCcustom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
SleevePrecision Fiber Products, Milpitas, CA, USAADAL1Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laserLaserglow Technologies, Toronto, ON, CanadaR471005FXLRS-0473 Series
593 nm DPSS laserLaserglow TechnologiesR591005FXLRS-0594 Series
MC_Stimulus IIMultichannel Systems, Reutlingen, GermanySTG 4004
Impedance conditioning moduleNeural microTargeting worldwide, Bowdoin, USAICM
NameCompanyCatalog NumberComments
Electrophysiology
Tungsten wiresCalifornia Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USACFW001095440 µm, 99.95%
Capillary tubingOptronics1068150020ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnectorOmnetics Connector Corporation, Minneapolis, USAA79038-001
ScrewsBilaney, Düsseldorf, Germany00-96x1/16stainless-steel
Silicone probeNeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USAB32
HeadstageNeuralynx, Bozeman, Montana USAHS-8miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paintConrad electronics, Germany530042
Liquid fluxFelder GMBH Löttechnik, Oberhausen, GermanyLötöl STDIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LEDNeuralynxHS-LED-Red-omni-10V
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
MATLABMathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus softwareMultichannel, Systems
Neurophysiological Data ManagerNDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klustershttp://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording systemNeuralynxCheetahhttps://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis softwareCambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GBSpike2

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