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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo l'uso di optogenetica e registrazioni elettrofisiologiche per manipolazioni selettive delle oscillazioni di teta hippocampal (5-10 Hz) in topi si comporta. L'efficacia di trascinamento ritmo è controllata mediante potenziali di campo locale. Una combinazione di opto - e farmacogenetica inibizione indirizzi la lettura efferente di sincronizzazione hippocampal.

Abstract

Numerosi dati sulle relazioni delle oscillazioni di rete neurale per comportamento e organizzazione di scarica neuronale in tutte le regioni del cervello chiamano di nuovi strumenti per manipolare in modo selettivo ritmi del cervello. Qui descriviamo un approccio che unisce optogenetica proiezione specifici con extracellulare elettrofisiologia per alta fedeltà controllo delle oscillazioni di teta hippocampal (5-10 Hz) in topi si comporta. La specificità di trascinamento optogenetica è ottenuta prendendo di mira channelrhodopsin-2 (ChR2) alla popolazione delle cellule del setto mediale, fondamentalmente coinvolte nella generazione di oscillazioni di teta hippocampal, GABAergici e un locale sincronizzato l'attivazione di un sottoinsieme delle afferenze inibitorie del setto nell'ippocampo. L'efficacia del controllo ritmo optogenetica è verificata da un monitoraggio simultaneo di local field potential (LFP) da altra parte della lamina dell'area CA1 e/o di scarica neuronale. Utilizzando questa preparazione facilmente implementabile mostriamo l'efficacia di vari protocolli di stimolazione optogenetica per induzione delle oscillazioni di teta e per la manipolazione della loro frequenza e regolarità. Infine, una combinazione del controllo ritmo theta con inibizione proiezione specifica indirizzi la lettura degli aspetti particolari della sincronizzazione hippocampal di regioni efferente.

Introduzione

Attività neuronale nei mammiferi è coordinato dalle oscillazioni di rete, che assistono il trasferimento di informazioni all'interno e tra le regioni del cervello1,2,3,4. Ritmi del cervello sono oscillazioni che vanno da molto lento (< 0,8 Hz) fino a frequenze di ultraveloce (> 200 Hz). Un grande corpo di prova sostiene il coinvolgimento delle oscillazioni di rete nelle funzioni cerebrali diverse, tra cui cognizione5,6,7,8,9,10 , comportamenti innati11,12 , come pure i disordini neuropsichiatrici quali morbo di Parkinson e l'epilessia13,14,15. Metodi selettivi e temporalmente precisi per manipolazione sperimentale delle oscillazioni di rete sono quindi essenziali per lo sviluppo di modelli fisiologicamente plausibile di sincronizzazione e per stabilire relazioni causali con comportamento.

Sincronizzazione di rete è mediata da diversi substrati biologici e processi, che vanno dalla identità molecolare dei canali ionici e loro cinetica di neuromodulazione dell'eccitabilità e della connettività di rete. Il disegno biologico del ritmo generatori16 è stato rivelato per molti ritmi del cervello, aspetti distinti di cui (ad esempio, frequenza, ampiezza) sono spesso causata da dinamiche di tipi cellulari e reti. Per esempio, interneuroni inibitori targeting il somata delle cellule principali sono i giocatori più importanti attraverso bande di frequenza e cervello regioni17,18, tra cui theta19,20, gamma20 , 21e ripple (140-200 Hz)22 oscillazioni. A sua volta, sincronizzazione di fase delle cellule distanti è assicurata dalla robusta feed-forward segnalazione delle cellule piramidali, che reimposta l'infornamento di interneuroni. Un parametro cruciale delle oscillazioni, la dimensione della popolazione neuronale sincronizzata, è strettamente correlato alla ampiezza di oscillazione di LFP misurato e, almeno per veloce oscillazioni, dipende l'unità eccitatorio sulla interneuroni2. Al contrario, oscillazioni più lente, come delta e theta ritmi, vengono generate dai cicli rientrante a lungo raggio, formate da cortico-thalamic23,24 e proiezioni settale mediale hippocampal25, 26,27, rispettivamente. Oscillazioni in tali circuiti sono provocate da interazioni di ritardi di propagazione del segnale, eccitabile risposte e la loro preferenza di frequenza in cellule partecipanti28,29,30, 31 , 32. inibitorie proiezioni da parvalbumina GABAergici (PV)-positive sono cellule del setto mediale (MS) a interneuroni in ippocampo25,33, parahippocampal regioni e corteccia di entorhinal26 essenziale per la generazione delle oscillazioni di teta nel lobo temporale mediale. Così, i meccanismi fisiologici delle oscillazioni di rete e sincronizzazione neuronale possono essere manipolate usando optogenetica con una precisione in tempo reale.

Cella tipo-specific optogenetica manipolazioni sono state applicate per lo studio delle oscillazioni ippocampali e corticali in vitro34,35,36,37,38 e in vivo30,39,40,41,42,43,44,45, tra cui funzionale le indagini di gamma5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 e ripple oscillazioni40,53,54 e sonno mandrini55,56. Recentemente abbiamo espresso un virus ChR2 Cre-dipendente negli Stati membri, una regione chiave per la generazione del ritmo Teta hippocampal, di PV-Cre topi. Utilizzando questa preparazione, caratteristiche delle oscillazioni Teta hippocampal (frequenza e stabilità temporale) sono stati controllati da optogenetica stimolo inibitorio proiezioni del MS in ippocampo11. Inoltre, lo stimolo optogenetica Teta-frequenza delle proiezioni setto-ippocampale inibitorie evocato ritmo theta durante sveglio immobilità. Il optogenetically trascinato ritmo theta visualizzato proprietà delle oscillazioni spontanee theta nel topo a livello di attività neuronale e LFP.

Caratteristiche principali di questo protocollo includono: (1) utilizzo di una via inibitoria che è fisiologicamente fondamentale per le oscillazioni spontanee Teta, evitando effetti aspecifici sull'eccitabilità hippocampal; (2) assonale, cioè, la stimolazione di proiezione specifiche per ridurre al minimo un'influenza diretta sulla non-ippocampale MS efferenze; (3) locale theta-ritmica stimolazione luminosa, assicurando una minima interferenza diretta con dinamiche septo-hippocampal theta-ritmica e un trascinamento globale bilaterale delle oscillazioni theta; (4) parametrici Teta oscillazioni frequenza e regolarità; e (5) quantificazione della fedeltà di trascinamento con elevata risoluzione temporale utilizzando LFP per consentire un'analisi quantitativa di causalità a comportarsi gli animali. Poiché questa preparazione essenzialmente capitalizza un ruolo ben noto della disinibizione setto-ippocampale in theta generazione25,30, permette la regolazione robusto sopra diversi parametri delle oscillazioni di teta in topi si comporta. Gli studi dove altri meno studiati percorsi e tipi di cellule della circuiteria septo-hippocampal sono stati manipolati38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 rivelare ulteriori meccanismi del ritmo theta.

Protocollo

PV-Cre topi knock-in maschio59, 10-25 settimane, sono stati utilizzati. Topi sono stati stabulati in condizioni standard nella struttura animali e tenuti su un ciclo luce/buio di 12 h. Tutte le procedure sono state effettuate in conformità alle linee guida nazionali ed internazionali e sono state approvate dalle autorità sanitarie locali (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. virale iniezione

  1. Durante l'intera procedura, seguire le linee guida di sicurezza biologica60. Indossare un camice, mascherina chirurgica, una retina e due paia di guanti.
  2. Tubazione con un bisturi sterile o forbici del taglio di circa 1 m di lunghezza, inserirlo nel blocco siringa titolare della pompa e risolvere il problema.
    1. Utilizzando la siringa, riempire il tubo interamente con olio di silicone.
    2. Verificare se le bolle d'aria visibili nella tubazione. Se si osservano bolle d'aria, riempire nuovamente il tubo con olio.
    3. Difficoltà lo stantuffo per il blocco di pusher.
    4. Far avanzare lentamente il pestello verso il blocco di porta siringa fino a quando la punta dello stantuffo tocca il tubo.
    5. Inserire la punta del pistone nel tubo e spostare automaticamente il blocco di spintore avanti a bassa velocità selezionando "Infondere" nella finestra di comando e un tasso di infusione bassa (ad esempio, 500 nL/min) fino a raggiungere il blocco porta siringa.
  3. Preparare l'ago per iniezione (34G).
    1. Rimuovere il mozzo dell'ago con un chiaro taglio utilizzando un trapano fresatore precisione collegato a un disco di taglio. Se necessario, utilizzare un ago per rimuovere residui metallici dalla superficie appena tagliata.
    2. Filettatura tubi capillari (3-4 cm di lunghezza) attraverso l'ago.
    3. Incollare l'ago al tubo con colla super.
    4. Collegare l'ago per iniezione all'estremità della tubazione, che collega alla pompa microsiringa.
  4. Montare l'ago al titolare stereotassica.
  5. Estrarre aria fino a quando una bolla d'aria nel tubo trasparente sopra l'ago è visibile.
  6. Anestetizzare il mouse con isoflurane 1.5-3% in ossigeno. Attendere circa 2-3 min, quindi confermare che il mouse è completamente anestetizzato valutando la sua risposta a un pizzico di punta. In tutta la chirurgia monitorare la respirazione dell'animale e regolare la concentrazione di isoflurane se necessario.
  7. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica con non-traumatico ear holder.
  8. Proteggere gli occhi del mouse con un gel di lipidi.
  9. Iniettare lidocaina 0,1 mL per via intradermica sotto la pelle di testa usando un 0,01-1 mL siringa e una cannula di iniezione 26G.
  10. Rasatura e disinfettare la testa del mouse utilizzando la soluzione di etanolo. Poi si alternano tre volte 2% clorexidina con etanolo per disinfettare il sito chirurgico.
  11. Eseguire un'incisione del midline usando forbici sottili e taglienti, andando da tra il retro delle orecchie al livello degli occhi, in modo che il bregma e lambda sono visibili.
  12. Pulire il teschio applicando circa 50 µ l di NaCl usando una siringa e asciugare con un fazzoletto di carta e un soffio di aria.
  13. Posizionare la testa del mouse regolando il livello di dorso-ventrale del morsetto naso affinché il bregma e lambda sono allo stesso livello del dorso-ventrale (± 0,3 mm).
  14. Praticare un foro sopra il MS (AP 0,98 e L 0,5 mm in riferimento il bregma).
  15. A questo punto, sbrinamento un'aliquota del virus (deve contenere almeno 2 µ l di AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) per circa 5 min a temperatura ambiente (TA).
  16. Centrifugare l'aliquota a circa 4.000 x g a RT per 1 min.
  17. Pipetta il 2 µ l del virus su un pezzo di Parafilm; usare il lato protetto in precedenza.
  18. Immergere la punta dell'ago per iniezione nel liquido e prelevare con cautela a circa 500 nL/min osservando il livello del liquido. Per evitare l'aspirazione di aria, è necessario interrompere ritiro prima che il virus è completamente preso. Regolare la frequenza di prelievo secondo la viscosità della soluzione; un tasso più veloce può facilitare il prelievo di un virus con maggiore viscosità.
  19. Pulire l'ago con un fazzoletto di carta.
  20. Verificare che il virus è contenuto nel tubo e il virus e l'olio sono separati da una bolla d'aria. Contrassegnare il livello del virus sul tubo al fine di controllare se virus è infuso con successo durante l'iniezione.
  21. Posizionare l'ago sopra il craniotomy e inserirla lentamente nel cervello al primo punto di iniezione (AP 0,98, L 0.5, V -5.2, laterale di 5,5 °).
  22. Iniettare 450 nL del virus a un tasso di 100-150 nL/min attendere 10 min attentamente spostare l'ago fino a 0,1 mm e attendere un altro 5 min.
    1. Spostare l'ago per il secondo punto di iniezione (AP 0,98, L 0.5, V -4,6) e iniettare un altro 450 nL a 100-150 nL/min.
    2. Attendere ancora per 10 min prima di spostare l'ago fino a 0,1 mm. aspettare un altro 5 minuti prima di rimuovere l'ago.
  23. Sutura l'incisione con sutura seta nero intrecciato con nodi quadrati. Caldo l'animale con una luce rossa per accelerare il recupero. Amministrare gli antibiotici (0,3 mL Erycinum (1:4 in soluzione sterile di NaCl)) e carprofen i.p. giornaliere 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  24. Tagliare il tubo sopra il segno che indicava il livello del virus. Il tubo può essere utilizzato per ulteriori iniezioni. Preparare un ago per iniezione fresco prima di ogni iniezione.
    Nota: Questo intervento chirurgico richiede circa 1-1.5 h. L'animale si sveglia in genere entro 5 min dopo la chirurgia. Attendere un minimo tempo di 6 settimane per sufficiente espressione axonal ma non più di 5 mesi prima di eseguire gli impianti stereotassica, come i livelli di espressione cominciano a diminuire di circa 6 mesi dopo l'iniezione di virus.

2. preparazione di fibre ottiche (Figura 1A)

  1. Utilizzare la fibra ottica multimodale (105 µm core, vetro rivestito con nucleo di silice, NA 0.22). Rivestimento con nastri 125 µm di nucleo della fibra utilizzando una micro-spogliarellista, mentre la fibra è ancora attaccata alla bobina della fibra.
  2. Tagliare la fibra ad una lunghezza di circa 2-3 cm con un coltello di diamante.
  3. Inserire la fibra in un puntale di ceramica bastone di zirconia (ID: 126 µm). Circa 0,5-1 mm della fibra ottica deve sporgere dal lato convesso della ghiera.
  4. Utilizzando un ago, applicare una goccia di colla a resina epossidica a entrambe le estremità della ghiera, ma non sui lati della ghiera. In alternativa, utilizzare colla super.
  5. Consentire la colla si asciughi per almeno 30 min.
  6. Polacco il lato convesso della ferrula utilizzando diamante lappatura fibra lucidatura pellicola (3 µm grane).
  7. Testare la fedeltà di luce trasferimento utilizzando un misuratore di potenza ottica.
    1. Impostare la lunghezza d'onda il misuratore di potenza alla stessa lunghezza d'onda come il laser viene utilizzato.
    2. Posizionare il cavo di patch con la punta rivolta verso il centro del sensore. Accendere il laser e leggere la potenza luminosa dal misuratore di potenza. Registrare il valore.
    3. Collegare la fibra ottica per il cavo di patch tramite un manicotto di accoppiamento e posizionarlo con la punta della fibra rivolto verso il centro del sensore. Accendere il laser e leggere la potenza luminosa dal misuratore di potenza. Registrare il valore.
    4. Calcolare il tasso di trasmissione: dividere il secondo valore dal primo valore. Se la velocità di trasmissione è inferiore a 0,5, scartare la fibra, in caso contrario utilizzarlo per l'impianto.
    5. Testare la velocità di trasmissione per ogni fibra prima dell'impianto.
    6. Per esperimenti successivi, regola l'uscita di intensità della luce del laser per la velocità di trasmissione della fibra ottica: impostare l'uscita luce dalla punta cavo di zona a 5-15 diviso per il tasso di trasmissione per ottenere un output finale di luce dalla punta della fibra del 5-15 mW.
      Nota: Vedere anche Rif. 61 per la preparazione di fibre ottiche.

3. preparazione del filo di tungsteno matrici per LFP registrazioni (Figura 1B)

  1. Diversi (per esempio 6) colla 100 µm guide di tubo di silice in parallelo con il lato di un pezzo di nastro adesivo. Tagliare un pezzo, circa 4-6 mm, per un filo di montaggio di matrice.
  2. Filo formvar-isolamento di fili di tungsteno 45 µm attraverso i tubi di guida usando il forcipe.
  3. Striscia sei isolati smalto rame raffinato incollaggio fili (circa 5 mm di lunghezza) e un filo di messa a terra (circa 2-3 cm di lunghezza) utilizzando un bisturi per raschiare via l'isolamento su entrambe le estremità. Saldarli ai pin nanoconnector.
  4. Collegare ogni legame di filo di uno tungsteno utilizzando una goccia di vernice conduttiva argento, rispettivamente. Lasciare asciugare per almeno 30 min.
  5. Applicare una minima quantità di cemento per coprire i fili. Non applicare il cemento sui fili di tungsteno, che verranno inseriti nel tessuto cerebrale o sulla parte superiore della nanoconnector. Lasciate che il cemento asciutto per almeno 30 min.
  6. Eseguire un taglio angolare (5-20°) i fili di tungsteno usando smussato in acciaio inox forbici per attivare l'impianto affidabile di fili qui sotto o sopra la zona ventralmente adiacente il corneum pyramidale, cui l'ampiezza di teta è troppo bassa per la stima della fedeltà di trascinamento.
  7. Deinsulate la punta (circa 2 mm) del cavo di terra utilizzando un bisturi per raschiare via l'isolamento. Trattare con flusso e presolder.
  8. Potenziale di controllo cross-talk tra elettrodi utilizzando una fotocamera digitale multimetro. A tale scopo, collegare i pin del connettore per il multimetro, che deve essere impostato la modalità di misurazione di resistenza. Verifica pairwise combinazioni di canali; una lettura del multimetro sotto 5 MΩ indica significativa diafonia.
  9. Verificare l'impedenza di ciascun elettrodo filo in Salina utilizzando un misuratore di impedenza. I valori di impedenza tipica sono sotto 100 kΩ.
  10. Per facilitare l'impianto, colla una fibra ottica nella matrice di filo in modo che la punta della fibra è al livello del filo più breve e la punta della fibra è nelle immediate vicinanze, ma non toccare i fili di tungsteno. Mantenere l'angolo della fibra più piccolo possibile per evitare danni ai tessuti durante l'impianto.
    Nota: Vedere anche Rif. 62 per la fabbricazione di matrici di filo di tungsteno.

4. stereotassica Implantations

  1. Eseguire preparazioni come descritto nei passaggi 1.6-1.13.
  2. Rimuovere il tessuto connettivo dalla parte superiore del cranio e spingere verso il basso i muscoli del collo accuratamente di circa 2 mm per evitare artefatti muscolari durante la registrazione.
  3. Pulire il cranio utilizzando un cotton-fioc e saline e 4 fori (2 nella parte anteriore) e 2 sopra il cervelletto, diametro 0,8 mm per posizionare le viti di acciaio inossidabile di osso (00-96 x 1/16) per terra e la stabilizzazione dell'impianto (Figura 1). Posizionare la vite di terra, collegata a un filo di rame (circa 2-3 cm di lunghezza) sopra il cervelletto.
  4. Coprire la vite a terra completamente con il cemento per evitare artefatti muscolari durante le registrazioni elettrofisiologiche. Costruire un anello di cemento che collega tutte le viti (Figura 1E).
  5. Eseguire una craniotomia sopra il lato impianto (ippocampo, AP-1.94, 1.4 L, V 1.4 in riferimento il bregma). Applicare circa 5 µ l di soluzione sterile di NaCl sulla superficie del tessuto cerebrale.
  6. Abbassare lentamente la matrice di filo utilizzando stereotaxis nel craniotomy. Per le registrazioni unitarie, impiantare una sonda in silicone invece un filo matrice63; al fine di evitare artefatti luce optoelectric, impiantare la fibra ottica separatamente nell'ippocampo con la punta della fibra non direttamente di fronte la sonda (Figura 1 -io). Per indagine del coordinamento di trascinamento tra gli emisferi, impiantare una fibra ottica supplementare nella zona CA1 hippocampal controlaterale.
  7. Applicare circa 5 µ l di olio di cera/paraffina liquida calda, preriscaldato a 70 ° C, con una siringa sopra il sito di impianto per proteggere il tessuto cerebrale.
  8. Applicare il cemento intorno a matrice metallica e coprire il cranio con il cemento.
  9. Applicare una goccia di flusso per il filo di terra/riferimento presoldered e il presoldered filo collegato alla vite di massa utilizzando per esempio un ago e si fondono i fili utilizzando una macchina di saldatura.
  10. Coprire il filo di terra intera con cemento.
  11. Amministrare 0,3 mL Erycinum (1:4 in soluzione sterile di NaCl) e i.p. carprofen (5mg/mL) dopo l'intervento chirurgico e per almeno i due giorni successivi. Il mouse si sveglia in genere entro 15 min dopo la chirurgia. Caldo l'animale con una luce rossa per accelerare il recupero.
  12. Monitorare quotidianamente il peso del mouse per la prima settimana dopo l'intervento, o fino a quando il peso è stabile. Perdita di peso non deve superare il 10% del peso del mouse registrato prima della chirurgia. Per accelerare la stabilizzazione del peso, è necessario fornire il mouse con cibo umido e latte condensato durante i primi giorni dopo l'intervento.
  13. Per registrare l'attività cellulare hippocampal durante il trascinamento, impiantare una sonda in silicone nell'ippocampo (AP-1.94, 1.4 L, V 1, con conseguente abbassamento) come descritto in rif. 62 (Figura 1 -io). Impiantare la fibra ottica nell'ippocampo presso AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudale rostrale. Impiantare una fibra ottica supplementare in MS (AP +0.98, 1 L, V 3.9, laterale di 15 °) se la stimolazione di somata cella è desiderata.

5. optogenetica stimolazione e acquisizione dati elettrofisiologici

  1. Habituate il mouse per il setup di registrazione (ad esempio, sessioni di 15 min, 1-2 sessioni al giorno per 3 giorni). Esaminare il comportamento dell'animale prima di iniziare con i primi esperimenti. Se il mouse viene spostato nella camera, esplorare l'ambiente, sniffing, esecuzione di allevamenti, ecc., iniziare la prima sessione sperimentale.
  2. Posizionare il mouse in una camera familiare in assenza di altri animali nella stessa stanza.
  3. Collegare un LED a testa-stage utilizzando nastro adesivo per tracciare la posizione dell'animale. Assicurarsi che la luce del LED è catturata dalla fotocamera durante tutto il periodo che l'animale sta esplorando la camera di registrazione prima di iniziare gli esperimenti. Registrare nel buio al fine di monitorare la luce del LED. Posizionare una telecamera sopra la camera di registrazione.
  4. Verifica la potenza luminosa dal cavo di patch. Stimare la potenza luminosa dalla punta della fibra dopo la connessione a seconda della velocità di trasmissione della fibra impiantato. Assicurarsi che la potenza luminosa dalla punta della fibra è tra 5-15 mW, per consentire il trascinamento affidabile.
  5. Collegare il preamplificatore headstage al connettore cronicamente impiantato. Collegare il cavo a fibre ottiche di patch alla fibra hippocampal cronicamente impiantata per esperimenti di stimolazione optogenetica. In esperimenti di stimolazione luminosa di controllo, collegare la fibra ottica a un manichino puntale collegato all'auricolare.
  6. Posizionare il mouse nella camera di registrazione.
  7. Aprire il software per controllare il generatore di stimolo per generare il protocollo di stimolazione.
  8. Selezionare il canale che controlla il laser DPSS 473 nm. Nella prima riga Inserisci 3.000 mV (1 ° colonna), tempo di 30 ms (2 ° colonna), valore 0 mV (3 ° colonna), tempo di 112 ms (colonna 4), riga 840 ripetere e ripetere 1, per generare un protocollo per 2 min di 7 Hz stimolazione con impulsi lunghi 30 ms di gruppo. Se è necessaria la stimolazione ad un'altra frequenza o una durata diversa, regolare la durata di tempo nella 4 ° colonna e numero di ripetizioni di fila. Nella seconda riga selezionare 0 mW (1 ° colonna), tempo h 500 (2 ° colonna), ripetizione di riga 1 e gruppo ripetizione 1, per garantire che il laser sia essere spento dopo il protocollo di stimolazione è terminato.
  9. Fare clic su "File > Salva con nome" e salvare il file con un nome desiderato.
  10. Assicurare che l'elettrostimolatore TTL output intervento laser è collegato alla scheda input analogica digitale Lynx per sincronizzare l'acquisizione di elettrofisiologici e optogenetica dati.
  11. In alternativa, per parametricamente regolano la variabilità della frequenza di oscillazione di teta, applicare i treni di impulsi di luce a diversi intervalli Inter-impulso, con periodi seguendo una distribuzione gaussiana. Modificare la dispersione degli intervalli Inter-impulso per protocolli diversi, ad esempio, dal punto 3.2 a 15,1 ms2. Applicare questi protocolli per generare epoche theta con diversa variabilità della frequenza theta (Figura 6).
  12. Aprire il software di sistema di registrazione. Fare clic su "ACQ" per acquisire e "REC" per registrare. Attendere prima di iniziare la stimolazione luminosa per registrare il comportamento della linea di base (ad es., 2 min per recuperare velocità basale o 30 min per estrarre i campi del posto della linea di base).
  13. Aprire il software per controllare il generatore di stimolo. Fare clic su "File > Open" e selezionare il file di protocollo di scelta. Fare clic su "Scarica e Start" per avviare la stimolazione luminosa.
    Nota: L'esperimento può essere oggetto di indagine, e la stimolazione avviato tramite telecomando; Questo esclude l'influenza della presenza dello sperimentatore sul comportamento dell'animale. A seconda l'obiettivo dello studio, stimolazione può essere iniziata e terminata durante comportamenti specifici.

6. un approccio combinato per trascinamento optogenetica e inibizione di proiezione specifica dell'Output Hippocampal

  1. Rapidi, ChR2 in MS GABAergici cellule di PV-Cre topi, come descritto nella sezione 1.
  2. Inoltre, iniettare un totale di 2,4 µ l di CamKIIα dipendente halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) in entrambi gli emisferi hippocampal dorsali (AP -1,7; L ± 1.05; V-2.05 e - 1.4 mm; AP -1,7; L ± 1.7; V-2.05 e - 1,55 mm; AP -2,3; L ± 1,5; V -2.2 e - 1.3 mm; AP -2,3; L ± 2.2; V-1.65 e - 2.45 mm).
  3. Consentire 6 settimane di tempo di espressione.
  4. Impiantare una matrice di filo di tungsteno con fibra ottica nella regione CA1 hippocampal, come descritto nella sezione 4. Inoltre, impianto a fibre ottiche bilateralmente nel setto laterale (LS, AP 0.1, 0.25 L, V-2,250 mm e AP 0.5, L -0,3, V-2,70 mm).
  5. Esperimenti di optogenetica Teta trascinamento come descritto nei passaggi 5.4-5.5.
    1. Per simultanea inibizione dell'uscita hippocampal di LS, generare una generazione di stimolo di protocollo: per esempio, trigger l'insorgenza d'uscita del canale collegato al 593 nm DPSS laser 15 s con un impulso continuo che dura in totale 45 s, prima di far scattare l'uscita di impulsi per il laser DPSS 473 nm.
    2. Collegare entrambe le fibre in LS tramite patch cord mediante un accoppiatore ottico di fibra multimodale ad un laser DPSS 593 nm.
    3. Avviare la registrazione e scaricare e attivare il protocollo per controllare la generazione di stimolo.

7. trattamento dei dati

  1. Convertire i segnali elettrofisiologici e posizionare i dati di rilevamento con dati neurofisiologici (ND) Manager formati. dat e .pos, rispettivamente64.
  2. Ottenere la LFP di filtro passa-basso e down-sampling del segnale a larga banda a 1.250 Hz usando ND Manager66.
  3. In ogni registrazione, selezionare il canale con la massima ampiezza di teta oscillazioni (utilizzando Neuroscope)19.
  4. Rilevare i timestamp degli impulsi laser e delle epoche stimolazione con una soglia di rilevazione algoritmo (utilizzando MATLAB funzione findpeaks.m o simili)11.
  5. Per importare il file. dat in un software di analisi di dati multi-canale, fare clic su "File > Importa" e selezionare "file binari" come tipo di dati selezionare il file dat. Nella finestra di dialogo configurazione, immettere il numero corretto di canali e una frequenza di campionamento di 1.250 Hz, fare clic su "ok" e salvare come file .smr. Tracciare gli spettri di potenza selezionando "Analisi > nuovo risultato vista > PowerSpectrum". In impostazioni, selezionare il canale con l'ampiezza più alta di teta e 16.384 dimensione FFT, fare clic su "Nuovo", definire come "Ora inizio" all'inizio dell'epoca stimolazione e come "End time" alla fine dell'epoca di stimolazione e fare clic su "Processo".
  6. Calcolare la fedeltà di trascinamento come il rapporto tra la densità spettrale di potenza cumulativa (PSD) all'interno della gamma di frequenza di stimolazione optogenetica (stimolazione frequenza ± 0,5 Hz), per il PSD cumulativo nella banda theta (5-12 Hz) con il metodo multitaper (NW = 3, dimensione della finestra 8.192) per 10 epoche di s (ad es., toolkit < http://chronux.org/>).
  7. Escludere le epoche di registrazione dove il picco PSD dominante è ≤ 5 Hz da analisi (non-theta epoche, utilizzando MATLAB funzione find.m).
  8. Tracciare il raster degli spettri di potenza LFP per tutte le epoche registrate secondo la fedeltà di trascinamento computata (utilizzando pcolor.m e sortrows.m funzioni MATLAB). Caricare gli spettri di potenza e trascinamenti fedeltà facendo clic su "File > Open", memorizzati potenza variabile di tipo pollici = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

Risultati

Targeting di ChR2 alle cellule di GABAergic in MS come descritto nella sezione 1 è illustrato nella Figura 2A. Optogenetica stimolazione degli assoni delle cellule MS GABAergici nell'ippocampo dorsale tramite una fibra ottica che viene impiantata sopra l'area CA1 entrains oscillazioni di teta alla frequenza dello stimolo a ipsilateral (Figura 2B) così come controlaterale emisfero (Figura 2). Oscill...

Discussione

Qui abbiamo presentato una metodologia ampiamente accessibile per salire sul treno e suscitare le oscillazioni di teta hippocampal nel comportamento degli animali. Questo approccio può essere utile per gli studi di funzioni di teta ritmo nell'elaborazione delle informazioni e nel comportamento. Aspetti critici di questo metodo includono: (1) scelta dell'opsina e targeting di ChR2 di assoni di MS cellule nell'ippocampo, caratteristiche ottiche ed elettriche (2) robuste degli assembly di matrice impiantati cavi fibra otti...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare Maria Gorbati per aiuto di esperti con l'analisi dei dati e Jennifer Kupferman per commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; EXC 257 NeuroCure, TK e AP; Programma prioritario 1665, 1799/1-1(2), programma di Heisenberg, 1799/2-1, AP), la Fondazione di tedesco-israeliano per la ricerca scientifica e lo sviluppo (GIF; Io-1326-421.13/2015, TK) e Human Frontier Science Program (HFSP; RGY0076/2012, TK).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
PV-Cre miceThe Jackson LaboratoryB6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgery
StereotaxisDavid Kopf Instruments, Tujunga, CA, USAModel 963Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mmBijoutil, Allschwil, Switzerland49080HM
0.01-1 ml syringeBraun, Melsungen, Germany9161406V
Sterican cannulasBraun26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissorsFine Science Tools Inc., Vancouver, Canada14060-09
ForcepsFine Science Tools Inc.11210-10Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissorsFine Science Tools Inc.14018-14
Soldering stationWeller Tools GmbH, Besigheim, GermanyWSD 81
ErythromycinRotexmedica GmbH, Trittau, GermanyPZN: 108239321g Powder for Solution for Infusion
NameCompanyCatalog NumberComments
Optogenetics
Hamilton pumpPHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USAmodel 703008PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gaugePHD Ultra, Harvard ApparatusModel 75 RN SYR
Hamilton 5 µL PlungerPHD Ultra, Harvard ApparatusModel 75 RN SYR
TubingFisher Scientific, Pittsburgh, USAPE 20Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulasBraun, Melsungen, Germany27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinderProxxon, Wecker, Luxemburgfbs 240/e
Cutting disksProxxonNO 28812
Cre dependent channelrhodopsinPenn Vector Core, Philadelphia, PA, USAAV-1-18917PContruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsinPenn Vector CoreAV-1-26971PConstruct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiberThorLabs, Dachau, GermanyFG105LCA0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrulePrecision Fiber Products, Milpitas, CA, USACFLC126Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paperThorlabsLF3D6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meterThorlabsPM100DCompact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic couplerThorlabsFCMM50-50A-FC1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cordThorlabsFG105LCA CUSTOM-MUCcustom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
SleevePrecision Fiber Products, Milpitas, CA, USAADAL1Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laserLaserglow Technologies, Toronto, ON, CanadaR471005FXLRS-0473 Series
593 nm DPSS laserLaserglow TechnologiesR591005FXLRS-0594 Series
MC_Stimulus IIMultichannel Systems, Reutlingen, GermanySTG 4004
Impedance conditioning moduleNeural microTargeting worldwide, Bowdoin, USAICM
NameCompanyCatalog NumberComments
Electrophysiology
Tungsten wiresCalifornia Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USACFW001095440 µm, 99.95%
Capillary tubingOptronics1068150020ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnectorOmnetics Connector Corporation, Minneapolis, USAA79038-001
ScrewsBilaney, Düsseldorf, Germany00-96x1/16stainless-steel
Silicone probeNeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USAB32
HeadstageNeuralynx, Bozeman, Montana USAHS-8miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paintConrad electronics, Germany530042
Liquid fluxFelder GMBH Löttechnik, Oberhausen, GermanyLötöl STDIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LEDNeuralynxHS-LED-Red-omni-10V
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
MATLABMathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus softwareMultichannel, Systems
Neurophysiological Data ManagerNDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klustershttp://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording systemNeuralynxCheetahhttps://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis softwareCambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GBSpike2

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