JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Количество новых биоматериалов, разработанные для ремонта больших костных поражений постоянно расширяется с целью укрепить кости Исцеление и преодолеть осложнения, связанные с костной трансплантации. Здесь мы представляем многоплановой стратегии для доклинических биосовместимость испытаний биоматериалов для ремонта костей.

Аннотация

Большие номера союз переломов являются серьезной проблемой в ортопедической хирургии. Хотя авто - и аллогенной костных имплантатов для лечения таких поражений, существуют потенциальные осложнения с их использованием. Таким образом материальный ученые разрабатывают синтетические, биосовместимых биоматериалов для преодоления этих проблем. В этом исследовании мы представляем междисциплинарных платформу для оценки биоматериалов для ремонта костей. Мы объединили опыт от кости биологии и иммунологии разработать платформу, включая в vitro остеокластов (OC) и анализов остеобластов (OB) и в естественных условиях модели мыши кости ремонт, иммуногенность и аллергенность. Мы демонстрируем как выполнять эксперименты, обобщить результаты и доклад о биоматериала биосовместимостью. В частности мы протестировали OB жизнеспособность, дифференциации и минерализации и жизнеспособности OC и дифференциации в контексте β-трикальцийфосфат фосфат (β-TCP) дисков. Мы также протестировали пены (β-TCP/C) β-TCP/коллагена, который является клинически используется для ремонта костей в подвздошную кость критического размера дефекта мыши модели для определения воздействия на ранней стадии заживления кости коммерчески доступных материалов. В параллельных экспериментов мы оценивали иммунной и аллергических реакций у мышей. Наш подход создает профиль биологической совместимости биоматериала кости с целого ряда параметров, необходимых для прогнозирования биосовместимость биоматериалов, используется для заживления кости и ремонта в больных.

Введение

Ремонт кости — это сложный процесс, который начинается с формирования гематома, воспаление, мозоль формирования и затем ремоделирования1,2. Однако костной регенерации потенциал ограничен размером1,перелом кости3. Например большие переломов, вызванных травмой, рака или остеопороза не может исцелить и называются несрастание переломов. Эти поражения кости часто требуют лечения для поощрения здорового физиологических кости ремонт и регенерации. В настоящее время аутотрансплантатом и аллотрансплантата костной трансплантации является подход4 выбор процедур замены кости 2,2 миллиона ежегодно5. Хотя эти процедуры имеют высокий показатель успеха, могут быть осложнения, например, ограниченное наличие костей, инфекции, доноров сайт заболеваемости и неприятие4. Для решения этих проблем в настоящее время изыскиваются новые альтернативы для тканевой инженерии костей.

Дизайн биоматериалов, основанный на натуральных или синтетических полимеров, биокерамики или металлов в сочетании с клетки и биоактивных молекул находится на подъеме6. Нашего нынешнего понимания физиологических кости Исцеление и исцеление в контексте биоматериалов, зависит от нескольких факторов, таких как механические свойства и несколько местных и системных факторов, включая клетки от циркуляции и перелом7 ,8,9. Биоматериалов для регенерации кости направлены на продвижение osteogenicity и остеоинтеграции10 и удобно биосовместимых, биологически и пористые (содействие миграции клеток, кислорода и питательных веществ). Они также должны быть достаточно сильным, чтобы поддержать перелом сайт для облегчения боли. Кроме того необходимо инициировать процесс заживления факторов воспаления. Однако если биоматериала индуцирует чрезмерного воспаления и аллергических реакций, это может ограничивать или препятствовать кости Исцеление11,12. Таким образом междисциплинарный подход необходим для оценки биоматериалов, разработанные для ремонта костей.

В этом исследовании мы представляем доклинические оценки представительной материалов, 1) Orthovita Vitoss, пены, который замена трансплантата коммерчески доступных губчатой кости, состоящий из Трикальцийфосфат, состоящий из нанометрового размера чистого β-трикальцийфосфат частицами фосфата (β-TCP) и бычий коллаген типа 1 (C) (β-TCP/C пены) и 2) β-TCP диски. Здесь, мы показываем, тестирование биосовместимости эти биоматериалов, используя первичный остеобластов (OB) и assays остеокластов (OC), модель в vivo кости ремонта, иммунологические оценки входящих в vitro распространения Т-лимфоцитов и производство цитокинов и в естественных условиях иммуногенность и аллергенность, как сообщалось ранее,13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Процедуры были сделаны с мышей BALB/c после всех руководящих принципов для ухода и использования лабораторных животных австрийского министерства образования, науки и исследований и были одобрены Комитетом по этике австрийского министерства образования, науки и научных исследований.

1. Первичная мыши OB культура

  1. OB изоляции от новорожденных мыши Кальвария с помощью ферментативного пищеварения
    1. Усыпить 1 – 2 дня старый новорожденных щенков (60 в общей сложности), обезглавливание и место главы в чашке Петри стерильные 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
    2. Держите голову затылка и вырезать кожу с помощью стерильными ножницами. Надрезать calvarium, пирсинг он (около 0,1 – 0,3 мм) с ножницами, которые затем вставляется под calvarium затылок на базе черепа и разрезать вдоль края подвздошную сбоку от задней фронт выше уши, а затем Абова e переносица (рис. 1).
    3. Инкубировать расчлененных Кальвария с 8 мл раствора пищеварение фильтров стерилизованные (300 единиц/мл коллагеназы типа IV и 2,14 единиц/мл dispase II растворенные в α-минимум необходимых среде (α-MEM)) в 50 мл Конические трубки при 37 ° C 10 мин в тряску инкубатор на 200 коктейлей / мин.
    4. Отменить первый супернатант и повторить процедуру три раза с 8 мл раствора пищеварение пищеварение. Собирать супернатанта, содержащие клетки после каждого шага пищеварение и добавить его в 50 мл Конические трубки. Храните 50 мл Конические трубки с клетками в ледяной воде ванны до завершения процедуры пищеварение (примерно 40 мин).
    5. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант (с пипетка Пастера, придает вакуумного насоса) и Ресуспензируйте в 40 мл костный рост средних (BGM) содержащий α-MEM с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицином решение. Затем добавьте 10 мл суспензии клеток 4 культуры ткани пластины (10 см).
    6. Культура клетки при 37 ° C и 5% CO2 до слияния (2-3 дней).
    7. В месте слияния аспирационная старый среднего и мыть культуры ткани пластины с ПБС (37 ° C). Затем аспирационная PBS и добавить 2 мл раствора 1 x трипсина, содержащий 0,5% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для каждой пластины культуры ткани 10 см.
    8. Инкубировать 4 культуры пластин при 37 ° C и 5% CO2 на 5 мин и затем проверьте пластины с инвертированным микроскопом света для обеспечения что клетки отсоединяются от пластика. Затем перенесите всех клеточных суспензий (всего 8 мл) коническая Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл свежего BGM. Мыть каждый пластины с 5 мл свежего BGM и передачи же конической Тюбик 50 мл.
    9. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 16 мл свежего BGM. Подготовьте 16 новых 10 см культуры ткани пластины (разделение 1:4) содержащих 9 мл BGM. Добавьте 1 мл суспензии клеток в каждой плиты.
    10. Повторите шаги 1.1.6. до 1.1.8.
    11. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте в 10 мл свежего BGM. Подсчитать количество ячеек и рассчитать концентрации клеток.
      Примечание: Данная процедура создает примерно 7,5 – 8,3 x 105 клеток/щенка.
    12. Центрифуга на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте замораживания среднего содержащий 10% диметилсульфоксида (ДМСО), α-MEM 40% и 50% FBS. 1,5 мл суспензии клеток передавать криопробирки 2 мл для в общей сложности 2 х 106 клеток на флаконе.
    13. Вспышки заморозить флаконов в жидком азоте для длительного хранения в жидком азоте танк. Используйте клетки в течение одного года для обеспечения полной функциональности. Используйте эти первичной OBs для оценки распространения (шаг 1.2), дифференциация (ALP анализов: шаг 1.4., 1.5.) и минерализации (шаг 1.6.) при наличии биоматериалов. Используйте эти клетки для созревания костей-костного мозга производные OC прекурсоров в сотрудничестве культуры (шаг 2.3).
  2. OB распространения пробирного
    1. Предварительно инкубировать дисков β-TCP диаметром 14 мм в 1 мл BGM в 24-ну подвеска культуры пластины при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа перед добавлением первичной OBs. использования стандартных культуры ткани пластины для элементов управления и подвеска культуры пластин для образцов биоматериала Избегайте клеток привязанность к пластик.
    2. Аспирационная средой предварительной инкубации и затем Ресуспензируйте мыши OBs в BGM. Добавление 4.4 x 104 OBs/см2 на диски предварительно инкубирован β-TCP в пластине 24-ну подвеска культуры и для контрольной группы, в культуре ткани 24-ну плиту (1 мл/хорошо). Набл будет прикрепить пластину культуры ткани или биоматериал.
    3. Инкубируйте 14 дней при 37 ° C и 5% CO2. Инкубационный период изменить носитель каждые 2-3 дня и добавьте 1 mL свежих BGM для каждой скважины.
    4. Для оценки распространения Обь, передать β-TCP диски на 7 и 14 дней в новых скважин для исключения сигналы из клетки, выращенных на пластину подвеска культуры.
    5. Аспирационная старый среднего, добавить 0,5 мл BGM (37 ° C) и инкубировать культуры пластин для 30 минут при 37 ° C и 5% CO2. Затем 55 мкл 10 x реагент распространения клеток (1:10 разрежения) непосредственно в культуру хорошо. Для заготовки Подготовьте три скважины, содержащий 0,5 мл BGM и 55 мкл Реагента распространения клеток 10 x. Инкубируйте все пластины для 30 минут при 37 ° C и 5% CO2.
    6. Снять и передаче 150 мкл супернатант от каждой скважины в черный 96-луночных плиту и читать флуоресценции с возбуждением на 560 Нм и выбросов на 590 нм. Вычтите пустой чтений из образца чтений.
  3. Дифференциация и минерализации анализов Обь
    1. Предварительно инкубировать дисков β-TCP диаметром 14 мм в 1 мл BGM в 24-ну подвеска культуры пластины при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа перед добавлением OBs. использования стандартных культуры ткани пластины для элементов управления и подвеска культуры пластин для образцов биоматериала избежать клетки привязанность к пластик.
    2. Аспирационная средой предварительной инкубации и затем Ресуспензируйте мыши OBs в BGM. Добавление 8.8 x 104 OBs/см2 на диски предварительно инкубирован β-TCP в пластине 24-ну подвеска культуры и для контрольной группы, в культуре ткани 24-ну плиту (1 мл/хорошо). Набл будет прикрепить пластину культуры ткани или образцов биоматериала.
    3. Замените BGM Остеогенные минерализации среды (мм) 1 мл раствора, содержащего BGM, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 5 мм β-Глицерофосфат 24 h после добавления OBs и инкубировать в течение 14 дней при 37 ° C и 5% CO2. Измените носитель каждые 2-3 дня с 1 мл раствора свежеприготовленные мм для каждой скважины.
  4. OB дифференциация оценивается активность щелочной фосфатазы (ALP) от lysates клетки
    1. Для измерения активности ALP на 7 день после добавления мм, аспирационная питательной среды из скважин, а затем вымыть с 1 мл стерильного ПБС (37 ° C). Тщательно аспирационная PBS Разрешить вложенные клетки остаются на культуре ткани пластика или биоматериала и заморозить пластины-80 ° c.
    2. После 24 часов (или до 2 недель), оттепель управления культуры ткани и биоматериала подвеска культуры крышку при комнатной температуре (RT) подготовить для лизиса Обь. Для образцов биоматериала передачи дисков β-TCP в новой культуры плиту подвеска для исключения клетки, прикреплены к плите. Мкл 75 за хорошо 1 x буфер lysis клетки в обе пластины. Встряхните пластины для 5 мин на шейкер в 400 качает/мин.
    3. Перенесите lysate клетки в пробки microcentrifuge 0,5 мл и центрифуги на 300 x g 6 мин на RT для удаления мусора. 50 мкл супернатант lysate клетки образца к 96-луночных черная плита и затем добавьте 50 мкл раствора, состоящий из 200 мкм 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl фосфат (DiFMUP) fluorogenic субстрата растворяют в 2 x буфере (рН 10) ALP в колодец. Созданы две пустые скважины с 100 мкл раствора 1:1, содержащий буфер lysis клетки 1 x и 2 x ALP буфера.
    4. Подготовка 8 эталонных стандартов с 100 мкл/хорошо с 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) от 0,5 до 200 мкм, растворяют в растворе 1:1, содержащий буфер lysis клетки 1 x и 2 x ALP буфера для создания стандартной исходной кривой.
    5. Инкубировать черная плита при 37 ° C в течение 15 минут, а затем прочитать флуоресценции с возбуждением 358 Нм и выбросов на 455 Нм. Вычтите пустой чтений от эталонных стандартов и образец чтений.
    6. Нормализует активность фермента ALP от lysates клетки для общего количества белка, с использованием колориметрического анализа для концентрации протеина. Подготовить бычьим сывороточным альбумином (БСА) белка эталонных стандартов в диапазоне от 0,05 – 2,5 мкг/мкл, растворенного в 1 x буфер lysis клетки для создания стандартной кривой.
    7. Подготовка образца lysates клетки и BSA белка стандартов в дубликаты. Добавить 5 мкл lysate клетки образца или 5 мкл BSA белка стандарта в 96-луночных плиту и затем добавить 25 мкл Реагента A' и 200 мкл Реагента B. Set вверх два пустых скважин с 5 мкл 1 x буфер lysis клетки. Инкубировать пластины на RT на 15 мин, а затем прочитать поглощения в 690 нм. Вычтите пустой чтений от эталонных стандартов и образец чтений.
  5. OB дифференциация оценены путем пятнать ALP в клеточной культуре
    1. Пятно ALP в культивированный OBs на 7 день после добавления мм на тарелку тканевой культуры управления и биоматериал в пластине подвеска культуры.
    2. Аспирационная питательной среды из скважин и заменить его с 0,5 мл 1 x PBS (37 ° C). Аспирационная PBS и исправить клетки путем инкубации их в 0,5 мл формалина 10% буферизуются в РТ за 1 мин.
    3. Аспирационная формалина 10% буферизации с одноразовой пипетки и добавить 0,5 мл буфера мытья (0,05% Tween20 в однократном ПБС).
    4. Растворите одну таблетку 5-bromo-4-chloro-3-indolyl фосфат/нитро синий tetrazolium (ПКВП/НБТ) субстрата в 10 мл ультрачистая вода и вихревой до тех пор, пока полностью не растворится. Решение должен быть защищен от света и использовать в течение 2 ч.
    5. Аспирационная буфера мытья и заменить 0,5 мл раствора субстрата ПКВП/НБТ и инкубировать пластину на RT в темноте за 10 мин аспирата окрашивание раствора и заменить с 0,5 мл буфера мытья.
    6. Перенесите диски окрашенных β-TCP в новой скважины и сканировать ALP-окрашенные пластины с обычными планшетный сканер для записи ALP пятнать.
  6. OB минерализации оценены путем пятнать с S ализарин красный (ARS)
    1. Аспирационная питательной среды из скважин, содержащий основной набл 14 дней после добавления мм и дважды прополощите 0,5 мл 1 x PBS на RT. аспирата PBS и исправить ячейки, добавив, что 0,5 мл 10% буферизуются раствор формалина в РТ за 10 мин.
    2. Аспирационная формалина 10% буферизации с одноразовой пипетки и мыть дважды с 0,5 мл ультрачистая вода.
    3. Для фиксированной OBs добавьте 0,25 мл 40 мм ARS окрашивание раствора (рН 4,2) растворяют в ультрачистая вода и инкубировать пластину в РТ за 10 мин на шейкер в 100 качает/мин.
    4. Аспирационная окрашивание раствора с одноразовой пипетки и промыть с 1 мл раствора ультрачистая вода. Повторите этот шаг 5 – 10 раз для удаления неспецифических пятнать.
      Примечание: Промывной раствор должен быть без цвета.
    5. Аспирационная ультрачистая вода и добавьте 1 mL холодной PBS. Инкубируйте пластину в РТ за 10 мин на шейкер в 100 качает/мин.
    6. Аспирационная PBS, передачи дисков окрашенных β-TCP для новой скважины и сканировать таблички с планшетный сканер для записи минерализации.
    7. Добавьте 0,25 мл 10% раствора хлорида цетилпиридина и инкубировать пластину на RT 15 мин на шейкер в 100 качает/мин для извлечения ARS красителя.
    8. Передача supernatants 1,5 мл трубки и центрифуги на 17.000 x g 5 мин на RT.
    9. 10% раствор цетилпиридина хлорида экстрактов с коэффициентом разбавления 1:10-1:20 и добавить образцы (300 мкл) 96-луночных знаке, включая два пустых скважин, содержащие только 10%, цетилпиридина хлорид.
    10. Подготовка 7 ARS эталонных стандартов, от 4 до 400 мкм путем разбавления ARS 40 мм, окрашивание раствора (рН 4,2) с 10% раствором хлорида цетилпиридина для создания стандартной кривой.
    11. Добавьте 300 мкл эталона в дубликаты 96-луночных пластины.
    12. Читать поглощения образцы, бланки и ссылки на стандарты в 520 Нм.
    13. Вычтите пустой чтений от эталонных стандартов и образец чтений.

2. мыши Обь OC Сопредседатель культуры для получения Зрелые OCs

  1. Подготовка и стерилизации ломтики говядины кортикальной кости
    1. Очистить сегменты кости от окружающих тканей и удалить трабекулярной костной ткани и костного мозга.
    2. Сухие кости на 50 ° C в течение 24 ч.
    3. Кусочек кости на более мелкие куски и нарезать ломтиками (примерно 300 – 350 мкм толщиной) с помощью низкой скорости пила с алмазного диска.
    4. Нарежьте ломтиками 300 – 350 мкм квадратичной дисков (1 см2).
    5. Для очистки дисков кости (1 см2), положите их в запирающийся стекла флакона и заполнить с дистиллированной водой. Перевести заполненный стеклянный флакон в ультразвуковой ванне и sonicate за 5 минут Повторите три раза.
    6. Слить дистиллированной водой, добавить 70% этанол и sonicate за 5 мин.
    7. Слить 70% этанола и заменить 100% этанола.
      Примечание: Храните фрагменты костей в 100% этанола на 4 ° C на срок до 4 недель.
    8. Облучить фрагменты костей с ультрафиолетовым светом за 15 минут на каждой стороне в стерильных условиях. Храните фрагменты стерилизованные кости в стерильных культуры пластины на RT до дальнейшего использования.
  2. Изоляция костного OC прекурсоров
    1. Усыпить наивно 8 – 12 недельных BALB/c мышей с помощью инъекций внутрибрюшинного (и.п.) раствора кетамина и 24 мг/кг Ксилазина 200 мг/кг.
    2. Изолируйте прекурсоров OC костного мозга от мыши бедра и голени.
    3. Удалите ноги стерильными ножницами от ближайшей точки к телу в тазобедренном суставе, вырезать конечностей на коленного и голеностопного суставов и мягких тканей с стерильным скальпель и пинцет. Отрежьте эпифизов. Промыть и приостановить костного мозга с 1 мл BGM в 6 см стерильная Петри блюдо с помощью иглы 27G прилагается к 1 мл шприц для получения суспензии клеток.
    4. Добавьте 50 мл Конические трубки суспензии клеток, мыть 6см Петри с 5 мл BGM и передачи же конической Тюбик 50 мл. Центрифуга на 350 x g при 4 ° C за 5 мин Ресуспензируйте клетки в OC дифференциации среднего (DM), содержащие BGM, 1 Нм 1,25-(OH)2-витамина D3 и 1 мкм простагландина Е2 (1 мл/хорошо).
      Примечание: Один мыши BALB/c обеспечивает достаточное количество прекурсоров OC для одной культуры 24-ну плиты.
  3. Подготовка совместного культуры мыши OB-OC с биоматериала
    1. Предварительно Инкубируйте β-TCP дисков диаметром 14 мм или говяжьи кости ломтика (1 см2) в 1 мл BGM в пластине 24-ну подвеска культуры при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа перед добавлением клетки.
      Примечание: Говяжьи кости фрагменты являются физиологическим субстратом контрольную группу для изучения дифференциации OC присутствии биоматериалов.
    2. Добавление 8.8 x 104 клетки/см2 первичных OBs приостановлено в BGM на биоматериалы или управления кости в пластине 24-ну подвеска культуры или к пластине 24-ну тканевые культуры. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
      Примечание: OBs придают биоматериала или говядину кости или пластик.
    3. Добавьте свежие изолированные костного OC прекурсоров до 24 ч культивированный первичной OBs и культуры при 37 ° C и 5% CO2 на 5 дней. Замените носитель свежеприготовленные OC DM каждый день. Затем пятно OCs для тартрата стойкие кислой фосфатазы (ловушка) для оценки OC дифференциации.
  4. OC дифференциация оценены ЛОВУШКУ пятнать
    1. Характеризовать Зрелые многоядерные OCs, полученных из шага 2.3.3, аспирационная питательной среды от управления культуры ткани и крышку культуры подвеска биоматериала и добавьте 1 mL ПБС (37 ° C). Аспирационная PBS и исправить клетки путем инкубации их в 1 мл раствора формалина 10% буферизуются в РТ за 10 мин.
    2. Аспирационная раствор формалина 10% буферизации с одноразовой пипетки и добавьте 1 mL ПБС на RT. повторять этот шаг в три раза, аспирационная PBS, заменить ЛОВУШКУ буфера (рН 5) 1 мл и инкубировать пластины при 37 ° C за 30 мин.
    3. Аспирационная буфере ловушки и добавить 1 мл ацетона и 100% этанола 1:1. Инкубировать пластину на RT 30 s. быстро аспирата ацетон этанола раствор с одноразовой пипетки и полностью высушите пластины на RT.
    4. Для окрашивания раствора ловушки Подготовьте 10 мг/мл Нафтол AS-MX фосфат Стоковый раствор в N, N-Диметилформамид, Растворите 0,6 мг/мл быстро красный фиолетовый соли в ЛОВУШКУ буфера и добавить 0,1 мл раствора запасов Нафтол AS-MX фосфата 10 мл быстро красный фиолетовый соли в ЛОВУШКУ буфера.
    5. Добавьте 1 mL ловушки, окрашивание раствора и инкубировать пластины при 37 ° C за 10 мин, затем аспирационная ЛОВУШКУ, окрашивание раствора и добавьте 1 mL ультрачистая вода для остановки реакции.
    6. Передача β-TCP диски и ломтиками говяжьи кости после окрашивания в новой скважины, наблюдать красный окрашенных OCs с использованием световой микроскоп (увеличение: 10 X) и перечисление ЛОВУШКУ + Зрелые OCs с тремя или более ядрами.

3. критического размера мышь дефект черепа модель

  1. Придать бупренорфин 0,1 мг/кг подкожно (с.к.) в 8 - неделя старый мышей BALB/c для обезболивания.
  2. Анестезировать мышей с смесь 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг Ксилазина и.п., добавьте гель или мази в глаза, чтобы держать их влажными и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки при 37 ° C в течение всей процедуры для предотвращения переохлаждения. Оценка глубины анестезии, ноги и хвост пинча.
  3. Брить шерсть на верхней части головы между ушами и очистите поверхность с 7,5% повидон йод раствор и 70% этанола.
  4. Сделайте срединной Сагиттальный разрез на вершине черепа между ушами с стерильным скальпель подвергать calvarium и удалить ум соединительной ткани выше правой теменной кости, соскоб с помощью скальпеля.
  5. Создание критического размера дефекта в правой теменной кости с помощью стерильного стоматологического трепаном с диаметром 4 мм (2000 об/мин) под постоянной ирригации с нормальный физиологический раствор насекают правый теменная кость и прорваться через ectocortex и некоторые endocortex.
  6. Для предотвращения повреждения твердой мозговой оболочки, используйте маленький лифт периостальная прорваться через оставшиеся endocortex, осторожно поднимите подвздошную кость и удалить его с щипцами. Результате дефекта следует циркуляр и приблизительно в 3,5 мм в диаметре.
  7. Заполнить дефект черепа с предварительно замоченные (стерильные ПБС в RT) β-TCP/C пены с помощью щипцов.
  8. Подготовьте соответствующее количество соответствует возрасту, Шам негативный контроль с пустой дефекта.
  9. Хранить биоматериал в месте, положите 0.5 мкл ткань клей на краю дефекта в двух противоположных точках.
  10. Закройте кожи с не рассасывающиеся шовные.
  11. Очистите все хирургические инструменты с холодной sterilant поддерживать стерильные условия перед выполнением следующей операции на наркотизированных мыши.
  12. После хирургического лечения место животных на сухом и чистом нагревательная пластинка при 37 ° C в области хирургии для надлежащего мониторинга во время периода восстановления. Контролировать частоту дыхания, температуру тела и цвет слизистых оболочек и глаза каждые 10 мин, до тех пор, пока они звонок.
  13. Передача управляемых сознательного мышей в клетку с пищей и водой, отделена от других животных до полного восстановления. Придать 0,1 мг/кг бупренорфин s.c. послеоперационные болеутоляющие терапии дважды в день в течение 72 ч. Возвращение полностью восстановился мышей в их клетках.
  14. Для определения эффективности биоматериала, усыпить и.п. мышей с раствором Ксилазина кетамина и 24 мг/кг 200 мг/кг.
  15. В 8 – 12 недель после имплантации обезглавить Усыпленных мышь с острыми ножницами.
  16. Исправить головку обезглавленное мыши в 30 мл 4,5% буферизации раствор формалина для 1-2 недели, чтобы гарантировать полное проникновение фиксатором в ткани.
  17. Перевод главы на 70% этиловом спирте для длительного хранения при температуре 4 ° C на срок до одного года.
  18. Использование Микро Компьютерная томография (microCT) или стандартизированных undecalcified Гистологические техники для оценки костной регенерации. Это можно использовать microCT, сканирование на посмертный образцы с высоким разрешением (90 кв, 4 мин) в 2D и 3D сагиттальной и фронтальной плоскости.
  19. Для undecalcified гистология обезвоживает головки в возрастающем сортов этанола и встроить в гликоль метилметакрилата.
  20. Вырезать гликоль метилметакрилат встроенные блоки с бриллиантом увидел и шлифуют секции толщиной примерно 80 – 100 мкм.
  21. Оцените Levai Laczko мореная кость разделы для определения новой кости формирования14.

4. в Vitro иммунного ответа

  1. Усыпить наивно 8 - неделя старый BALB/c мышей и.п. с раствором Ксилазина кетамина и 24 мг/кг 200 мг/кг.
  2. Поместите курсор мыши на его правой стороне, брить шерсть на левой стороне и протереть кожу над левой части живота с 70% этиловом спирте.
  3. Сделайте 10 мм в длину и 1 мм глубокий разрез в коже мыши на левой стороне кзади после ребра через желудок стерильными ножницами.
  4. Откройте кожу и затем подвергать брюшины. Сделать 10 мм и глубиной менее 1 мм разрез в брюшину, используя ножницы в стерильных условиях.
  5. Нажмите живот проксимально подвергать селезенки.
  6. Аккуратно возьмите селезенки стерильным пинцетом и удалите его, резки ткани и сосудов, прилагается ниже.
  7. Поместите нетронутыми селезенки в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл холодного 1 x стерильные PBS.
  8. Подготовьте одну ячейку подвеска, мясорубки селезенки, используя 2 стерильный пинцет или 2 стерильных стеклянных скольжениях.
  9. Удаление мусора, передав его через стрейнер клеток стерильные 40 мкм с холодной ПБС, используя поршень шприца 1 мл.
  10. Центрифуга для одной ячейки подвеска на 300 x g 10 мин при температуре 4 ° C в 50 мл Конические трубки, аспирационная и удалить супернатант. Затем Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл буфера lysis эритроцитов (РБК).
  11. Инкубировать суспензию клеток для 14 мин в RT и остановить реакции, добавив 45 мл Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) среды.
  12. Центрифуга клетки после лизиса клеток на 300 x g 10 мин при температуре 4 ° C и затем удалить супернатант.
  13. Ресуспензируйте splenocytes в среду RPMI, содержащую 10% тепло инактивированная FBS, 1% раствора пенициллина и стрептомицина, 0,1% гентамицин, ß меркаптоэтанол 0,2% и 1% несущественные аминокислот.
  14. Предварительно Инкубируйте β-TCP/C пены в стерильных 96-луночных культуры пластины, содержащий среду RPMI для 24 ч при 37 ° C и 5% CO2 до заполнения ячейки.
  15. В титруемая чисел, напримердобавить splenocytes., 1,25 x 105, 2,5 x 105 и 5 x 105/well скважин в плиту 96-луночных культуры ткани содержащие, RPMI среднего и добавок, с или без предварительного инкубирован пены β-TCP/C.
  16. Добавить 10 мкг/мл конканавалина (Con A) растворяют в среде для в общей сложности 100 мкл/также соответствующие лунки и затем Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 за 72 ч.
  17. Мера пролиферации с assay Бромдезоксиуридин (BrdU). Добавить 10 мкл/хорошо BrdU маркировки раствора на 48 ч культуры клеток и затем инкубировать пластину на дополнительные 24 часа.
  18. 72 h собирать супернатант и хранить при температуре от-20 ° C до дальнейшего использования.
  19. Добавить 200 мкл/хорошо фиксации решения каждой скважины и затем Инкубируйте 30 мин на RT. аспирата решение фиксации. Добавьте 100 мкл/хорошо антитела анти BrdU рабочего раствора и проинкубируйте 90 мин.
  20. Аспирационная раствор антител, Промыть лунки три раза с 200 – 300 мкл/хорошо моющего раствора и удалить моющий раствор.
  21. 100 мкл раствора субстрата и Инкубируйте 3 – 10 мин на RT, а затем измерения оптической плотности на 450 Нм.
  22. Измерить интерлейкина 1β (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкина-4 (Ил-4) и интерферона гамма (ИФН γ) в собранных supernatants, используя стандартный ELISA.

5. Высокая пропускная способность внутрибрюшинного модель

  1. Анестезировать женщин 6-8-недельного старых мышей BALB/c со смесью 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг Ксилазина и.п. и добавить гель или мази в глаза, чтобы держать их влажными и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки при 37 ° C в течение всей процедуры для предотвращения переохлаждения. Оценка глубины анестезии, ноги и хвост пинча.
  2. Брить брюшной меха и чистый с 7,5% повидон йод раствор и 70% этанола.
  3. Сделать надрез длиной срединной 8 мм через кожу вдоль linea alba. Сделайте небольшой надрез в брюшину, с помощью скальпеля.
  4. Стерильные PBS место пропитанной β-TCP/C пены графтов (2 x 2 x 2 мм3) в брюшной полости или без добавлены материалы для мышей управления соответствует возрасту Шам.
  5. Шовные брюшины и кожи с рассасывающиеся и не рассасывающиеся шовные, соответственно.
  6. Очистите все хирургические инструменты с холодной sterilant поддерживать стерильные условия перед выполнением следующей операции на наркотизированных мыши.
  7. После хирургического лечения место животных на сухом и чистом нагревательная пластинка при 37 ° C в области хирургии для надлежащего мониторинга во время периода восстановления. Контролировать частоту дыхания, температуру тела и цвет слизистых оболочек и глаза каждые 10 мин, до тех пор, пока они звонок.
  8. Передача управляемых сознательного мышей в клетку с пищей и водой, отделена от других животных до полного восстановления. Возвращение полностью восстановленные мышей в их клетках.
    Примечание: Данная процедура вызывает минимальный боль. Послеоперационная терапия обезболивающее обычно не является необходимым. Если эксплуатируемых животных показывают признаки боли, придать 0,1 мг/кг бупренорфин s.c. или другой соответствующий обезболивающий препарат для облегчения боли.
  9. Усыпить мышей 7 дней после имплантации, с раствором 200 мг/кг кетамина и 24 мг/кг Ксилазина и.п.
  10. В 7 дней после имплантации Промывание брюшной полости, используя 1 мл шприц с иглой 25 G для в общей сложности 3 мл холодного PBS, удерживая головку мыши и вставляя иглу в левом нижнем квадранте брюшной и цель проксимально.
    Примечание: Перитонеальной жидкости должна быть свободной от эритроцитов.
  11. Центрифуга перитонеальный лаваж жидкости на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C и собирать перитонеальной жидкости для хранения при температуре-20 ° C для ELISA измерений цитокинов ИЛ 1β, Ил-2 и Ил-4.
  12. Аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS и подсчитать перитонеальный ячейки, используя Трипановый синий на Горяева.
  13. Cytocentrifuge суспензию клеток в 5 x 105 клеток на стеклянных вставках, позволяют слайды для сухой и пятно для дифференциальной клеток Кол.
  14. С помощью световой микроскоп, рассчитывать минимум 300 клеток в общей сложности и различать макрофагов и эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов.

6. подострой подкожной модель

  1. Анестезировать мышей BALB/c женщин 6 – 8 неделя старый смесью 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг Ксилазина и.п., добавьте гель или мази в глаза, чтобы держать их влажными и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки при 37 ° C в течение всей процедуры для предотвращения переохлаждения. Оценка глубины анестезии, ноги и хвост пинча.
  2. Поместите курсор мыши на его спине, брить брюшной меха и бритая поверхность с 7,5% повидон йод раствор и 70% этанола.
  3. Сделать надрез длиной срединной 8 мм через кожу вдоль linea alba живота с помощью скальпеля и затем имплантата PBS пропитанной биоматериала (2 x 2 x 2 мм3) под кожу или добавить материалы для мышей управления соответствует возрасту Шам.
  4. Шовный материал кожи с не рассасывающиеся шовные.
  5. Очистите все хирургические инструменты с холодной sterilant поддерживать стерильные условия перед выполнением следующей операции на наркотизированных мыши.
  6. После хирургического лечения место животных на сухом и чистом нагревательная пластинка при 37 ° C в области хирургии для надлежащего мониторинга во время периода восстановления. Контролировать частоту дыхания, температуру тела и цвет слизистых оболочек и глаза каждые 10 мин, до тех пор, пока они звонок.
  7. Передача управляемых сознательного мышей в клетку с пищей и водой, отделена от других животных до полного восстановления. Возвращение полностью восстановленные мышей в их клетках.
    Примечание: Данная процедура вызывает минимальный боль. Послеоперационная терапия обезболивающее обычно не является необходимым. Если эксплуатируемых животных показывают признаки боли, придать 0,1 мг/кг бупренорфин s.c. или другой соответствующий обезболивающее.
  8. Когда будете готовы изучить сайт имплантации, усыпить и.п. мышей с раствором Ксилазина кетамина и 24 мг/кг 200 мг/кг.
  9. Восемь недель после имплантации, акцизы на сайте имплантации с окружающих тканей (1 см2).
  10. Исправить ткани в 4,5% буферизуются формалин растворе на ночь, внедрить в парафин и нарезать 4 мкм секции.
  11. Пятно 4 мкм парафин врезанных тканей секции с гематоксилином и эозином (H & E) для воспаления или Массон в trichrome для осаждения коллагена и фиброза.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Чтобы оценить β-TCP для ее эффективности в качестве биоматериала для ремонта костей, мы использовали в пробирке и в естественных условиях отбора методов. Во-первых мы измерили Обь ответы на β-TCP дисков, по сравнению с базовой средней только элементами управлени...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы покажем многодисциплинарного подхода для доклинических оценки биосовместимость для представителя биоматериалов, разработанных для костной регенерации и ремонта. Мы протестировали ответы OBs, OCs, и исцеления ответ в vivo в критических костных дефектов модели мышей, а также

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот исследовательский проект получил финансирование от Европейского союза, седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013), Грант соглашение № 263363.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm)Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam)Orthovita2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM)α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrateThermo ScientificC7027Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagentInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
DC protein assay kit IIBio Rad5000112DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II)Roche4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
Formalin solution neutral buffered 10%Sigma-AldrichHT501128
GlycineSigma-AldrichG8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrateSigma-AldrichC9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma-AldrichA8960
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670
MEM alpha medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM)α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin  Sigma-AldrichP4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20Sigma-AldrichP1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen freeVWRL0970-500
Wash bufferAdd  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chlorideSigma-Aldrich1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG5422
24-well suspension culture plateGreiner bio-one662102
24-well tissue culture plateGreiner bio-one662160
50 mL conical tubeGreiner bio-one227261
96-well black plateGreiner bio-one655076
96-well transparent plateGreiner bio-one655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Incubator: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro microplate readerTecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mLVWR20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal) Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032GFL 3032
Single-use pipet: serum pipetGreiner bio-one612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm)Greiner bio-one664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3Sigma-Aldrich179361000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
AcetoneVWR Chemicals22065.327
Bone growth medium (BGM)α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled waterCarl Roth3478.4
Ethanol (100% vol/vol)VWR Chemicals20821.365
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Fast red violet LB saltSigma-AldrichF3381
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
Formalin solution neutral buffered 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM alpha Medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-DimethylformamideSigma-AldrichD4551
Naphthol AS-MX phosphateSigma-AldrichN4875
Osteoclast differentiation medium (DM)α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin Sigma-AldrichP4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Prostaglandin E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrateSigma-AldrichS7670
Sodium tartrate dibasic dihydrateSigma-AldrichS8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen freeVWRL0970-500
24-well suspension culture plateGreiner bio-one662102
24-well tissue culture plateGreiner bio-one662160
50 mL conical tubeGreiner bio-one227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Incubator: HeraCell 240Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm)Buehler
Isomet low-speed sawBuehler
Petri dish (6 cm)Greiner bio-one628,161
Screw cap glass bottle 20 mLCarl RothEXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Single-use pipet: serum pipetGreiner bio-one612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq)Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 gUrsapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution)Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalinCarl Roth2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL B. Braun Surgical1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gownHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2'' Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Heating plate: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Sterile gauze swabsHenry Schein Animal Health220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20)Henry Schein Animal Health9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH16929000
Handpiece type S-IIW&H Dentalwerk Bürmoos GmbH30056000
Trephine, diameter 4 mmHager&Meisinger GmbH229040
Irrigation tubing set 2.2 mW&H Dentalwerk Bürmoos GmbH4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mmHenry Schein Animal Health472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Animal Health300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay KitSigma-Aldrich11647229001The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
Culture medium splenocytesRPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific 10500064
GentamicinGibco, Thermo Fisher Scientific 15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Mouse INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
Non-essential amino acids solutionGibco, Thermo Fisher Scientific 11140050
Penicillin-streptomycin Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 medium, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MercaptoethanolGibco, Thermo Fisher Scientific 31350010
50 mL conical tubeGreiner bio-one227261
96-well tissue culture plateGreiner bio-one655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600RVWR
Cell strainer 40 µmBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro microplate readerTecan
Single-use sterile syringe 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 gUrsapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining KitThermo Scientific9990700For differential cell count.
Heating plate: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamberCarl RothPC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Resorbable suture: PolysorbCovidienSL-5628
Shandon centrifuge for cytopsinThermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Sterile gauze swabsHenry Schein Animal Health220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4%Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 gUrsapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalinCarl Roth2213.6
Heating plate: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gownHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Sterile gauze swabsHenry Schein Animal Health220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health9003340, 420939

Ссылки

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076(2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585(2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены