АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описывают использование Оптогенетика и электрофизиологические записей для селективного манипуляции гиппокампа тета колебаний (5-10 Гц) в себя мышей. Эффективность ритм ГРЭС контролируется с помощью местных месторождений. Сочетание опто - и фармакогенетических ингибирование адреса эфферентной индикация гиппокампа синхронизации.

Аннотация

Обширные данные взаимоотношения нейронной сети колебания поведение и организации нейронов разряда регионах мозга требуют новых инструментов избирательно управлять ритмов мозга. Здесь мы опишем подход, сочетающий проекции конкретных Оптогенетика с внеклеточного электрофизиологии для контроля высокой точности гиппокампа тета колебаний (5-10 Гц) в себя мышей. Специфика optogenetic ГРЭС достигается путем ориентации channelrhodopsin-2 (ChR2) ГАМК населению медиальной межжелудочковой перегородки клеток, критически участвующих в поколении гиппокампа тета колебаний, и местные синхронизированы активации подмножества ингибирующее межжелудочковой перегородки афферентов в гиппокампе. Эффективность управления ритм optogenetic проверяется одновременный мониторинг местных области потенциальных (LFP) через пластинки области СА1 или нейронов разряда. С помощью этого легко осуществимых подготовки мы показали эффективность различных протоколов optogenetic стимуляции для индукции тета колебаний и манипулирования их частотой и регулярностью. Наконец сочетание управления Тета-ритм с проекции конкретных ингибирование адреса считывания отдельных аспектов гиппокампа синхронизации эфферентной регионов.

Введение

Активность нейронов в млекопитающих координируется колебаний сети, которые помогают передачи информации внутри и между мозга регионах1,2,3,4. Ритмов мозга включают колебания, начиная от очень медленно (< 0,8 Гц) до сверхскоростной частоты (> 200 Гц). Большой объем доказательств поддерживает участие колебаний сети в различных мозговых функций, включая познания5,6,,78,9,10 , врожденное поведение11,12 , а также нервно-психических расстройств, таких как болезнь Паркинсона и эпилепсии13,14,15. Селективный и височно точные методы для экспериментальных манипуляций колебаний сети поэтому важное значение для разработки физиологически вероятных моделей синхронизации и установления причинно-следственных связей с поведением.

Сети синхронизации при посредничестве различных биологических субстратов и процессов, начиная от молекулярных личность ионных каналов и их кинетики neuromodulation возбудимости и подключения к сети. Биологических дизайн ритм, генераторы, которые показали16 для многих ритмов мозга, различные аспекты которых (например, частота, амплитуда), часто в результате динамика типов различных клеток и сетей. Например тормозящий интернейронов ориентации somata главных клеток являются наиболее важных игроков разных частотных полос и мозга регионов17,18, включая тета19,20, гамма20 , 21и22 колебания пульсации (140-200 Гц). В свою очередь этап синхронизации далеких клеток обеспечивается надежный канал вперед сигнализации пирамидальных клеток, который сбрасывает стрельбы интернейронов. Важнейших параметров колебаний, численность населения синхронизированных нейронов, тесно связана с измеренной LFP колебания амплитуды и, по крайней мере для быстрых колебаний, зависит от возбуждающих езды на интернейронов2. В отличие от медленных колебаний, как Дельта и тета ритмов, генерируются дальнего реентерабельной петли, образованный24 cortico таламуса23,и гиппокампа медиальной межжелудочковой перегородки прогнозы25, 26,27, соответственно. Колебания в таких цепях обусловлены взаимодействием задержки распространения сигналов, возбудимые ответов и их частота предпочтения в участвующих клетки28,,2930, 31 , 32. тормозящий проекции от Парвальбумин ГАМК (PV)-позитивных клеток медиальной перегородки (МС) для интернейронов в гиппокампе25,33, парагиппокампальной регионам и entorhinal кора26 важное значение для генерации колебаний тета в медиальной височной доли. Таким образом физиологические механизмы колебаний сети и нейронные синхронизации можно манипулировать с помощью Оптогенетика с точностью, в реальном времени.

Клетки optogenetic конкретного типа манипуляции были применены для изучения гиппокампа и корковые колебания в vitro34,35,36,,3738 и в естественных условиях30,39,40,41,42,,4344,45, включая функциональные исследования гамма5,12,,3646,47,48,49,50, 51,52 и пульсации колебания40,,5354 и сна шпинделей55,56. Недавно мы выразили Cre зависимой ChR2 вирус в MS, ключевым регионом для поколения гиппокампа тета-ритма, PV-Cre мышей. С помощью этого препарата, особенностей колебаний гиппокампа тета (частоты и временных стабильности) контролируется optogenetic стимуляции тормозящий проекции MS в гиппокампе11. Кроме того тета частота optogenetic стимуляции ингибирующее септо гиппокампа прогнозов вызывали Тета-ритм во время бодрствования неподвижности. Optogenetically увлекаемого Тета-ритм отображаются свойства самопроизвольно тета колебаний в мыши LFP и активности нейронов уровнях.

Ключевые особенности настоящего Протокола включают в себя: (1) использование тормозной путь, который физиологически важных для спонтанного тета колебания избегая неспецифические эффекты на гиппокампа возбудимости; (2) аксональное, то есть, проекции конкретных стимуляции для сведения к минимуму непосредственное влияние на не гиппокампа MS эфферентов; (3) местные тета художественной легкой стимуляции, обеспечивая минимальное прямое вмешательство с тета художественной септо гиппокампа динамика и глобальные двусторонние волн тета колебаний; (4) параметрический контроль тета колебания частотой и регулярностью; и (5) количественная оценка верности нейроволновой синхронизации с высоким временным разрешением, используя LFP для включения анализа количественных причинно-следственных связей в поведение животных. Так как этот препарат по существу капитализирует на известные роли септо гиппокампа растормаживания в тета поколения25,30, он позволяет надежный контроль над несколько параметров колебаний тета в себя мышей. Исследования, где другие менее исследованы пути и типы клеток септо гиппокампа схемы были манипулировать38,,3947,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 выявить дальнейшие механизмы тета-ритма.

протокол

PV-Cre забивные мышей-самцов59, 10-25 недель, были использованы. Мышей были размещены в стандартных условиях в объекте животных и хранится на цикле свет/темно 12 h. Все процедуры были исполнены в соответствии с национальными и международными руководящими принципами и были одобрены местными органами здравоохранения (Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen für натур, шведским).

1. вирусные инъекций

  1. В течение всей процедуры выполните биологической безопасности руководящие принципы60. Носите пальто лаборатории, хирургические маски, сетка для волос и две пары перчаток.
  2. Вырезать трубки с стерильным скальпель или ножницы длиной около 1 м, вставить его в шприц держатель блока насоса и исправить ее.
    1. Заполните трубы полностью с силиконовым маслом с помощью шприца.
    2. Проверьте, отображаются ли пузырьков воздуха в трубке. Если наблюдаются пузырьки воздуха, снова пополните труб с маслом.
    3. Исправьте поршень в блок толкателя.
    4. Медленно заранее толкателя сторону шприца держатель блока до тех пор, пока кончик поршень затрагивает труб.
    5. Вставьте наконечник поршень в трубку и автоматически переместить блок толкателя вперед на медленной скорости, выбрав «Infuse» в окне команд и низкой инфузия ставки (например, 500 нл/мин), до тех пор, пока он достигнет шприц держатель блока.
  3. Приготовьте иглу (34G).
    1. Снять ступицу иглы с четкого, используя точность дрель/дробилка подключен к режущего диска. При необходимости, используйте иглы для удаления металлических остатков из свежесрезанных поверхности.
    2. Нить капиллярной трубки (3-4 см длиной) через иглу.
    3. Клей к трубки иглы с супер клей.
    4. Подключение инъекционной иглы к концу трубы, которая соединяет microsyringe насоса.
  4. Прикрепите иглы для стереотаксического держателя.
  5. Снять воздуха, пока не станет видна пузырек воздуха в прозрачной трубке над иглой.
  6. Анестезировать мыши с изофлюрановая 1,5-3% кислорода. Подождите примерно 2-3 мин, затем убедитесь, что мышь полностью наркозом путем оценки ее ответ на щепотку мыс. На протяжении операции контролировать дыхание животного и настроить изофлюрановая концентрации, если требуется.
  7. Поместите курсор мыши в стереотаксической фрейм с помощью держателей не травматической уха.
  8. Защитите глаза мыши с гель липидов.
  9. Придать 0,1 мл лидокаина intradermally под кожу головы, с использованием 0,01-1 мл шприц и канюли инъекции 26G.
  10. Бритье и лечить голову мыши с помощью этанола раствор. Затем поочередно три раза 2% хлоргексидин с этанолом для дезинфекции хирургических сайта.
  11. Выполните срединной линии разреза с помощью тонкой и острые ножницы, идя от задней части ушей на уровень глаз так, что видны bregma и лямбда.
  12. Очистить черепа, применяя приблизительно 50 мкл рабочего раствора NaCl с помощью шприца и насухо салфеткой и слоеного воздуха.
  13. Положение мыши головы, регулируя уровень dorso вентральной нос зажим, так что bregma и лямбда находятся на одном уровне dorso вентральной (± 0,3 мм).
  14. Просверлите отверстие выше MS (AP 0,98 и L 0,5 мм со ссылкой на bregma).
  15. На данный момент размораживание Алиготе вируса (должен содержать по крайней мере 2 мкл AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) примерно в 5 минут при комнатной температуре (RT).
  16. Центрифуга Алиготе на примерно 4000 x g в РТ за 1 мин.
  17. Пипетка 2 мкл вируса на кусок парафина; Используйте ранее защищенных сторону.
  18. Погрузите кончик иглу в жидкость и тщательно снять около 500 нл/мин при соблюдении уровня жидкости. Во избежание аспирации воздуха, остановить вывод, прежде чем вирус полностью рассмотрен. Отрегулировать снять ставки в зависимости от вязкости раствора; более быстрыми темпами может облегчить выход вируса с высокой вязкостью.
  19. Экологически чистые иглы бумажной салфеткой.
  20. Проверьте, что вирус содержится в трубку и вирус и масла разделены пузырек воздуха. Пометьте уровень вируса на трубе, чтобы контролировать ли вирус успешно проникнуты во время инъекции.
  21. Положение иглы выше краниотомии и медленно вставьте его в мозг в первой точке впрыска (AP 0,98, L 0.5, V-5.2, 5,5 ° боковых).
  22. Придать 450 nL вируса в размере 100-150 нл/мин ждать 10 минут тщательно перемещения иглы до 0,1 мм и ждать еще 5 мин.
    1. Перемещение иглы на второй точки инъекции (AP 0,98, L 0.5, V-4.6) и придать еще 450 nL в 100-150 нл/мин.
    2. Снова ждать 10 минут перед перемещением иглы 0,1 мм вверх. Подождите еще 5 мин перед удалением иглы.
  23. Шов надрез с Шелковый черный плетеный шва с помощью площади knots. Теплый животное с красная лампа для ускорения восстановления. Применять антибиотики (0,3 мл Erycinum (1:4 в стерильных NaCl)) и carprofen и.п. ежедневно 2-3 дня после операции.
  24. Вырежьте трубки выше отметки, что уровень вируса. Трубка может использоваться для дальнейшего инъекции. Подготовьте свежие инъекционной иглы перед каждой инъекцией.
    Примечание: Эта операция занимает около 1-1,5 ч. Животное просыпается обычно в течение 5 мин после операции. Подождите как минимум времени 6 недель для достаточно аксональное выражение, но не более чем 5 месяцев перед выполнением стереотаксической имплантации, как уровни выражения начинают уменьшаться примерно через 6 месяцев после инъекции вируса.

2. Подготовка оптических волокон (рис. 1A)

  1. Использования многомодового оптоволокна (105 мкм ядро, стекло, одетой с ядром кремнезем, 0.22 NA). Полосы 125 мкм обшивки волокна ядра с помощью микро зачистки в то время как волокно еще привязаны к волокна золотника.
  2. Отрежьте волокно длиной примерно 2-3 см, с использованием алмазный нож.
  3. Вставить волокна в обойма керамические ручки циркония (ID: 126 мкм). Примерно 0,5-1 мм оптического волокна должны выступать с выпуклой стороны обойма.
  4. С помощью иглы, нанесите одну каплю эпоксидной клея на обоих концах обойма, но не по бокам обойма. Кроме того используйте супер клей.
  5. Разрешить клей для просушки минимум 30 мин.
  6. Польский выпуклой стороне обойма с использованием алмазов, доводка волокна полировки фильм (крупы 3 мкм).
  7. Проверка верности передачи света, используя Измеритель оптической мощности.
    1. Установка длины волны на измеритель мощности на одной волне как лазер.
    2. Установите патч-корд с кончиком, с которыми сталкивается Центр датчика. Включите лазер и считывать измеритель мощности светового потока. Запишите значение.
    3. Подключите оптический патч-корд через соединительный рукав и расположите его с кончика волокна, с которыми сталкивается Центр датчика. Включите лазер и считывать измеритель мощности светового потока. Запишите значение.
    4. Вычислить скорость передачи: разделить второе значение первое значение. Если скорость передачи ниже 0.5, удалить волокна, в противном случае использовать его для имплантации.
    5. Протестируйте скорость передачи для каждого волокна до имплантации.
    6. Для более поздних экспериментах, настроить выход интенсивности света лазера на скорость передачи оптического волокна: значение светового потока от кончика патч-корд 5-15, деленное на скорость передачи для достижения окончательного светоотдачи от кончика волокно 5-15 МВт.
      Примечание: Также смотрите 61 ссылка для подготовки оптических волокон.

3. Подготовка Вольфрамные проволоки массивов для LFP записи (рис. 1B)

  1. Приклейте несколько (например 6) 100 мкм кремний трубки направляющие параллельно на липкой стороне кусок ленты. Вырежьте один кусок, примерно 4-6 мм, для Ассамблеи массив одного провода.
  2. Резьба formvar изолированные 45 мкм вольфрама провода через трубы руководство, с помощью щипцов.
  3. Газа шесть эмаль изоляцией Медь рафинированная склеивания с помощью скальпеля, чтобы отчищать изоляции на обоих концах провода (около 5 мм) и провод заземления (примерно 2-3 см длиной). Паять их к штифтам nanoconnector.
  4. Подключите каждый провод склеивание к одной Вольфрамные проволоки, используя одну каплю Проводящая серебряная краска, соответственно. Пусть сухой для по крайней мере 30 минут.
  5. Применять минимальное количество цемента для покрытия проводов. Не применять цемент на провода вольфрама, которые будут вставлены в ткани мозга или на верхней части nanoconnector. Пусть Цемент сухой для по крайней мере 30 минут.
  6. Выполнить угловые разреза (5-20°) провода вольфрама, включение надежных имплантации проводов ниже или выше зоны вентрально прилегающих к pyramidale слой, где амплитуда тета является слишком низким для оценки с помощью тупыми ножницами из нержавеющей стали нейроволновой синхронизации верности.
  7. Deinsulate наконечник (примерно 2 мм) из заземляющий провод отчищать изоляции с помощью скальпеля. Относиться к нему с потока и presolder.
  8. Проверка потенциальных кросс переговоры между электродами с помощью цифровой мультиметр. Чтобы сделать это, подключите контактов разъема к мультиметр, который должен быть установлен в режим измерения сопротивления. Проверьте парного сочетаний каналов; чтение на мультиметр ниже 5 MΩ показывает значительное кросс talk.
  9. Проверьте сопротивление каждого провода электрода в солевой используя Измеритель импеданса. Типичный импеданс значения находятся ниже 100 kΩ.
  10. Чтобы облегчить имплантацию, клей один оптоволоконного провода массив так, что кончик волокна на уровне короткий провод и кончик волокна находится в непосредственной близости, но не касаясь провода вольфрама. Храните угол волокна как можно меньше для того, чтобы предотвратить повреждение тканей во время имплантации.
    Примечание: См. также 62 ссылка для изготовления Вольфрам проволока массивов.

4. Стереотаксическая имплантации

  1. Выполнение подготовки, как описано в шагах 1.6-1,13.
  2. Удаление соединительной ткани из верхней части черепа и надавите мышцы шеи тщательно, примерно 2 мм для предотвращения мышечных артефакты во время записи.
  3. Очистить черепа с помощью хлопок кончик аппликатора и физиологического раствора и 4 отверстия (2 передних) и 2 выше мозжечка, диаметром 0,8 мм поставить Костные винты из нержавеющей стали (00-96 x 1/16) для наземного и стабилизации имплантата (рис. 1 d). Положение земли винт, подключенных к одной медной проволоки (примерно 2-3 см длиной) выше мозжечка.
  4. Покрывают землю винт полностью с цементом, чтобы предотвратить мышцы артефакты во время электрофизиологических записи. Постройте цементного кольца, подключение все винты (Рисунок 1E).
  5. Выполните краниотомии выше стороне имплантации (гиппокампа, AP-1.94, 1.4 Л, V 1.4 со ссылкой на bregma). Примените примерно 5 мкл стерильных NaCl на поверхности ткани мозга.
  6. Медленно опустите проволока массив с помощью stereotaxis в краниотомии. Для унитарного записей имплантаты силиконовые зонд вместо проволоки массив63; для того, чтобы предотвратить optoelectric света артефакты, имплантат волоконно отдельно в гиппокампе кончиком волокна не непосредственно перед зонд (Рисунок 1 c -я). Для расследования координации нейроволновой синхронизации между полушариями имплантат дополнительных оптических волокон в области контралатерального СА1 гиппокампа.
  7. Примените примерно 5 мкл теплых жидкий воск/парафинового масла, разогретую на 70 ° C, с помощью шприца над сайтом имплантации для защиты ткани мозга.
  8. Применять цемент вокруг провода массив и охватывают череп с цементом.
  9. Нанесите одну каплю flux проволоки presoldered земли/ссылки и presoldered провод подключен к земле винт, например с помощью иглы и предохранитель провода с помощью пайки машины.
  10. Покрывают весь заземляющий провод с цементом.
  11. Администрировать 0,3 мл Erycinum (1:4 в стерильных NaCl) и и.п. carprofen (5 мг/мл) после операции и для по крайней мере двух дней после. Мышь обычно просыпается в течение 15 мин, после операции. Теплый животное с красная лампа для ускорения восстановления.
  12. Ежедневно контролировать вес мыши для первой недели после операции или до тех пор, пока вес стабильным. Потеря веса не должна превышать 10% от веса мыши зарегистрированы до хирургии. Для ускорения стабилизации веса, питания мыши с мокрой продовольствия и сгущенное молоко в первые дни после операции.
  13. Для записи гиппокампа клеточной активности во время захвата, имплантата силиконовые зонд в гиппокампе (AP-1.94, 1.4 Л, V 1, с последующим понижением), как описано в ref. 62 (Рисунок 1 c -я). Имплантат оптоволокна в гиппокампе в АП -3, 1.4 Л, V-1.6, 39 ° хвостового Ростральных. Если стимуляция клеток somata имплантата дополнительных оптических волокон в мс (AP +0.98, 1 Л, V 3.9, боковые 15 °).

5. Optogenetic стимуляции и приобретение электрофизиологических данных

  1. Приучать мыши для установки записи (например, сессий 15 мин, 1-2 сеанса в день в течение 3 дней). Изучите поведение животных, прежде чем начиная с первых экспериментов. Если мышь движется в камере, изучение окружающей среды, нюхает, выполнение rearings и т. д., запустите первый экспериментальный сеанс.
  2. Поместите курсор мыши в камере знакомые в отсутствие других животных в той же комнате.
  3. Прикрепите светодиодные на голову-сцену с помощью клейкой ленты для отслеживания позиции животного. Убедитесь, что светодиод захвачен камеры на протяжении периода животное изучает записи камеры до начала экспериментов. Запись в темноте, чтобы отслеживать светодиодный свет. Расположите камеру выше запись камеры.
  4. Проверьте световой поток от патч-корд. Оцените светоотдачи от кончика волокна после подключения в зависимости от скорости передачи волокна имплантированных. Убедитесь, что световой поток от кончика волокна между 5-15 МВт, чтобы включить надежное нейроволновой синхронизации.
  5. Соедините headstage предусилитель с хронически имплантированных. Волоконно-оптические патч корды соединиться хронически имплантированных гиппокампа волокна для optogenetic стимуляции экспериментов. В экспериментах легкой стимуляции управления Подключите волоконно к Макетные обойма, подключен к гарнитуре.
  6. Поместите курсор мыши в зале регистрации.
  7. Открытое программное обеспечение для управления стимул генератор для создания протокола стимуляции.
  8. Выберите канал, который управляет 473 Нм DPSS лазер. В первой строке введите 3000 МВ (первый столбец), время 30 мс (вторая колонка), значение 0 mV (третий столбец), время 112 мс (4-я колонка), ряд повторных 840 и группа повторить 1, чтобы создать протокол для 2 минут 7 Гц стимуляции с 30 мс длинные импульсы. Отрегулируйте длительность 4 столбцов и количество строк повторений при необходимости стимуляции на другой частоте или различной длительности. В второй строки выберите 0 МВт (первый столбец), время 500 h (вторая колонка), строка повторять 1, группы и повторить 1, чтобы обеспечить, что лазерная настоящее время выключен после стимуляции протокола прекращается.
  9. Нажмите кнопку «Файл > Сохранить как» и сохраните файл с именем нужного.
  10. Заверить, что стимулятор TTL выход активирован лазер подключен к цифровой рысь аналоговый входной платы для синхронизации на приобретение электрофизиологических и optogenetic данных.
  11. Кроме того параметрически регулировать изменчивости частоты колебаний тета, примените поезда световых импульсов на различных интервалов между импульса, с периодами после распределения Гаусса. Измените дисперсия между пульс интервалы для различных протоколов, например, от 3.2 до 15,1 мс2шага. Примените эти протоколы для создания тета эпох с различными изменчивость тета частоте (рис. 6).
  12. Откройте программное обеспечение записи системы. Щелкните дальше «ACQ» для приобретения и «REC» для записи. Подождите до начала легкой стимуляции для записи базового поведения (например, 2 мин до получения базовой скорости или 30 мин для извлечения полей базовых место).
  13. Открытое программное обеспечение для управления генератора стимул. Нажмите кнопку «Файл > Открыть» и выберите файл протокола выбора. Нажмите «Загрузить и начать «инициировать легкой стимуляции.
    Примечание: Эксперимент можно произвести съемку и стимуляции начал через пульт дистанционного управления; Это исключает влияние присутствия экспериментатора на поведение животных. В зависимости от цели исследования стимуляции может быть начата и прекращены в течение определенного поведения.

6. комбинированный подход для Optogenetic ГРЭС и проекции конкретных ингибирование гиппокампа вывода

  1. Экспресс ChR2 в клетках MS ГАМК PV-Cre мышей, как описано в разделе 1.
  2. Кроме того ввести в общей сложности 2.4 мкл CamKIIα зависит от галородопсин (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) в обоих полушариях спинной гиппокампа (AP -1,7; L ± 1,05; V -2.05 и - 1,4 мм; AP -1,7; L ± 1,7; V -2.05 и - 1.55 мм; AP-2.3; L ± 1,5; V-2.2 и - 1.3 мм; AP-2.3; L ± 2,2; V-1.65 и - 2,45 мм).
  3. Разрешить 6 недель выражения времени.
  4. Имплантат массив Вольфрам проволока с оптоволокна в регионе СА1 гиппокампа, как описано в разделе 4. Кроме того, имплантат на двусторонней основе оптических волокон в боковые перегородки (LS, AP 0.1, 0.25 Л, V-2.25 мм и AP 0.5, Л-0.3, V-2.7 мм).
  5. Выполните optogenetic тета волн эксперименты, как описано в шагах 5.4-5.5.
    1. Для одновременного ингибирование гиппокампа вывода LS, создавать стимул поколение протокол: например, триггер наступления в выходной канал подключен к 593 Нм DPSS лазера 15 s с непрерывной импульса длительностью общее 45 s, прежде чем спровоцируют выходных импульсов до 473 Нм DPSS лазер.
    2. Подключите оба волокна в LS через патч-корды, с использованием многомодового волокна Оптические муфты до 593 Нм DPSS лазер.
    3. Начать запись и скачать и активировать протокол для управления генерацией стимул.

7. обработка данных

  1. Преобразовать электрофизиологических сигналов и положение данных отслеживания с менеджером нейрофизиологических данных (ND) форматы .dat и .pos, соответственно64.
  2. Получите LFP НЧ-фильтрации и вниз выборки широкополосного сигнала до 1250 с помощью ND менеджер66Гц.
  3. В каждой записи, выберите канал с максимальной амплитудой тета колебания (используя Neuroscope)19.
  4. Обнаружения отметок времени лазерных импульсов и стимуляции эпох с порога обнаружения алгоритм (с использованием MATLAB функции findpeaks.m или подобные)11.
  5. Чтобы импортировать файл .dat в многоканальных данных анализа программного обеспечения, нажмите кнопку «Файл > Импорт», выберите «двоичные файлы» как тип данных и выберите файл .dat. В диалоговом окне конфигурации введите правильное количество каналов и дискретизации 1 250 Гц, нажмите кнопку «ОК» и сохраните как файл .smr. Участок спектра мощности, выбрав «Анализ > новый результат вид > PowerSpectrum». В настройках выберите канал с высокой амплитудой тета и 16.384 размер БПФ, нажмите кнопку «Новый», определяют как «Время начала» в начале эпохи стимуляции и как «Время окончания» конец эпохи стимуляции, и нажмите кнопку «Процесс».
  6. Рассчитать верности нейроволновой синхронизации как отношение спектральной плотности совокупные мощности (PSD) в диапазоне частот optogenetic стимуляции (стимуляции частоты ± 0,5 Гц), чтобы совокупное PSD в полосе тета (5-12 Гц) с помощью метода multitaper (NW = 3, Размер окна 8192) для 10 s эпох (например, Инструментарий < http://chronux.org/>).
  7. Исключить записи эпох, где доминирующим пик PSD-≤ 5 Гц от анализа (не тета эпох, с использованием MATLAB функции find.m).
  8. Печать растровых спектры мощности LFP для всех записанных эпох согласно верности вычисляемых нейроволновой синхронизации (с помощью MATLAB функций sortrows.m и pcolor.m). Загрузить мощности спектры и увлечения верности, нажав «File > Open», хранится в переменной мощности типа дюйма = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

Результаты

Нападения на ChR2 клетки ГАМК в МС, как описано в разделе 1 проиллюстрирован на рисунке 2A. Optogenetic стимуляция аксоны ячейки MS ГАМК в спинной гиппокампа через оптические волокна, который вживляется выше области СА1 захватывает тета колебания с частотой стим?...

Обсуждение

Здесь мы представили широко доступной методологии увлекают и вызывают колебания гиппокампа тета в поведения животных. Этот подход может быть полезным для исследования функций Тета-ритм в обработке информации и поведение. Важные аспекты этого метода включают в себя: (1) выбор опсин и на?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Мария Gorbati за помощью к специалистам с анализом данных и Дженнифер Kupferman для комментариев по рукописи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; EXC 257 NeuroCure, ТЗ и AP; Приоритетные программы 1665, 1799/1-1(2), Гейзенберг программы, 1799/2-1, AP), немецко израильский фонд для научных исследований и разработок (GIF; Я-1326-421.13/2015, ТЗ) и программа человека пограничной науки (HFSP; RGY0076/2012, ТЗ).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PV-Cre miceThe Jackson LaboratoryB6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgery
StereotaxisDavid Kopf Instruments, Tujunga, CA, USAModel 963Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mmBijoutil, Allschwil, Switzerland49080HM
0.01-1 ml syringeBraun, Melsungen, Germany9161406V
Sterican cannulasBraun26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissorsFine Science Tools Inc., Vancouver, Canada14060-09
ForcepsFine Science Tools Inc.11210-10Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissorsFine Science Tools Inc.14018-14
Soldering stationWeller Tools GmbH, Besigheim, GermanyWSD 81
ErythromycinRotexmedica GmbH, Trittau, GermanyPZN: 108239321g Powder for Solution for Infusion
NameCompanyCatalog NumberComments
Optogenetics
Hamilton pumpPHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USAmodel 703008PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gaugePHD Ultra, Harvard ApparatusModel 75 RN SYR
Hamilton 5 µL PlungerPHD Ultra, Harvard ApparatusModel 75 RN SYR
TubingFisher Scientific, Pittsburgh, USAPE 20Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulasBraun, Melsungen, Germany27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinderProxxon, Wecker, Luxemburgfbs 240/e
Cutting disksProxxonNO 28812
Cre dependent channelrhodopsinPenn Vector Core, Philadelphia, PA, USAAV-1-18917PContruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsinPenn Vector CoreAV-1-26971PConstruct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiberThorLabs, Dachau, GermanyFG105LCA0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrulePrecision Fiber Products, Milpitas, CA, USACFLC126Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paperThorlabsLF3D6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meterThorlabsPM100DCompact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic couplerThorlabsFCMM50-50A-FC1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cordThorlabsFG105LCA CUSTOM-MUCcustom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
SleevePrecision Fiber Products, Milpitas, CA, USAADAL1Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laserLaserglow Technologies, Toronto, ON, CanadaR471005FXLRS-0473 Series
593 nm DPSS laserLaserglow TechnologiesR591005FXLRS-0594 Series
MC_Stimulus IIMultichannel Systems, Reutlingen, GermanySTG 4004
Impedance conditioning moduleNeural microTargeting worldwide, Bowdoin, USAICM
NameCompanyCatalog NumberComments
Electrophysiology
Tungsten wiresCalifornia Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USACFW001095440 µm, 99.95%
Capillary tubingOptronics1068150020ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnectorOmnetics Connector Corporation, Minneapolis, USAA79038-001
ScrewsBilaney, Düsseldorf, Germany00-96x1/16stainless-steel
Silicone probeNeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USAB32
HeadstageNeuralynx, Bozeman, Montana USAHS-8miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paintConrad electronics, Germany530042
Liquid fluxFelder GMBH Löttechnik, Oberhausen, GermanyLötöl STDIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LEDNeuralynxHS-LED-Red-omni-10V
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
MATLABMathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus softwareMultichannel, Systems
Neurophysiological Data ManagerNDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klustershttp://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording systemNeuralynxCheetahhttps://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis softwareCambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GBSpike2

Ссылки

  1. Salinas, E., Sejnowski, T. J. Correlated neuronal activity and the flow of neural information. Nat Rev Neurosci. 2 (8), 539-550 (2001).
  2. Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  3. Cannon, J., et al. Neurosystems: brain rhythms and cognitive processing. Eur J Neurosci. 39 (5), 705-719 (2014).
  4. Fries, P. Neuronal gamma-band synchronization as a fundamental process in cortical computation. Annu Rev Neurosci. 32, 209-224 (2009).
  5. Cardin, J. A., et al. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  6. Colgin, L. L., et al. Frequency of gamma oscillations routes flow of information in the hippocampus. Nature. 462 (7271), 353-357 (2009).
  7. Csicsvari, J., Jamieson, B., Wise, K. D., Buzsaki, G. Mechanisms of gamma oscillations in the hippocampus of the behaving rat. Neuron. 37 (2), 311-322 (2003).
  8. Gray, C. M., Singer, W. Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).
  9. Lisman, J. E., Jensen, O. The theta-gamma neural code. Neuron. 77 (6), 1002-1016 (2013).
  10. Sirota, A., et al. Entrainment of neocortical neurons and gamma oscillations by the hippocampal theta rhythm. Neuron. 60 (4), 683-697 (2008).
  11. Bender, F., et al. Theta oscillations regulate the speed of locomotion via a hippocampus to lateral septum pathway. Nat Commun. 6, 8521 (2015).
  12. Carus-Cadavieco, M., et al. Gamma oscillations organize top-down signalling to hypothalamus and enable food seeking. Nature. 542 (7640), 232-236 (2017).
  13. Bragin, A., Engel, J., Wilson, C. L., Fried, I., Buzsaki, G. High-frequency oscillations in human brain. Hippocampus. 9 (2), 137-142 (1999).
  14. Wang, J., et al. High-frequency oscillations in Parkinson's disease: spatial distribution and clinical relevance. Mov Disord. 29 (10), 1265-1272 (2014).
  15. Hammond, C., Bergman, H., Brown, P. Pathological synchronization in Parkinson's disease: networks, models and treatments. Trends Neurosci. 30 (7), 357-364 (2007).
  16. Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33 (3), 325-340 (2002).
  17. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  18. Buhl, E. H., et al. Physiological properties of anatomically identified axo-axonic cells in the rat hippocampus. J Neurophysiol. 71 (4), 1289-1307 (1994).
  19. Wulff, P., et al. Hippocampal theta rhythm and its coupling with gamma oscillations require fast inhibition onto parvalbumin-positive interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3561-3566 (2009).
  20. Korotkova, T., Fuchs, E. C., Ponomarenko, A., von Engelhardt, J., Monyer, H. NMDA receptor ablation on parvalbumin-positive interneurons impairs hippocampal synchrony, spatial representations, and working memory. Neuron. 68 (3), 557-569 (2010).
  21. Buhl, D. L., Harris, K. D., Hormuzdi, S. G., Monyer, H., Buzsaki, G. Selective impairment of hippocampal gamma oscillations in connexin-36 knock-out mouse in vivo. J Neurosci. 23 (3), 1013-1018 (2003).
  22. Racz, A., Ponomarenko, A. A., Fuchs, E. C., Monyer, H. Augmented hippocampal ripple oscillations in mice with reduced fast excitation onto parvalbumin-positive cells. J Neurosci. 29 (8), 2563-2568 (2009).
  23. Contreras, D., Steriade, M. Cellular basis of EEG slow rhythms: a study of dynamic corticothalamic relationships. J Neurosci. 15 (1 Pt 2), 604-622 (1995).
  24. Herrera, C. G., et al. Hypothalamic feedforward inhibition of thalamocortical network controls arousal and consciousness. Nat Neurosci. 19 (2), 290-298 (2016).
  25. Freund, T. F., Antal, M. GABA-containing neurons in the septum control inhibitory interneurons in the hippocampus. Nature. 336 (6195), 170-173 (1988).
  26. Unal, G., Joshi, A., Viney, T. J., Kis, V., Somogyi, P. Synaptic Targets of Medial Septal Projections in the Hippocampus and Extrahippocampal Cortices of the Mouse. J Neurosci. 35 (48), 15812-15826 (2015).
  27. Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29 (25), 8094-8102 (2009).
  28. Bartho, P., et al. Ongoing network state controls the length of sleep spindles via inhibitory activity. Neuron. 82 (6), 1367-1379 (2014).
  29. Giocomo, L. M., et al. Grid cells use HCN1 channels for spatial scaling. Cell. 147 (5), 1159-1170 (2011).
  30. Stark, E., et al. Inhibition-induced theta resonance in cortical circuits. Neuron. 80 (5), 1263-1276 (2013).
  31. Crandall, S. R., Cruikshank, S. J., Connors, B. W. A corticothalamic switch: controlling the thalamus with dynamic synapses. Neuron. 86 (3), 768-782 (2015).
  32. Steriade, M., McCormick, D. A., Sejnowski, T. J. Thalamocortical oscillations in the sleeping and aroused brain. Science. 262 (5134), 679-685 (1993).
  33. Joshi, A., Salib, M., Viney, T. J., Dupret, D., Somogyi, P. Behavior-Dependent Activity and Synaptic Organization of Septo-hippocampal GABAergic Neurons Selectively Targeting the Hippocampal CA3 Area. Neuron. , (2017).
  34. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. J Neurosci. 34 (34), 11385-11398 (2014).
  35. Craig, M. T., McBain, C. J. Fast gamma oscillations are generated intrinsically in CA1 without the involvement of fast-spiking basket cells. J Neurosci. 35 (8), 3616-3624 (2015).
  36. Pastoll, H., Solanka, L., van Rossum, M. C., Nolan, M. F. Feedback inhibition enables theta-nested gamma oscillations and grid firing fields. Neuron. 77 (1), 141-154 (2013).
  37. Akam, T., Oren, I., Mantoan, L., Ferenczi, E., Kullmann, D. M. Oscillatory dynamics in the hippocampus support dentate gyrus-CA3 coupling. Nat Neurosci. 15 (5), 763-768 (2012).
  38. Mattis, J., et al. Frequency-dependent, cell type-divergent signaling in the hippocamposeptal projection. J Neurosci. 34 (35), 11769-11780 (2014).
  39. Vandecasteele, M., et al. Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13535-13540 (2014).
  40. Stark, E., et al. Pyramidal cell-interneuron interactions underlie hippocampal ripple oscillations. Neuron. 83 (2), 467-480 (2014).
  41. Blumberg, B. J., et al. Efficacy of nonselective optogenetic control of the medial septum over hippocampal oscillations: the influence of speed and implications for cognitive enhancement. Physiol Rep. 4 (23), (2016).
  42. Courtin, J., et al. Prefrontal parvalbumin interneurons shape neuronal activity to drive fear expression. Nature. 505 (7481), 92-96 (2014).
  43. Nagode, D. A., Tang, A. H., Yang, K., Alger, B. E. Optogenetic identification of an intrinsic cholinergically driven inhibitory oscillator sensitive to cannabinoids and opioids in hippocampal CA1. J Physiol. 592 (1), 103-123 (2014).
  44. Bitzenhofer, S. H., et al. Layer-specific optogenetic activation of pyramidal neurons causes beta-gamma entrainment of neonatal networks. Nat Commun. 8, 14563 (2017).
  45. Kondabolu, K., et al. Striatal cholinergic interneurons generate beta and gamma oscillations in the corticostriatal circuit and produce motor deficits. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), E3159-E3168 (2016).
  46. Sohal, V. S., Zhang, F., Yizhar, O., Deisseroth, K. Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance. Nature. 459 (7247), 698-702 (2009).
  47. Pina-Crespo, J. C., et al. High-frequency hippocampal oscillations activated by optogenetic stimulation of transplanted human ESC-derived neurons. J Neurosci. 32 (45), 15837-15842 (2012).
  48. Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
  49. Kim, H., Ahrlund-Richter, S., Wang, X., Deisseroth, K., Carlen, M. Prefrontal Parvalbumin Neurons in Control of Attention. Cell. 164 (1-2), 208-218 (2016).
  50. Lu, Y., et al. Optogenetically induced spatiotemporal gamma oscillations and neuronal spiking activity in primate motor cortex. J Neurophysiol. 113 (10), 3574-3587 (2015).
  51. Kim, T., et al. Cortically projecting basal forebrain parvalbumin neurons regulate cortical gamma band oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3535-3540 (2015).
  52. Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. Gamma-range synchronization of fast-spiking interneurons can enhance detection of tactile stimuli. Nat Neurosci. 17 (10), 1371-1379 (2014).
  53. Gan, J., Weng, S. M., Pernia-Andrade, A. J., Csicsvari, J., Jonas, P. Phase-Locked Inhibition, but Not Excitation, Underlies Hippocampal Ripple Oscillations in Awake Mice In. Neuron. 93 (2), 308-314 (2017).
  54. van de Ven, G. M., Trouche, S., McNamara, C. G., Allen, K., Dupret, D. Hippocampal Offline Reactivation Consolidates Recently Formed Cell Assembly Patterns during Sharp Wave-Ripples. Neuron. 92 (5), 968-974 (2016).
  55. Kim, A., et al. Optogenetically induced sleep spindle rhythms alter sleep architectures in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20673-20678 (2012).
  56. Latchoumane, C. V., Ngo, H. V., Born, J., Shin, H. S. Thalamic Spindles Promote Memory Formation during Sleep through Triple Phase-Locking of Cortical, Thalamic, and Hippocampal Rhythms. Neuron. 95 (2), 424-435 (2017).
  57. Robinson, J., et al. Optogenetic Activation of Septal Glutamatergic Neurons Drive Hippocampal Theta Rhythms. J Neurosci. 36 (10), 3016-3023 (2016).
  58. Fuhrmann, F., et al. Locomotion, Theta Oscillations, and the Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial Septal Glutamatergic Circuit. Neuron. 86 (5), 1253-1264 (2015).
  59. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159 (2005).
  60. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  61. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  62. Buzsaki, G., et al. Multisite recording of brain field potentials and unit activity in freely moving rats. J Neurosci Methods. 28 (3), 209-217 (1989).
  63. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
  64. Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
  65. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  66. Korotkova, T., et al. Reconciling the different faces of hippocampal theta: The role of theta oscillations in cognitive, emotional and innate behaviors. Neurosci Biobehav Rev. , (2017).
  67. Vertes, R. P., Hoover, W. B., Viana Di Prisco, G. Theta rhythm of the hippocampus: subcortical control and functional significance. Behav Cogn Neurosci Rev. 3 (3), 173-200 (2004).
  68. Hasselmo, M. E., Hay, J., Ilyn, M., Gorchetchnikov, A. Neuromodulation, theta rhythm and rat spatial navigation. Neural Netw. 15 (4-6), 689-707 (2002).
  69. Witt, A., et al. Controlling the oscillation phase through precisely timed closed-loop optogenetic stimulation: a computational study. Front Neural Circuits. 7, 49 (2013).
  70. Korotkova, T., Ponomarenko, A. . In Vivo Neuropharmacology and Neurophysiology. , (2017).
  71. Dannenberg, H., et al. Synergy of direct and indirect cholinergic septo-hippocampal pathways coordinates firing in hippocampal networks. J Neurosci. 35 (22), 8394-8410 (2015).
  72. Pikovsky, A., Rosenblum, M., Kurths, J. . Synchronization: A universal concept in nonlinear sciences. 70, (2002).
  73. Boyce, R., Glasgow, S. D., Williams, S., Adamantidis, A. Causal evidence for the role of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science. 352 (6287), 812-816 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены