Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Résumé

Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.

Résumé

Fractures osseuses importantes de non syndiqués sont un défi en chirurgie orthopédique. Bien qu’auto - et greffe osseuse allogénique est excellente pour la guérison des lésions, il y a des complications potentielles à leur utilisation. Ainsi, matériels scientifiques mettent au point des biomatériaux synthétiques, biocompatibles pour résoudre ces problèmes. Dans cette étude, nous présentons une plateforme multidisciplinaire pour l’évaluation de biomatériaux pour la réparation osseuse. Nous avons combiné expertise biologie osseuse et d’immunologie de développer une plate-forme y compris in vitro ostéoclastes (OC) et dosages des ostéoblastes (OB) et in vivo de modèles murins de la réparation osseuse, immunogénicité et d’allergénicité. Nous montrent comment réaliser les expériences, résument les résultats et rapport sur la biocompatibilité de biomatériau. En particulier, nous avons testé la viabilité de l’OB, la différenciation et minéralisation et viabilité OC et différenciation dans le contexte des disques de β-tricalcium phosphate (β-TCP). Nous avons aussi testé une mousse (β-TCP/C) de β-TCP/collagène qui est un matériau disponible dans le commerce, utilisé en clinique pour la réparation osseuse dans un modèle murin de taille critique de substance osseuse défaut pour déterminer les effets sur la première phase de cicatrisation osseuse. Dans des expériences parallèles, nous avons évalué les réponses immunitaires et allergiques chez les souris. Notre approche génère un profil de compatibilité biologique d’un biomatériau osseux avec une gamme de paramètres nécessaires pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la guérison osseuse et la réparation chez les patients.

Introduction

La réparation osseuse est un processus complexe qui commence par la formation d’un hématome, une inflammation, Cal formation et remodelage puis^1,2. Toutefois, le potentiel de régénération osseuse est limité à la taille de l’OS fracture^1,3. Par exemple, les fractures des os grand causées par un traumatisme, le cancer ou l’ostéoporose ne peuvent pas guérir et sont appelées fractures osseuses non syndiqués. Ces lésions osseuses nécessitent souvent des traitements pour promouvoir la régénération et la réparation osseuse physiologique sain. Actuellement, autogreffe et allogreffe osseuse transplantation est l’approche de choix⁴ avec les procédures de remplacement des OS 2,2 millions par an⁵. Bien que ces procédures ont un taux de réussite élevé, il peut y avoir des complications, par exemple, la disponibilité limitée des os, infection, morbidité du site donneur et rejet⁴. De nouvelles alternatives pour l’ingénierie tissulaire osseuse sont recherchés pour relever ces défis.

La conception des biomatériaux à base de polymères naturels ou synthétiques, des biocéramiques ou des métaux en combinaison avec les cellules et molécules bioactives est sur l' élévation⁶. Notre compréhension actuelle des os physiologiques de guérison et de guérison dans le contexte des biomatériaux dépend de divers facteurs tels que les propriétés mécaniques et de multiples facteurs les et systémiques, y compris les cellules de la circulation et le site de fracture^{7 ,8,9}. Biomatériaux pour la régénération osseuse vise à promouvoir les osteogenicity et ostéointégration¹⁰ et est idéalement biocompatible et biodégradable poreux (promotion de nutriments, l’oxygène et la migration cellulaire). Ils doivent également être suffisamment solide pour supporter le site fracture pour soulager la douleur. En outre, des facteurs inflammatoires sont tenus d’engager le processus de guérison. Toutefois, si le biomatériau induit une inflammation excessive et réactions allergiques, cela pourrait limiter ou inhiber l’OS guérison^11,12. Ainsi, une approche interdisciplinaire est nécessaire pour évaluer les biomatériaux destinés à la réparation osseuse.

Dans cette étude, nous présentons une évaluation préclinique de matières représentatives, 1) Orthovita Vitoss mousse qui est un substitut de greffe disponible dans le commerce d’os spongieux consistant en phosphate tricalcique composée de taille nanométrique pur β tricalcique les particules de phosphate (β-TCP) et collagène bovin de Type 1 (C) (β-TCP/C mousse) et 2) des disques de β-TCP. Ici, nous illustrons test de biocompatibilité de ces biomatériaux à l’aide des ostéoblastes primaires (OB) et dosages des ostéoclastes (OC), un modèle in vivo de la réparation osseuse, une évaluation immunologique comprenant in vitro la prolifération des lymphocytes T et la production de cytokines et in vivo de l’immunogénicité et l’allergénicité, comme indiqué précédemment¹³.

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Protocole

Les procédures ont été effectuées avec des souris BALB/c après toutes les directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Ministère autrichien de l’Education, Science and Research et ont été approuvés par le Comité sur l’éthique du Ministère autrichien de l’Education, Science et de la recherche.

1. primaire souris OB Culture

1. Isolement d’OB de calotte cranienne de souris néonatales par digestion enzymatique
   1. Euthanasier les chiots nouveau-nés vieux de 1 à 2 jour (60 au total) par décapitation et placez les têtes dans une boîte de Pétri stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Maintenez la tête par la nuque et couper la peau suite à l’aide de ciseaux stériles. Inciser la voûte crânienne en perçant il (environ 0,1 à 0,3 mm) avec une paire de ciseaux qui est ensuite insérés sous la voûte crânienne à l’arrière de la tête à la base du crâne et couper le long du bord substance latéralement de l’arrière vers l’avant au-dessus des oreilles et puis abov e l’arête nasale (Figure 1).
   3. Incuber calvaria disséqué avec 8 mL de solution de digestion filtre stérilisé (300 unités/mL collagénase type IV et 2,14 a unités/mL II dissous dans un milieu essentiel minimum α (α-MEM)) dans un tube conique de 50 mL à 37 ° C pendant 10 min dans un incubateur à agitation à 200 shakes / min.
   4. Jeter le surnageant première et répéter le processus de digestion trois fois avec 8 mL de solution de digestion. Récupérer le surnageant contenant les cellules après chaque étape de la digestion et l’ajouter à un tube conique de 50 mL. Ranger le tube conique de 50 mL avec les cellules dans un bain d’eau glacée avant d’avoir terminé la procédure de la digestion (environ 40 min).
   5. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant (avec une pipette Pasteur attachée à une pompe à vide) et resuspendre dans 40 mL de milieu de croissance osseuse (BGM) contenant des α-MEM avec 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) et 1 % solution de pénicilline-streptomycine. Ajouter ensuite 10 mL de la suspension cellulaire aux 4 plaques de culture de tissus (10 cm).
   6. Culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂ jusqu’au confluent (2 – 3 jours).
   7. Au confluent, aspirer le milieu vieux et laver les plaques de culture de tissu une fois avec du PBS 1 x (37 ° C). Puis aspirer le PBS et ajouter 2 mL de solution de trypsine 1 x contenant 0,5 % d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour chaque plaque de culture de tissu de 10 cm.
   8. Incuber les boîtes de 4 culture à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 5 min, puis vérifiez les plaques avec un microscope inversé léger pour s’assurer que les cellules sont détachent de la matière plastique. Puis transférez toutes les suspensions cellulaires (total 8 mL) dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de BGM fraîche. Lavez chaque plaque avec 5 mL de frais BGM et transfert vers le même tube conique de 50 mL.
   9. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules de 16 mL de BGM fraîche. Préparer 16 nouvelles 10 cm tissue culture plaques (Division 1:4) contenant 9 mL de BGM. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque assiette.
   10. Répétez les étapes 1.1.6. à 1.1.8.
   11. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 mL de BGM fraîche. Compter les cellules et calculer la concentration en cellules.
       Remarque : Cette procédure génère environ 7,5 – 8,3 x 10⁵ cellules/chiot.
   12. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans de la moyen 10 % contenant du diméthyl sulfoxyde (DMSO), α-MEM de 40 % et 50 % FBS. Transfert en 1,5 mL de la suspension cellulaire à 2 mL cryovials pour un total de 2 x 10⁶ cellules par flacon.
   13. Flash gel les flacons dans l’azote liquide pour le stockage à long terme dans un réservoir d’azote liquide. Utiliser les cellules dans l’année afin d’assurer la pleine fonctionnalité. Utilisent ces OBs primaires pour évaluer la prolifération (étape 1.2), la différenciation (dosages ALP : étape 1.4., 1.5.) et la minéralisation (étape 1.6.) en présence des biomatériaux. Utiliser ces cellules pour la maturation des précurseurs d’OC OS-moelle osseuse en co-culture (étape 2.3).
2. Essai de prolifération OB
   1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre de 14 mm dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 24 h avant d’ajouter les plaques de vitroplants standard OBs. utilisation primaires pour les contrôles et les plaques de culture de suspension pour les exemples de biomatériau pour éviter la fixation des cellules de la matière plastique.
   2. Aspirer le milieu d’incubation avant et puis remettre en suspension les OBs de souris primaire de BGM. Ajouter 4,4 x 10⁴ OBs/cm² sur les disques pré-incubées β-TCP dans une plaque de culture 24 puits suspension et pour le groupe témoin, dans une plaque de culture de tissus de 24 puits (1 mL/puits). OBs seront attachera à la plaque de culture tissulaire ou ce biomatériau.
   3. Incuber pendant 14 jours à 37 ° C et 5 % de CO₂. Au cours de la période d’incubation, changer le milieu tous les 2-3 jours et ajouter 1 mL de BGM frais dans chaque puits.
   4. Pour évaluer la prolifération de l’OB, transférer les disques de β-TCP 7 et 14 jours à nouveaux puits d’exclure les signaux provenant des cellules cultivées sur la plaque de culture de suspension.
   5. Aspirer le milieu ancien, ajouter 0,5 mL de BGM (37 ° C) et incuber les boîtes de culture pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO₂. Puis ajoutez 55 µL de 10 x réactif de prolifération cellulaire (01:10 dilution) directement dans le puits de la culture. Pour les flans, préparer trois puits contenant 0,5 mL de BGM et 55 µL de la prolifération des hématies 10 x. Incuber les boites pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO₂.
   6. Retirer et de transférer 150 µL de surnageant de chaque puit dans une plaque 96 puits noire et de lire la fluorescence avec excitation à 560 nm et d’émission à 590 nm. Soustraire les lectures vierges d’après les relevés de l’échantillon.
3. Tests de différenciation et de la minéralisation OB
   1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre de 14 mm dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 24 h avant d’ajouter les plaques de culture de tissus standard OBs. utilisation des contrôles et des plaques de culture de suspension pour les échantillons de biomatériau éviter fixation des cellules de la matière plastique.
   2. Aspirer le milieu d’incubation avant et puis remettre en suspension les OBs de souris primaire de BGM. Ajouter 8,8 x 10⁴ OBs/cm² sur les disques pré-incubées β-TCP dans une plaque de culture 24 puits suspension et pour le groupe témoin, dans une plaque de culture de tissus de 24 puits (1 mL/puits). OBs seront attachera à la plaque de culture de tissus ou de l’échantillon de biomatériau.
   3. Remplacez le BGM par 1 mL de milieu de minéralisation ostéogénique (MM) contenant des BGM, 50 µg/mL d’acide ascorbique et 5 mM β-glycérophosphate 24h après l’ajout de l’OBs et incuber pendant 14 jours à 37 ° C et 5 % de CO₂. Changer le milieu tous les 2 – 3 jours avec 1 mL de MM fraîchement préparée dans chaque puits.
4. Différenciation d’OB évaluée par l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) de lysats cellulaires
   1. Pour mesurer l’activité de l’ALP le 7e jour après l’addition de MM, aspirer le milieu de culture des puits et laver ensuite avec 1 mL de PBS stérile 1 x (37 ° C). Aspirez soigneusement le PBS pour permettre les cellules attachées à rester sur le plastique de culture de tissus ou de biomatériau et figer les plaques à-80 ° C.
   2. Après 24 h (ou jusqu'à 2 semaines), décongeler le contrôle vitroplants plaque et la plaque de culture de suspension de biomatériau à température ambiante (RT) de préparer pour la lyse OB. Pour les échantillons de biomatériau, transférer les disques de β-TCP dans une plaque de culture nouvelle suspension pour exclure les cellules fixés à la plaque. Ajouter 75 µL / puits de la 1 x tampon de lyse cellulaire pour les deux plaques. Agiter les plaques pendant 5 min sur un agitateur à 400 secousses/min.
   3. Transvaser le lysat cellulaire dans un tube à microcentrifugation 0,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 6 min à ta pour enlever les débris. Ajouter 50 µL de surnageant lysat cellulaire échantillon sur une plaque de 96 puits noire et puis ajouter 50 µL d’une solution composée de 200 µM 6,8-difluoro-4-méthylumbelliféryl phosphate (DiFMUP) un substrat fluorogène dissous dans 2 x ALP solution tampon (pH 10 / puits). Mis en place deux puits vides avec 100 µL d’une solution de 1:1, contenant 1 x buffer de lyse cellulaire et 2 x ALP.
   4. Préparer 8 étalons de référence avec 100 μL/puits avec le 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) variant de 0,5 à 200 μM dissous dans une solution contenant 1 x cellule lysis buffer et 2 x ALP pour générer une courbe de référence standard 1:1.
   5. Incuber les plaques noires à 37 ° C pendant 15 min et puis lire la fluorescence avec l’excitation à 358 nm et d’émission à 455 nm. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.
   6. Normaliser l’activité enzymatique ALP des lysats cellulaires à la quantité totale de protéine à un dosage colorimétrique pour la concentration en protéine. Préparer l’albumine sérique bovine étalons de référence de protéine (BSA) à une plage allant de 0,05 à 2,5 µg/µL dissous dans 1 x tampon de lyse cellulaire pour générer la courbe d’étalonnage.
   7. Préparer les lysats cellulaires échantillon et normes protéique BSA en doublons. Ajouter 5 µL de la cellule lysate ou 5 µL de protéine BSA standard dans une plaque à 96 puits, puis ajouter 25 µL de réactif A' et 200 µL de réactif B. Set up deux puits vides 5 µl de 1 x tampon de lyse cellulaire. Incuber les plaques à RT pendant 15 min et puis lire l’absorbance à 690 nm. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.
5. Différenciation d’OB évaluée par coloration ALP en culture cellulaire
   1. Tacher ALP en OBs cultivées sur jour 7 après l’addition de MM sur une plaque de culture de tissus de contrôle et le biomatériau dans une plaque de culture de suspension.
   2. Aspirer le milieu de culture des puits et remplacez-le avec 0,5 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspirer le PBS et fixer les cellules en les incubant dans 0,5 mL de formol 10 % tamponnée à ta pendant 1 min.
   3. Aspirer le formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et ajouter 0,5 mL de tampon de lavage (0,05 % Tween20 dans du PBS 1 x).
   4. Dissoudre un comprimé de substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitrobleu tétrazolium (BCIP/NBT) dans 10 mL d’eau ultrapure et vortex jusqu'à dissolution complète. La solution doit être protégée de la lumière et utilisée moins de 2 h.
   5. Aspirer le tampon de lavage et remplacez avec 0,5 mL de solution de substrat BCIP/NBT et incuber la plaque à la RT dans l’obscurité pendant 10 min. aspirer la solution colorante et par 0,5 mL de tampon de lavage.
   6. Transférer les disques colorés β-TCP dans un nouveau puits et numériser les plaques ALP tachée avec un scanner à plat conventionnel à la souillure d’ALP record.
6. Minéralisation OB évaluée par coloration avec l’alizarine rouge S (ARS)
   1. Aspirer le milieu de culture par les puits contenant primaire OBs 14 jours après l’addition de MM et rincer deux fois avec 0,5 mL de PBS 1 x à RT. aspirer le PBS et fixer les cellules en ajoutant 0,5 mL de la 10 % tamponnée solution de formol à RT pendant 10 min.
   2. Aspirer le formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et laver deux fois avec 0,5 mL de l’eau ultrapure.
   3. L’OBs fixes, ajouter 0,25 mL de solution de coloration de ARS de 40 mM (pH 4,2) dissous dans l’eau ultrapure et incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 secousses/min.
   4. Aspirer la solution colorante avec une pipette à usage unique et rincer avec 1 mL d’eau ultrapure. Répéter cette étape 5 à 10 fois pour supprimer non-spécifique de coloration.
      Remarque : La solution de lavage doit être sans couleur.
   5. Aspirer l’eau ultrapure et ajouter 1 mL de PBS froid. Incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 secousses/min.
   6. Aspirer le PBS, transférer les disques colorés β-TCP dans un nouveau puits et analyser les plaques avec un scanner à plat à la minéralisation record.
   7. Ajouter 0,25 mL de solution de chlorure de cétylpyridinium 10 % et incuber la plaque à RT pendant 15 minutes sur un agitateur à 100 secousses/min pour extraire le colorant à ARS.
   8. Transférer les surnageants dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 17 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
   9. Ajouter la solution de chlorure de cétylpyridinium 10 % aux extraits avec un taux de dilution de 01:10:01 : 20 et ajouter les échantillons (300 µL) dans une plaque à 96 puits dont deux puits vides contenant du chlorure de cétylpyridinium 10 % seulement.
   10. Préparer des étalons de référence ARS 7 allant de 4 à 400 µM en diluant l’ARS 40 mM coloration solution (pH 4,2) avec la solution de chlorure de cétylpyridinium de 10 % pour générer la courbe d’étalonnage.
   11. Ajouter 300 µL de l’étalon de référence des doublons à la plaque à 96 puits.
   12. Lire l’absorbance des échantillons, flans et faire référence à des normes à 520 nm.
   13. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.

2. souris OB-OC co-culture de dériver OCs Mature

1. Préparation et stérilisation des tranches de l’os cortical bovine
   1. Segments d’os de tissu environnant de nettoyer et enlever l’OS trabéculaire et la moelle osseuse.
   2. Sécher l’os à 50 ° C pendant 24 h.
   3. Couper l’OS en plus petits morceaux et couper en tranches (environ 300 – 350 µm d’épaisseur) à l’aide d’une faible vitesse scie avec une lame de diamant.
   4. Couper les tranches de 300 – 350 µm en disques quadratiques (1 cm²).
   5. Pour nettoyer les disques d’OS (1 cm²), les mettre dans un flacon en verre fermant à clé et remplir avec de l’eau distillée. Transférer le flacon en verre rempli dans un bain à ultrasons et laisser agir pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
   6. Videz l’eau distillée, ajouter de l’éthanol à 70 % et laisser agir pendant 5 min.
   7. Décanter l’éthanol à 70 % et les remplacer par l’éthanol à 100 %.
      NOTE : Stocker les tranches d’os dans l’éthanol à 100 % à 4 ° C pendant 4 semaines.
   8. Irradier les tranches de l’OS avec la lumière UV pour 15 min de chaque côté dans des conditions stériles. Conserver les tranches OS stérilisé dans une plaque de culture stériles à ta jusqu'à l’utilisation ultérieure.
2. Isolement des précurseurs de la moelle osseuse OC
   1. Euthanasier utilisant une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg de souris BALB/c de 8 à 12 semaine vieux naïves.
   2. Isoler les précurseurs chimiques OC la moelle osseuse et souris fémur et le tibia.
   3. Retirez les jambes avec des ciseaux stériles du point plus proche à l’organe à l’articulation de la hanche, couper les branches au niveau des genoux et les chevilles et enlever les tissus mous avec bistouri stérile et forceps. Couper les épiphyses. Débusquer et suspendre la moelle avec 1mL de BGM dans un 6 cm boîte de Petri stérile en utilisant une aiguille de 27G, attachée à une seringue de 1mL pour obtenir une suspension de cellules.
   4. Ajouter la suspension de cellules dans un tube conique de 50 mL, laver les 6 cm boîte de Pétri avec 5 mL de BGM et transférer dans le même tube conique de 50 mL. Centrifuger à 350 x g à 4 ° C pendant 5 min. remettre en suspension les cellules dans un milieu de différenciation OC (DM) contenant BGM, 1 nM 1,25-(OH)₂-vitamine D3 et 1 µM prostaglandine E₂ (1 mL/puits).
      Remarque : Une souris BALB/c fournit un nombre suffisant de précurseurs de l’OC pour une plaque de culture de 24 puits.
3. Préparation de co-culture souris OB-OC avec le biomatériau
   1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre 14 mm ou OS bovin tranches (1 cm²) dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 24 h avant d’ajouter les cellules.
      NOTE : Tranches d’os bovin sont un groupe de contrôle de substrat physiologique pour l’étude de la différenciation OC en présence de biomatériaux.
   2. Ajouter 8,8 x 10⁴ cellules/cm² de l’OBs primaires suspendue de BGM sur les biomatériaux ou l’os de contrôle dans une plaque de culture de suspension 24 puits ou sur une plaque de culture de tissus de 24 puits. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
      NOTE : OBs fixer le plastique ou l’OS biomatériau ou bovin.
   3. Ajouter fraîchement isolées précurseurs OC la moelle osseuse pour les 24 h de culture primaire OBs et culture à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 5 jours. Remplacez le support par fraîchement préparée OC DM tous les deux jours. Puis, détachant OCs pour les phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP) pour évaluer la différenciation OC.
4. Évalué par coloration au piège de la différenciation OC
   1. Afin de caractériser les matures OCs multinucléées, obtenu à l’étape 2.3.3, aspirer le milieu de culture de la plaque de culture de tissus de contrôle et de la plaque de culture de suspension biomatériau et ajouter 1 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspirer le PBS et fixer les cellules en incubant eux dans 1 mL de solution de formol 10 % mis en mémoire tamponné à la droite pendant 10 min.
   2. Aspirer la solution de formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et ajouter 1 mL de PBS 1 x à RT. répéter cette étape trois fois, puis aspirer le PBS, remplacez par 1 mL de tampon de piège (pH 5) et incuber les plaques à 37 ° C pendant 30 min.
   3. Aspirer le tampon de piège et ajouter 1 mL d’éthanol à l’acétone et 100 % 1:1. Incuber la plaque à RT 30 art. rapidement aspirer l’éthanol-acétone solution avec une pipette à usage unique et sécher complètement les plaques à température ambiante.
   4. Pour le piège solution de coloration, préparer un 10 mg/mL solution phosphate de naphtol-AS-MX en dissolution de N, N-diméthylformamide, 0,6 mg/mL de violet rapide rouge sel dans le tampon de piège et ajouter 0,1 mL de solution mère naphtol-AS-MX phosphate à 10 mL de sel violet rapide rouge dans le tampon de piège.
   5. Ajouter 1 mL de piège solution de coloration et incuber les plaques à 37 ° C pendant 10 min, puis aspirer le piège solution de coloration et ajouter 1 mL d’eau ultrapure pour arrêter la réaction.
   6. Transférer les disques de la β-TCP et les tranches de l’OS bovin après coloration dans un nouveau puits, observer rouge OCs teinté à l’aide d’un microscope optique (grossissement : 10 X) et énumérer les TRAP + OCs mature avec trois ou plusieurs noyaux.

3. critique taille souris défaut substance modèle

1. Injecter la buprénorphine 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée (s.c.) à des souris BALB/c 8 - semaine vieux pour l’analgésie.
2. Anesthésier les souris avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg, ajouter un gel ou une pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
3. Raser la fourrure sur le dessus de la tête entre les oreilles et nettoyer la surface avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
4. Faire une incision sagittale médiane sur le dessus du crâne entre les oreilles avec un scalpel stérile pour exposer la voûte crânienne et de retirer les tissus conjonctifs pericranium au-dessus de l’os pariétal droit en grattant avec un scalpel.
5. Créer un défaut de taille critique dans l’os pariétal droit à l’aide d’un trépan dentaire stérile avec un diamètre de 4 mm (2000 tr/min) sous irrigation constante avec une solution saline normale à encoche dans l’os pariétal droit et couper à travers l’ectocortex et quelques endocortex.
6. Pour éviter d’endommager la dure-mère, utilisez un petit ascenseur périostique pour percer l’endocortex restant, soigneusement soulevez la substance osseuse et enlevez-le avec une pince. Le vice qui en résulte doit être circulaire et environ 3,5 mm de diamètre.
7. Remplir le défaut substance préalablement trempées (PBS stérile 1 x à ta) β-TCP/C mousse à l’aide de pinces.
8. Préparer le nombre approprié de sham, appariés selon l’âge des témoins négatifs avec un défaut vide.
9. Pour garder ce biomatériau en place, mettre 0,5 µL d’adhésif de tissu au bord du défaut à deux points opposés.
10. Fermer la peau avec une suture non résorbable.
11. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
12. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
13. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. pour traitement analgésique postopératoire deux fois par jour pendant 72 h. retour complètement rétablis souris à leur cage.
14. Pour déterminer l’efficacité de ce biomatériau, euthanasier les i.p. de souris avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
15. À post-implantatoire 8 à 12 semaines, décapiter la souris euthanasiée avec des ciseaux pointus.
16. Fixer la tête décapitée de la souris dans 30 mL de 4,5 % tamponnée solution de formol pendant 1-2 semaines garantir la pleine pénétration du fixateur dans le tissu.
17. Transférer les chefs dans l’éthanol à 70 % pour le stockage à long terme à 4 ° C pendant un an.
18. Utilisation micro calculé tomographie (microCT) ou des techniques histologiques enrobement normalisées pour évaluer la régénération osseuse. Il est possible d’utiliser plus d’analyse sur des échantillons post mortem à haute résolution (90 kV, 4 min) en 2D et 3D sagittal et frontal avions.
19. Pour histologie enrobement, déshydrater les têtes en croissant des grades d’éthanol et incorporer en glycol méthyl méthacrylate.
20. Couper des blocs de méthacrylate de méthyle-encastrés de glycol avec une scie à diamant et broyer les sections d’une épaisseur d’environ 80 à 100 µm.
21. Évaluer le goff Laczko OS coupes coloré afin d’identifier de nouveaux OS formation¹⁴.

4. in Vitro les réponses immunitaires

1. Euthanasier i.p. de souris BALB/c 8 - semaine vieux de naïf avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
2. Placez la souris sur son côté droit, se raser la fourrure sur le côté gauche et nettoyer la peau sur le côté gauche de l’abdomen avec l’éthanol à 70 %.
3. Faire un 10 mm de long et une incision profonde de 1 mm dans la peau de la souris sur le côté gauche vers l’arrière suivant les côtes sur l’estomac à l’aide de ciseaux stériles.
4. Ouvrir la peau et puis exposer le péritoine. Faire un 10 mm de longueur et moins de 1 mm de profondeur incision dans le péritoine, à l’aide de ciseaux dans des conditions stériles.
5. Poussez l’estomac proximal pour exposer la rate.
6. Tenez la rate doucement avec une pince stérile et retirez-le en coupant le tissu et les vaisseaux attachés en dessous.
7. Placez la rate intacte dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de froid 1 x PBS stérile.
8. Préparer une suspension monocellulaire de hacher la rate à l’aide d’une pince stérile 2 ou 2 lames de verre stérile.
9. Enlevez les débris en le faisant passer à travers un tamis de cellule de 40 µm stérile avec du PBS 1 x contre le rhume en utilisant le piston d’une seringue de 1 mL.
10. Centrifuger la suspension monocellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C dans un tube conique de 50 mL, aspirer et éliminer le surnageant. Puis Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR).
11. Incuber la suspension cellulaire pendant 14 min à RT et arrêter la réaction en ajoutant 45 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
12. Centrifuger les cellules après la lyse cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite jeter le surnageant.
13. Splénocytes de remettre dans un milieu RPMI contenant 10 % inactivés par la chaleur FBS, solution de pénicilline-streptomycine 1 %, 0,1 % de gentamicine, 0,2 % de β-mercaptoéthanol et 1 % des acides aminés non essentiels.
14. Les incuber β-TCP/C mousse dans une plaque de 96 puits stériles culture contenant du milieu RPMI pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO₂ avant l’ensemencement de la cellule.
15. Ajouter des splénocytes à titré nombres, par exemple., 1,25 x 10⁵, 2,5 x 10⁵ et 5 x 10⁵/well à Herbert George wells dans une plaque à 96 puits vitroplants contenant du milieu RPMI et additifs, avec ou sans la mousse de β-TCP/C pré-incubées.
16. Ajouter 10 µg/mL la concanavaline A (Con A) dissous dans le milieu pour un total de 100 µL/puits dans les puits appropriés et puis incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 72 h.
17. Mesurer la prolifération cellulaire avec un dosage bromodéoxyuridine (BrdU). Ajouter 10 µL/puits de la solution de marquage BrdU après 48 h de culture cellulaire et puis incuber la plaque pendant 24 h supplémentaires.
18. Après 72 h, récupérer le surnageant et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
19. Ajouter 200 µL/puits de la solution de fixation à chaque puits et puis incuber 30 min à RT. aspirer la solution de fixation. Ajouter 100 µL/puits de la solution d’anticorps anti-BrdU et incuber pendant 90 min.
20. Aspirer la solution d’anticorps, rincez les puits trois fois avec 200 à 300 µL/puits de la solution de lavage et enlever la solution de lavage.
21. Ajouter 100 µL de solution de substrat et incuber pendant 3 à 10 min à la droite, puis mesurer l’absorbance à 450 nm.
22. Mesurer l’interleukin-1β (IL-1β), interleukine 2 (il-2), interleukine-4 (IL-4) et l’interféron-γ (IFN-γ) dans les surnageants recueillis à l’aide d’un technique ELISA.

5. haut débit modèle intrapéritonéale

1. Offrir une 6-8 semaines vieilles souris femelles BALB/c avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg et ajouter un gel ou une pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
2. Raser la fourrure abdominale et nettoyer avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
3. Faites une incision médiane longue de 8 mm à travers la peau le long de la linea alba. Faire une petite incision dans le péritoine, à l’aide d’un scalpel.
4. Place PBS stérile imbibé de greffes de β-TCP/C mousse (2 x 2 x 2 mm³) dans la cavité péritonéale ou sans addition de matériaux pour les souris témoins appariés selon l’âge des trompe-l'œil.
5. Suture du péritoine et la peau avec des sutures résorbables et non résorbables, respectivement.
6. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
7. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
8. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Retour souris pleinement récupérés de leurs cages.
   Remarque : Cette procédure induit une douleur minime. Traitement analgésique postopératoire n’est habituellement pas nécessaire. Si la commande animaux montrent des signes de douleur, injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. ou un autre appropriée des médicaments analgésiques pour soulager la douleur.
9. Euthanasier la souris 7 jours après l’implantation, avec une solution de 200 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 24 mg/kg
10. À post-implantatoire 7 jours, lavage de la cavité péritonéale à l’aide de 1 mL d’une seringue avec une aiguille 25 G pour un total de 3 mL de PBS froid en maintenant la tête de la souris enfoncé et en insérant l’aiguille dans le quadrant abdominal inférieur gauche et viser dans la partie proximale.
    Remarque : Le liquide péritonéal devrait être libre de globules rouges.
11. Centrifuger le liquide de lavage péritonéal à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C et recueillir le liquide péritonéal à conserver à-20 ° C pour les mesures de ELISA de cytokines IL-1β, il-2 et IL-4.
12. Aspirer le surnageant, resuspendre le culot dans 1 mL de PBS et compter les cellules péritonéales utilisant le bleu trypan sur un hémocytomètre.
13. Cytocentrifuge la suspension cellulaire à 5 x 10⁵ cellules sur des lames de verre, laisser les lames à sec et des taches pour un nombre d’éléments différentiels.
14. À l’aide d’un microscope optique, compter un minimum de 300 cellules au total et différencier les macrophages, les éosinophiles, neutrophiles et lymphocytes.

6. toxicité subchronique modèle sous-cutanée

1. Anesthésier la souris BALB/c femelle 6 – 8 semaines vieux avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg, ajouter le gel ou pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
2. Placez la souris sur le dos, se raser la fourrure abdominale et nettoyer la surface rasée avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
3. Faites une incision médiane longue de 8 mm à travers la peau le long de la linea alba de l’abdomen à l’aide d’un bistouri, puis implant PBS imbibés biomatériau (2 x 2 x 2 mm³) sous la peau ou n’ajouter aucuns matériel pour les souris témoins appariés selon l’âge des trompe-l'œil.
4. Suture de la peau avec une suture non résorbable.
5. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
6. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
7. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Retour souris pleinement récupérés de leurs cages.
   Remarque : Cette procédure induit une douleur minime. Traitement analgésique postopératoire n’est habituellement pas nécessaire. Si la commande animaux montrent des signes de douleur, injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. ou un autre analgésique approprié.
8. Lorsqu’il est prêt à examiner le site d’implantation, euthanasier les i.p. de souris avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
9. Après l’implantation huit semaines, le site d’implantation avec les tissus (1 cm²) environnants de l’accise.
10. Difficulté le tissu dans une solution de formol 4,5 % mis en mémoire tamponné pendant la nuit, incorporer à la paraffine et coupé en 4 sections de µm.
11. Tache 4 sections de tissus inclus en paraffine µm à l’hématoxyline et éosine (H & E) pour l’inflammation ou de Masson trichrome de la fibrose et le dépôt de collagène.

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Résultats

Pour évaluer le β-TCP pour son efficacité comme un biomatériau pour la réparation osseuse, nous avons utilisé in vitro et in vivo méthodes de dépistage. Tout d’abord, nous avons mesuré les réponses OB sur les disques de β-TCP comparées aux témoins seul moyen de base. La figure 2 montre la viabilité de l’OB en réponse à des disques de β-TCP à 7 et 14 jours de culture. La viabilité cellulaire mesurée à partir des cellu...

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Discussion

Ici, nous montrons une approche multidisciplinaire pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des biomatériaux représentatif mis au point pour la réparation et la régénération osseuse. Nous avons testé les réponses de l’OBs, OCs, et la réponse de guérison in vivo dans un défaut critique OS modèle de souris ainsi que in vitro et in vivo des réponses immunitaires. L’étude visait à démontrer comment les tests fonctionnent et résument les données et les conclusi...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm)			Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam)	Orthovita	2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4			Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate	Thermo Scientific	C7027	Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water.
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138
DC protein assay kit II	Bio Rad	5000112	DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A.
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Steril-filter DMSO before usage.
Dispase II (neutral protease, grade II)	Roche	4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	E12020	EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU).
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
MEM alpha medium (α-MEM)	Gibco Life Technologies	11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Sigmafast BCIP/NBT	Sigma-Aldrich	B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15400054	Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS.
Tween20	Sigma-Aldrich	P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free	VWR	L0970-500
Wash buffer			Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G5422
24-well suspension culture plate	Greiner bio-one	662102
24-well tissue culture plate	Greiner bio-one	662160
50 mL conical tube	Greiner bio-one	227261
96-well black plate	Greiner bio-one	655076
96-well transparent plate	Greiner bio-one	655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R	VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240	Thermo Scientific
Cryovial 2 mL	Greiner bio-one	122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S	GE Healthcare Life Sciences Whatman	10462200	For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Infinite M200 Pro microplate reader	Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL	VWR	20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL	VWR	21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)	Edmund Buehler
Shaking incubator GFL3032	GFL	3032
Single-use pipet: serum pipet	Greiner bio-one	612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm)	Greiner bio-one	664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3	Sigma-Aldrich	17936	1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone	VWR Chemicals	22065.327
Bone growth medium (BGM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water	Carl Roth	3478.4
Ethanol (100% vol/vol)	VWR Chemicals	20821.365
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Fast red violet LB salt	Sigma-Aldrich	F3381
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM)	Gibco Life Technologies	11900-073
N,N-Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	D4551
Naphthol AS-MX phosphate	Sigma-Aldrich	N4875
Osteoclast differentiation medium (DM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Prostaglandin E2 (PGE2)	Cayman Chemical Company	9003016	1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate	Sigma-Aldrich	S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0			Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free	VWR	L0970-500
24-well suspension culture plate	Greiner bio-one	662102
24-well tissue culture plate	Greiner bio-one	662160
50 mL conical tube	Greiner bio-one	227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R	VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240	Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm)	Buehler
Isomet low-speed saw	Buehler
Petri dish (6 cm)	Greiner bio-one	628,161
Screw cap glass bottle 20 mL	Carl Roth	EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Single-use pipet: serum pipet	Greiner bio-one	612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4''	Henry Schein Animal Health	9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g	Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution)	Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin	Carl Roth	2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL	B. Braun Surgical	1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown	Henry Schein Animal Health	1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''	Henry Schein Animal Health	9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Heating plate: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Sterile gauze swabs	Henry Schein Animal Health	220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20)	Henry Schein Animal Health	9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923	W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH	16929000
Handpiece type S-II	W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH	30056000
Trephine, diameter 4 mm	Hager&Meisinger GmbH	229040
Irrigation tubing set 2.2 m	W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH	4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm	Henry Schein Animal Health	472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm	Henry Schein Animal Health	300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit	Sigma-Aldrich	11647229001	The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution.
Concanavalin A (ConA)	MP Biomedicals	150710
Culture medium splenocytes			RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10500064
Gentamicin	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard	BioLegend	431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard	BioLegend	431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard	BioLegend	430801
Non-essential amino acids solution	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050
Penicillin-streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse	BD Bioscience	555899
RPMI 1640 medium, HEPES	Gibco, Thermo Fisher Scientific	52400025
β-Mercaptoethanol	Gibco, Thermo Fisher Scientific	31350010
50 mL conical tube	Greiner bio-one	227261
96-well tissue culture plate	Greiner bio-one	655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R	VWR
Cell strainer 40 µm	BD Bioscience	352340
Infinite M200 Pro microplate reader	Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g	Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard	BioLegend	431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard	BioLegend	431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit	Thermo Scientific	9990700	For differential cell count.
Heating plate: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber	Carl Roth	PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0	Ethicon	6683H
Resorbable suture: Polysorb	Covidien	SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin	Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Sterile gauze swabs	Henry Schein Animal Health	220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G	Henry Schein Animal Health	9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4%	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g	Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin	Carl Roth	2213.6
Heating plate: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0	Ethicon	6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown	Henry Schein Animal Health	1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Sterile gauze swabs	Henry Schein Animal Health	220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''	Henry Schein Animal Health	9003340, 420939