Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Riepilogo

Il numero di nuovi biomateriali ingegnerizzati per la riparazione di lesioni dell'osso grande è in continua espansione con l'obiettivo di migliorare la guarigione ossea e superare le complicazioni connesse con trapianto osseo. Qui, presentiamo una strategia multidisciplinare per test di biocompatibilità pre-clinico di biomateriali per riparazione ossea.

Abstract

Grande pseudoartrosi fratture sono una sfida significativa nell'ambulatorio ortopedico. Anche se auto - e gli innesti dell'osso allogenico sono eccellenti per la guarigione di tali lesioni, esistono potenziali complicazioni con il loro uso. Così, scienziati dei materiali sono lo sviluppo di biomateriali sintetici, biocompatibili per superare questi problemi. In questo studio, presentiamo una piattaforma multidisciplinare per la valutazione di biomateriali per riparazione ossea. Abbiamo unito le competenze da biologia dell'osso e immunologia per sviluppare una piattaforma incluso in vitro degli osteoclasti (OC) e le analisi degli osteoblasti (OB) e in vivo modelli murini di riparazione ossea, immunogenicità e allergenicità. Dimostriamo come eseguire gli esperimenti, riepilogare i risultati e relazione sulla biocompatibilità di biomateriale. In particolare, abbiamo testato la vitalità di OB, differenziazione e mineralizzazione e redditività OC e differenziazione nel contesto dei dischi di β-tricalcio fosfato (β-TCP). Abbiamo provato anche una schiuma di β-TCP/collagene (β-TCP/C) che è un materiale commercialmente disponibile usato clinicamente per la riparazione dell'osso in un modello murino di difetto critico dimensioni osso calvarial per determinare gli effetti sulle prime fasi di guarigione ossea. In esperimenti paralleli, abbiamo valutato le risposte immunitarie e allergiche nei topi. Il nostro approccio genera un profilo di compatibilità biologica di un biomateriale osseo con una gamma di parametri necessari per la predizione della biocompatibilità dei biomateriali utilizzati per la guarigione dell'osso e riparazione nei pazienti.

Introduzione

Riparazione dell'osso è un processo complesso che inizia con la formazione dell'ematoma, infiammazione, callo formazione e rimodellamento quindi^1,2. Tuttavia, potenziale di rigenerazione dell'osso è limitata alla dimensione dell'osso frattura^1,3. Per esempio, grandi fratture causate da traumi, cancro o l'osteoporosi non possono guarire e sono denominate fratture ossee non sindacale. Queste lesioni ossee richiedono spesso il trattamento per promuovere la rigenerazione e riparazione dell'osso fisiologico sano. Attualmente, il trapianto di osso autologo e allogenico è l'approccio di scelta⁴ con procedure di sostituzione ossea 2,2 milioni annualmente⁵. Se queste procedure hanno un alto tasso di successo, ci possono essere complicazioni, ad esempio, la disponibilità limitata di osso, infezione, morbilità del sito donatore e rifiuto⁴. Nuove alternative per l'ingegneria tissutale ossea vengono ricercate per affrontare queste sfide.

La progettazione di biomateriali basati su polimeri naturali o sintetici, bioceramics o metalli in combinazione con le cellule e molecole bioattive è il luogo⁶. Nostra attuale comprensione dell'osso fisiologica guarigione e guarigione nel contesto dei biomateriali dipende da molteplici fattori come proprietà meccaniche e molteplici fattori locali e sistematici, compreso le cellule dalla circolazione e luogo di frattura^{7 ,8,9}. Biomateriali per la rigenerazione ossea mirano a promuovere osteogenicity e osteointegrazione¹⁰ e sono idealmente biocompatibile, biodegradabile e poroso (promuovere la migrazione cellulare, ossigeno e sostanze nutritive). Hanno anche bisogno di essere sufficientemente forte da sostenere il sito di frattura per alleviare il dolore. Inoltre, fattori infiammatori sono tenuti ad avviare il processo di guarigione. Tuttavia, se il biomateriale induce eccessiva infiammazione e risposte allergiche, questo potrebbe limitare o inibire^11,12di guarigione ossea. Così, un approccio interdisciplinare è necessario valutare biomateriali sviluppati per riparazione ossea.

In questo studio, presentiamo una valutazione pre-clinica di materiali rappresentativi, 1) Orthovita Vitoss schiuma che è un sostituto di innesto di osso spongioso commercialmente disponibile composto da fosfato tricalcico composto di dimensioni nanometriche puro β-tricalcio particelle di fosfato (β-TCP) e collagene bovino di tipo 1 (C) (β-TCP/C schiuma) e 2) dischi di β-TCP. Qui illustriamo test di biocompatibilità di questi biomateriali utilizzando primario degli osteoblasti (OB) e dosaggi degli osteoclasti (OC), un modello in vivo di riparazione ossea, una valutazione immunologica che comprende in vitro la proliferazione dei linfociti T e produzione di citochine e in vivo l'immunogenicità e allergenicità, come precedentemente segnalato¹³.

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Protocollo

Le procedure sono state fatte con topi BALB/c seguendo tutte le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e ricerca e sono state approvate dal Comitato per l'etica del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e della ricerca.

1. principale del Mouse OB cultura

1. Isolamento di OB da calvaria neonatale del mouse tramite digestione enzimatica
   1. Eutanasia neonatale cuccioli di 1 – 2 giorno vecchio (60 in totale) per decapitazione e posizionate le testine in una capsula di Petri con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS).
   2. Tenere la testa per la nuca del collo e tagliare la pelle via con forbici sterili. Incise il calvarium forando esso (circa 0,1 – 0,3 mm) con un paio di forbici che vengono poi inseriti sotto la volta cranica alla nuca alla base del cranio e tagliare lungo il bordo calvarial lateralmente dalla parte posteriore a anteriore sopra le orecchie e quindi abov e il ponte nasale (Figura 1).
   3. Incubare la calvaria dissecata con 8 mL di soluzione di digestione filtro sterilizzato (300 unità/mL collagenasi tipo IV e 2.14 dispase unità/mL II disciolti in α-minimo indispensabile mezzo (α-MEM)) in una provetta conica da 50 mL a 37 ° C per 10 min in un incubatore d'agitazione a 200 scuote / min.
   4. Scartare il surnatante primo e ripetere la procedura di digestione tre volte con 8 mL di soluzione di digestione. Raccogliere il surnatante contenente le celle dopo ogni fase di digestione e aggiungerlo a una provetta conica da 50 mL. Conservare la provetta conica da 50 mL con le cellule in acqua e ghiaccio fino al completamento della procedura di digestione (circa 40 min).
   5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante (con una pipetta di Pasteur attaccata ad una pompa di vuoto) e risospendere in 40 mL di mezzo di crescita ossea (BGM) contenente α-MEM con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e l'1% soluzione di penicillina-streptomicina. Quindi aggiungere 10 mL della sospensione delle cellule a 4 piastre di coltura tissutale (10 cm).
   6. Fino alla confluenza (2 – 3 giorni) della coltura le cellule a 37 ° C e 5% CO₂ .
   7. Punto di confluenza, il vecchio mezzo di aspirare e lavare le piastre di coltura del tessuto una volta con PBS 1X (37 ° C). Poi aspirare il PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina 1x contenente 0,5% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per ciascuna piastra di coltura del tessuto di 10 cm.
   8. Incubare le piastre 4 coltura a 37 ° C e 5% di CO₂ per 5 min e quindi controllare le piastre con un microscopio invertito luce per garantire che le cellule si staccano dalla plastica. Quindi è possibile trasferire tutte le sospensioni cellulari (Totale 8 mL) in una provetta conica 50 mL contenente 10 mL di BGM fresco. Lavare ogni piatto con 5 mL di fresco BGM e trasferimento alla stessa provetta conica 50 mL.
   9. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 16 mL di BGM fresco. Preparare 16 nuovi 10cm coltura tissutale piastre (divisione 1:4) contenente 9 mL di BGM. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare per ogni piatto.
   10. Ripetere i passaggi da 1.1.6. a 1.1.8.
   11. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere in 10 mL di BGM fresco. Contare le celle e calcolare la concentrazione cellulare.
       Nota: Questa procedura genera circa 7,5 – 8,3 x 10⁵ cellule/pup.
   12. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere in congelamento medio contenente 10% dimetilsolfossido (DMSO), α-MEM di 40% e 50% FBS. Trasferire 1,5 mL di sospensione cellulare per cryovials mL 2 per un totale di 2 x 10⁶ cellule per flaconcino.
   13. Flash congelare le fiale in azoto liquido per stoccaggio a lungo termine in un serbatoio di azoto liquido. Utilizzare le celle all'interno di un anno per garantire la piena funzionalità. Utilizzare questi OB primari per la valutazione di proliferazione (punto 1.2), differenziazione (saggi di ALP: passo 1.4., 1.5.) e la mineralizzazione (passo 1.6.) in presenza di biomateriali. Utilizzare queste cellule per la maturazione dei precursori OC osso-zucchino-derivate in co-coltura (punto 2.3).
2. Analisi di proliferazione di OB
   1. Pre-Incubare dischi di β-TCP di diametro 14 mm in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO₂ per 24 h prima aggiunta di piastre di coltura del tessuto standard OBS. uso primari per i controlli e piastre di coltura di sospensione per gli esempi di biomateriali per evitare di adesione delle cellule alla plastica.
   2. Aspirare il mezzo di pre-incubazione e quindi risospendere primario del mouse OBs in BGM. Aggiungere 4.4 x 10⁴ OBs/cm² sui dischi pre-incubate β-TCP in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti e per il gruppo di controllo, in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (1 mL/pozzetto). OBs attribuirà la piastra di coltura del tessuto o il biomateriale.
   3. Incubare per 14 giorni a 37 ° C e 5% CO₂. Durante il periodo di incubazione, cambiare il mezzo ogni 2 – 3 giorni e aggiungere 1 mL di BGM fresco ad ogni pozzetto.
   4. Per valutare la proliferazione di OB, trasferire i dischi di β-TCP nei giorni 7 e 14 nuovi pozzi per escludere i segnali dalle cellule coltivate sulla piastra di coltura di sospensione.
   5. Aspirare il vecchio mezzo, aggiungere 0,5 mL di BGM (37 ° C) e incubare le piastre di coltura per 30 min a 37 ° C e 5% CO₂. Quindi 55 µ l di reagente di proliferazione cellulare: 10x (01:10 diluizione) direttamente nella cultura ben. Per gli spazii in bianco, preparare tre pozzetti contenenti 0,5 mL di BGM e 55 µ l del reagente di proliferazione delle cellule di 10x. Incubare tutte le piastre per 30 min a 37 ° C e 5% CO₂.
   6. Prelevare e trasferire 150 µ l del surnatante da pozzetti in una piastra 96 pozzetti nera e leggere fluorescenza con eccitazione a 560 nm ed emissione a 590 nm. Sottrarre le letture in bianco dalle letture del campione.
3. Saggi di differenziazione e mineralizzazione di OB
   1. Pre-Incubare dischi di β-TCP di diametro 14 mm in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO₂ per 24 h prima di aggiungere le piastre di coltura del tessuto standard OBS. uso per controlli e piastre di coltura di sospensione per gli esempi di biomateriali per evitare adesione delle cellule alla plastica.
   2. Aspirare il mezzo di pre-incubazione e quindi risospendere primario del mouse OBs in BGM. Aggiungere 8,8 x 10⁴ OBs/cm² sui dischi pre-incubate β-TCP in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti e per il gruppo di controllo, in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (1 mL/pozzetto). OBs attribuirà la piastra di coltura del tessuto o del campione di biomateriale.
   3. Sostituire il RGB con 1 mL di terreno di mineralizzazione osteogenica (MM) contenente BGM, 50 µ g/mL di acido ascorbico e β-glicerofosfato di 5 mM 24 h dopo l'aggiunta del ob di e incubare per 14 giorni a 37 ° C e 5% CO₂. Modificare il mezzo ogni 2 – 3 giorni con 1 mL di MM preparata in ciascun pozzetto.
4. Differenziazione di OB valutata dall'attività della fosfatasi alcalina (ALP) da lisati cellulari
   1. Per misurare l'attività del ALP il giorno 7 dopo l'aggiunta del MM, aspirare il terreno di coltura dai pozzi e poi lavare con 1 mL di PBS 1X sterile (37 ° C). Aspirare accuratamente il PBS per consentire le cellule allegate a rimanere sulla coltura del tessuto plastica o biomateriale e congelare le piastre a-80 ° C.
   2. Dopo 24 h (o fino a 2 settimane), scongelare la piastra di coltura del tessuto e piastra di coltura di sospensione di biomateriale a temperatura ambiente (TA) per preparare per la lisi di OB. Per gli esempi di biomateriali, trasferire i dischi di β-TCP in una nuova piastra di coltura sospensione per escludere le cellule fissate alla piastra. Aggiungere 75 µ l di 1x buffer di lisi delle cellule di entrambe le piastre. Agitare le piastre per 5 minuti su un agitatore a 400 frullati/min.
   3. Trasferire il lysate delle cellule in una microcentrifuga 0,5 mL e centrifugare a 300 x g per 6 min a RT per rimuovere i detriti. Aggiungere 50 µ l del surnatante lisato cellulare del campione ad una piastra 96 pozzetti nera e quindi aggiungere 50 µ l di una soluzione composta da 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfato (DiFMUP) substrato fluorogenico disciolto in 2 x tampone ALP (pH 10) per pozzetto. Impostare due pozzetti del bianco con 100 µ l di una soluzione di 1:1 contenente 1 tampone di lisi delle cellule di x e 2 x ALP buffer.
   4. Preparare 8 norme di riferimento con 100 μL/pozzetto con la (DiFMU) 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin che vanno da 0,5 a 200 μM sciolto in soluzione di 1:1 contenente 1 tampone di lisi delle cellule di x e 2 x ALP buffer per generare una curva standard di riferimento.
   5. Incubare la piastra nera a 37 ° C per 15 min e poi leggere la fluorescenza con l'eccitazione a 358 nm ed emissione a 455 nm. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.
   6. Normalizzare l'attività enzimatica ALP dai lisati cellulari alla quantità totale di proteina usando un'analisi colorimetrica per la concentrazione di proteina. Preparare albumina di siero bovino (BSA) tra gli standard con il proteina riferimento a un intervallo compreso tra 0,05 – 2,5 µ g / µ l disciolto in 1x tampone di lisi delle cellule per generare una curva standard.
   7. Preparare il campione lisati cellulari e gli standard di proteina di BSA in duplicati. Aggiungere 5 µ l di cella campione lisata o 5 µ l di proteina BSA standard in una piastra a 96 pozzetti e quindi aggiungere 25 µ l di reagente A' e 200 µ l di reagente B. Set up due pozzetti del bianco con 5 µ l di tampone di lisi delle cellule: 1x. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 15 min e poi leggere l'assorbanza a 690 nm. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.
5. Differenziazione di OB valutata dalla macchiatura ALP nella coltura delle cellule
   1. Macchia ALP in OBs coltivate il giorno 7 dopo l'aggiunta di MM su una piastra di coltura del tessuto di controllo e il biomateriale in una piastra di coltura di sospensione.
   2. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti e sostituirlo con 0,5 mL di PBS 1X (37 ° C). Aspirare il PBS e fissare le cellule di incubarle in 0,5 mL di formalina 10% tamponata a temperatura ambiente per 1 min.
   3. Aspirare la formalina 10% tamponata con una pipetta monouso e aggiungere 0,5 mL di tampone di lavaggio (0.05% Tween20 in PBS 1X).
   4. Sciogliere una tavoletta di substrato del (BCIP/NBT) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato/nitro blu in 10 mL di acqua ultrapura e agitare fino a completa dissoluzione. La soluzione deve essere protetto dalla luce e utilizzata entro 2 h.
   5. Aspirare il tampone di lavaggio e sostituire con 0,5 mL di soluzione di substrato BCIP/NBT e incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 10 min. aspirare la soluzione colorante e con 0,5 mL di tampone di lavaggio.
   6. Trasferire i dischi macchiato β-TCP in un nuovo pozzo e le piastre di ALP-macchiato la scansione con uno scanner piano convenzionale alla macchiatura di ALP record.
6. Mineralizzazione OB valutata mediante colorazione con Alizarin Red S (ARS)
   1. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti contenenti primario OBs 14 giorni dopo l'aggiunta di MM e lavare due volte con 0,5 mL di PBS 1X a RT. aspirato il PBS e fissare le cellule con l'aggiunta di 0,5 mL del 10% formalina soluzione tamponata a temperatura ambiente per 10 min.
   2. Formalina 10% tamponata con una pipetta monouso di aspirare e lavare due volte con 0,5 mL di acqua ultrapura.
   3. Per gli OB fissi, aggiungere 0,25 mL di soluzione colorante ARS di 40 mM (pH 4.2) dissolto in acqua ultrapura e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti su un agitatore a frullati 100/min.
   4. Aspirare la soluzione colorante con una pipetta monouso e risciacquare con 1 mL di acqua ultrapura. Ripetere questo passo 5 – 10 volte per rimuovere aspecifici di colorazione.
      Nota: La soluzione di risciacquo deve essere senza colore.
   5. Aspirare l'acqua ultrapura e aggiungere 1 mL di PBS freddo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti su un agitatore a frullati 100/min.
   6. Aspirare il PBS, trasferire i dischi macchiato β-TCP per un nuovo pozzo e scansione le piastre con uno scanner piano per mineralizzazione record.
   7. Aggiungere 0,25 mL di soluzione di cloruro di cetylpyridinium 10% e incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore a 100 frullati/min per estrarre la tintura di ARS.
   8. Trasferire i surnatanti in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 17.000 x g per 5 minuti a TA.
   9. 10% cetilpiridinio cloruro soluzione agli estratti con un rapporto di diluizione di 01:10-01:20 ed aggiungere i campioni (300 µ l) in una piastra a 96 pozzetti inclusi due pozzi a vuoti contenente solo 10% cloruro di cetylpyridinium.
   10. Preparare 7 ARS norme di riferimento che vanno da 4 a 400 µM diluendo l'ARS 40 mM colorazione con soluzione di cloruro di cetylpyridinium 10% di soluzione (pH 4.2) per generare una curva standard.
   11. Aggiungere 300 µ l di standard di riferimento in duplicati per la piastra a 96 pozzetti.
   12. Leggere l'assorbanza dei campioni, gli spazii in bianco e fanno riferimento a norme a 520 nm.
   13. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.

2. Mouse OB-OC co-coltura per derivare maturo OCs

1. Preparazione e sterilizzazione delle fette di osso corticale bovino
   1. Segmenti dell'osso dal tessuto circostante di pulire e rimuovere il trabecular dell'osso e del midollo osseo.
   2. Asciugare l'osso a 50 ° C per 24 h.
   3. Tagliare l'osso in blocchi più piccoli e tagliatelo a fette (circa 300 – 350 µm di spessore) utilizzando una bassa velocità sega con una lama di diamante.
   4. Tagliare le fette di 300 – 350 µm in dischi quadratici (1 cm²).
   5. Per pulire i dischi di osso (1 cm²), metterle in un flaconcino di vetro chiudibili a chiave e riempire con acqua distillata. Trasferire il flaconcino di vetro riempito in un bagno ad ultrasuoni e Sonicare per 5 min. Ripetere questa operazione tre volte.
   6. Versare l'acqua distillata, aggiungere etanolo al 70% e Sonicare per 5 min.
   7. Versare fuori l'etanolo al 70% e sostituire con etanolo al 100%.
      Nota: Conservare le fette di osso in etanolo al 100% a 4 ° C fino a 4 settimane.
   8. Irradiare le fette di osso con luce UV per 15 minuti su ogni lato in condizioni sterili. Conservare le fette di osso sterilizzato in una piastra di coltura sterile a temperatura ambiente fino all'ulteriore utilizzo.
2. Isolamento dei precursori del midollo osseo OC
   1. Eutanasia ingenuo topi BALB/c di 8 – 12 settimane vecchio usando un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
   2. Isolare i precursori OC del midollo osseo da mouse femori e le tibie.
   3. Rimuovere le gambe con forbici sterili dal punto più vicino al corpo all'articolazione dell'anca, tagliare le membra alle articolazioni del ginocchio e della caviglia e rimuovere i tessuti molli con bisturi sterile ed il forcipe. Tagliare l'epifisi. Scovare e sospendere il midollo con 1mL BGM in un piatto di Petri sterili cm 6 utilizzando un ago 27G attaccato ad una siringa da 1mL per ottenere una sospensione cellulare.
   4. Aggiungere la sospensione cellulare in una provetta conica 50 mL, lavare i 6 cm di Petri con 5 mL di BGM e trasferimento alla stessa provetta conica 50 mL. Centrifuga a 350 x g a 4 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in mezzo di differenziazione di OC (DM) contenente BGM, 1 nanometro 1,25₂-vitamina D3 e 1 µM della prostaglandina E₂ (1 mL/pozzetto).
      Nota: Un mouse BALB/c fornisce un numero sufficiente di precursori OC per una piastra di coltura 24 pozzetti.
3. Preparazione di co-coltura del mouse OB-OC con biomateriale
   1. Pre-Incubare 14 mm diametro β-TCP dischi o fette di osso bovino (1 cm²) in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO₂ per 24 h prima di aggiungere le celle.
      Nota: Fette di osso bovino sono un gruppo di controllo di substrato fisiologico per studiare la differenziazione di OC in presenza di biomateriali.
   2. Aggiungere 8,8 x 10⁴ cellule/cm² di primaria OBs sospesa in BGM su biomateriali o l'osso di controllo in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti o ad una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti. Incubare a 37 ° C e 5% CO₂ per 24 h.
      Nota: OBs allegare per la plastica o l'osso di biomateriale o bovina.
   3. Aggiungere appena isolato precursori OC del midollo osseo per la 24h in coltura primaria OBs e coltura a 37 ° C e 5% CO₂ per 5 giorni. Sostituire il mezzo con preparati OC DM ogni altro giorno. Quindi macchiare OCs per fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) per valutare la differenziazione di OC.
4. Valutato da trappola che macchia la differenziazione OC
   1. Per caratterizzare maturo OCs multinucleated, ottenuta dal punto 2.3.3, aspirare il terreno di coltura dalla piastra di coltura del tessuto e la piastra di coltura di sospensione biomateriale e aggiungere 1 mL di PBS 1X (37 ° C). Aspirare il PBS e fissare le cellule di incubarle in 1 mL di soluzione di formalina 10% tamponata a temperatura ambiente per 10 min.
   2. Aspirare la soluzione di formalina 10% tamponata con una pipetta monouso e aggiungere 1 mL di PBS 1X a RT. Ripetere questo passaggio tre volte, quindi aspirare il PBS, sostituire con 1 mL di tampone TRAP (pH 5) e incubare le piastre a 37 ° C per 30 min.
   3. Aspirare il buffer di trappola e aggiungere 1 mL di 1:1 di acetone e 100% di etanolo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 s. rapidamente aspirato l'acetone-etanolo soluzione con una pipetta monouso e asciugare completamente le piastre a TA.
   4. Per la trappola soluzione di colorazione, preparare un 10 mg/mL soluzione di riserva di fosfato naftolo-AS-MX in dissolvenza di N, N-dimetilformammide, 0,6 mg/mL di viola rosso veloce sale nel buffer di trappola e aggiungere 0,1 mL di soluzione di riserva di fosfato naftolo-AS-MX a 10 mL di sale veloce rosso viola nel buffer di trappola.
   5. Aggiungere 1 mL di trappola macchiatura soluzione Incubare la piastra a 37 ° C per 10 min, poi aspirare la trappola macchiatura soluzione e aggiungere 1 mL di acqua ultrapura per arrestare la reazione.
   6. Trasferire i dischi di β-TCP e fette di osso bovino dopo colorazione in un nuovo pozzo, osservare OCs macchiato rosso utilizzando un microscopio ottico (ingrandimento: 10x) ed enumerare TRAP + maturo OCs con tre o più nuclei.

3. dimensioni critiche Mouse difetto Calvarial modello

1. Iniettare la buprenorfina 0,1 mg/kg per via sottocutanea (s.c.) in topi BALB/c 8 - settimana-vecchi per analgesia.
2. Anestetizzare i topi con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina, aggiungere un gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
3. Radere il pelo sulla sommità della testa tra le orecchie e pulire la superficie con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
4. Fare un'incisione sagittale mediana sulla parte superiore del cranio tra le orecchie con un bisturi sterile per esporre il calvarium e rimuovere il tessuto connettivo pericranium sopra l'osso parietale destra raschiando con un bisturi.
5. Creare un difetto critico dimensioni nell'osso parietale destra utilizzando un trapano dentale sterile con un diametro di 4 mm (2000rpm) sotto costante irrigazione con soluzione salina normale per intaccare l'osso parietale destro e tagliare attraverso il ectocortex e qualche endocortex.
6. Per evitare danni al mater di dura, è necessario utilizzare un piccolo ascensore periosteal per sfondare il rimanente endocortex, sollevare l'osso calvarial delicatamente e rimuovere con il forcipe. Il difetto risultante deve essere circolare e circa 3,5 mm di diametro.
7. Riempire il difetto calvarial con pre-impregnati (sterile in 1X PBS a TA) β-TCP/C schiuma usando il forcipe.
8. Preparare il numero appropriato di pari età, sham controlli negativi con un difetto vuoto.
9. Per mantenere il biomateriale in luogo, mettere 0,5 µ l di adesivo del tessuto al bordo del difetto in due punti opposti.
10. Chiudere la pelle con una sutura non assorbibile.
11. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
12. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
13. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Iniettare la buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. per terapia analgesica post-chirurgica due volte al giorno per 72 h. ritorno completamente recuperato topi nelle loro gabbie.
14. Per determinare l'efficacia del biomateriale, eutanasia il i.p. di topi con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
15. Presso post-l'impianto di 8 – 12 settimane, decapitare il mouse eutanasizzato con forbici affilate.
16. Correzione la testa decapitata del mouse in 30 mL di 4,5% formalina tamponata per 1-2 settimane garantire piena penetrazione del fissativo nel tessuto.
17. Trasferire le teste in etanolo al 70% per l'archiviazione a lungo termine a 4 ° C fino ad un anno.
18. Uso micro la tomografia computerizzata (microCT) o tecniche istologiche undecalcified standardizzati per valutare la rigenerazione ossea. È possibile utilizzare microCT scansione su campioni post mortem ad alta risoluzione (90 kV, 4 min) in 2D e 3D sagittale e frontale aerei.
19. Per istologia undecalcified, disidratare le teste in crescente gradi di etanolo e incorporare in metacrilato di metile glicole.
20. Tagliare i blocchi di metacrilato di metile-incastonato di glicole con una sega di diamante e macinare le sezioni ad uno spessore di circa 80 – 100 µm.
21. Valutare Levai Laczko macchiato le sezioni dell'osso per identificare per la formazione di osso nuovo¹⁴.

4. in Vitro le risposte immunitarie

1. Eutanasia ingenuo 8 - settimana-vecchio i.p. di topi BALB/c con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
2. Posizionare il mouse sul suo lato destro, radere il pelo sul lato sinistro e pulire la pelle sopra la parte sinistra dell'addome con etanolo al 70%.
3. Fare un 10 mm lunga e profonda incisione 1 mm nella pelle del mouse sul lato sinistro, posteriormente seguendo le costole sopra lo stomaco usando forbici sterili.
4. Aprire la pelle e quindi esporre il peritoneo. Fare un 10 mm di lunghezza e meno di 1 mm di profondità incisione nel peritoneo con forbici in condizioni sterili.
5. Spingere lo stomaco prossimale per esporre la milza.
6. Tenere la milza delicatamente con pinze sterili e rimuoverlo dal taglio tessuti e vasi attaccati di sotto di esso.
7. Posizionare la milza intatta in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di freddo 1X PBS sterile.
8. Preparare una sospensione unicellulare di sminuzzare la milza usando 2 pinze sterili o 2 lastre di vetro sterile.
9. Rimuovere i detriti passandolo attraverso un colino di cella 40 µm sterile con PBS 1X freddo utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 mL.
10. Centrifugare la sospensione unicellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C in una provetta conica da 50 mL, aspirare e scartare il surnatante. Quindi risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC).
11. Incubare la sospensione cellulare per 14 min a RT e interrompere la reazione aggiungendo 45 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
12. Centrifugare le cellule dopo la lisi cellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C e quindi scartare il surnatante.
13. Risospendere splenocytes in medium RPMI contenente 10% calore-inattivati FBS, soluzione di penicillina-streptomicina 1%, 0,1% gentamicina, 0,2% ß-mercaptoetanolo e gli amminoacidi non essenziali di 1%.
14. Pre-Incubare β-TCP/C schiuma in una piastra di coltura sterile 96 pozzetti contenenti medium RPMI per 24 h a 37 ° C e 5% CO₂ prima della semina delle cellule.
15. Aggiungere splenocytes titolato numeri, ad es., 1,25 x 10⁵, 2.5 x 10⁵ e 5 x 10⁵/well per pozzetti in una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti contenenti medium RPMI e additivi, con o senza la schiuma di β-TCP/C pre-incubata.
16. Aggiungere 10 µ g/mL concanavalina A (raggiro A) disciolti in mezzo per un totale di 100 µ l/pozzetto di appositi pozzetti e poi incubazione a 37 ° C e 5% di CO₂ per 72 h.
17. Misurare la proliferazione delle cellule con un saggio di bromodeossiuridina (BrdU). Aggiungere 10 µ l/pozzetto di soluzione di etichettatura di BrdU a 48 h della coltura delle cellule e quindi incubare la piastra per altre 24 h.
18. A 72 h, raccogliere il surnatante e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
19. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di soluzione di fissazione ad ogni pozzetto e incubare per 30 min a RT. aspirare la soluzione di fissaggio. Aggiungere 100 µ l/pozzetto della soluzione di lavoro di anticorpo anti-BrdU e incubare per 90 min.
20. Aspirare la soluzione di anticorpo, lavare i pozzetti tre volte con 200 – 300 µ l/pozzetto di soluzione di lavaggio e rimuovere la soluzione di lavaggio.
21. Aggiungere 100 µ l di soluzione substrato e incubare per 3 – 10 min a RT, quindi misurare l'assorbanza a 450 nm.
22. Misura dell'interleuchina-1 β (IL-1 β), l'interleuchina 2 (il-2), interleuchina-4 (IL-4) e l'interferone-γ (IFN-γ) nei surnatanti raccolti usando una ELISA standard.

5. high Throughput intraperitoneale modello

1. Anestetizzare femmina 6-8 settimane vecchi topi BALB/c con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina e aggiungere un gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
2. Radere il pelo addominale e pulire con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
3. Fare un'incisione del midline lungo 8 mm attraverso la pelle lungo la linea alba. Praticare una piccola incisione nel peritoneo usando un bisturi.
4. PBS sterile luogo intriso di innesti di β-TCP/C schiuma (2 x 2 x 2 mm³) nella cavità peritoneale o senza aggiunto materiali per i topi di controllo di pari età sham.
5. Sutura del peritoneo e della pelle con il suturare assorbibili e non assorbibili, rispettivamente.
6. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
7. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
8. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Tornare topi completamente recuperati alla loro gabbie.
   Nota: Questa procedura induce dolore minimo. Terapia analgesica post-chirurgica non è solitamente necessaria. Se l'azionamento animali mostrano segni di dolore, inietta buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. o un altro farmaco analgesico appropriato per alleviare il dolore.
9. post-L'impianto 7 giorni di topi, con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg i.p. xilazina di eutanasia
10. Presso post-l'impianto di 7 giorni, il lavaggio della cavità peritoneale con un 1 mL siringa con un ago da 25 G per un totale di 3 mL di PBS freddo tenendo premuto il mouse testa e inserire l'ago nel quadrante addominale inferiore sinistro e mirare prossimalmente.
    Nota: Il liquido peritoneale deve essere libero di RBCs.
11. Centrifugare il liquido di lavaggio peritoneale a 300 x g per 5 min a 4 ° C e raccogliere il liquido peritoneale per conservare a-20 ° C per misure in ELISA di citochine IL-1 β, il-2 e IL-4.
12. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS contare le cellule peritoneali utilizzando trypan blu su un emocitometro.
13. Citocentrifuga sospensione delle cellule alle cellule⁵ 5 x 10 a vetrini, lasciare i vetrini asciugare e macchia per un conteggio differenziale delle cellule.
14. Utilizzando un microscopio ottico, contare un minimo di 300 celle in totale e distinguere tra macrofagi, eosinofili, neutrofili e linfociti.

6. subcronica modello sottocutaneo

1. Anestetizzare topi BALB/c femmina 6 – 8 settimane vecchio con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina, aggiungere gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
2. Posizionare il mouse sul dorso, radere il pelo addominale e pulire la superficie rasata con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
3. Fare un'incisione del midline lungo 8 mm attraverso la pelle lungo la linea alba dell'addome usando un bisturi e poi impianto PBS imbevuto biomateriale (2 x 2 x 2 mm³) sotto la pelle o non aggiungere nessun materiali per i topi di controllo di pari età sham.
4. Suturare la pelle con una sutura non assorbibile.
5. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
6. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
7. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Tornare topi completamente recuperati alla loro gabbie.
   Nota: Questa procedura induce dolore minimo. Terapia analgesica post-chirurgica non è solitamente necessaria. Se l'azionamento animali mostrano segni di dolore, inietta buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. o un altro analgesico appropriato.
8. Al momento di esaminare il sito di impianto, eutanasia il i.p. di topi con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
9. post-L'impianto otto settimane, asportare il sito di impianto con circostante tessuto (1 cm²).
10. Fissare il tessuto nella soluzione di formalina al 4,5% tamponato durante la notte, incorporare in paraffina e tagliati in 4 sezioni di µm.
11. Macchia di 4 sezioni di tessuto paraffina-incastonato µm con ematossilina ed eosina (H & E) per infiammazione o di Masson tricromica per fibrosi e deposizione di collagene.

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Risultati

Per valutare la β-TCP per la sua efficacia come un biomateriale per riparazione ossea, abbiamo usato in vitro e in vivo i metodi di screening. In primo luogo, abbiamo misurato le risposte di OB per i dischi di β-TCP rispetto ai comandi da solo medio della linea di base. Nella figura 2 viene illustrato l'attuabilità di OB in risposta ai dischi di β-TCP alle 7 e 14 giorni di cultura. Attuabilità delle cellule misurata da cellule metabolic...

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Discussione

Qui, ci mostrano un approccio multidisciplinare per la valutazione preclinica di biocompatibilità per biomateriali rappresentante sviluppato per la riparazione e rigenerazione ossea. Abbiamo testato le risposte di OBs, OCs, e la risposta di guarigione in vivo in un difetto critico dell'osso modello in topi come pure in vitro e in vivo le risposte immunitarie. Abbiamo mirato a dimostrare come le analisi lavoro e riepilogare i dati e le conclusioni derivate dall'esame dei biomateriali. Mostriamo...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm)			Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam)	Orthovita	2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4			Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate	Thermo Scientific	C7027	Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water.
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138
DC protein assay kit II	Bio Rad	5000112	DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A.
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Steril-filter DMSO before usage.
Dispase II (neutral protease, grade II)	Roche	4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	E12020	EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU).
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
MEM alpha medium (α-MEM)	Gibco Life Technologies	11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Sigmafast BCIP/NBT	Sigma-Aldrich	B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15400054	Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS.
Tween20	Sigma-Aldrich	P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free	VWR	L0970-500
Wash buffer			Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G5422
24-well suspension culture plate	Greiner bio-one	662102
24-well tissue culture plate	Greiner bio-one	662160
50 mL conical tube	Greiner bio-one	227261
96-well black plate	Greiner bio-one	655076
96-well transparent plate	Greiner bio-one	655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R	VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240	Thermo Scientific
Cryovial 2 mL	Greiner bio-one	122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S	GE Healthcare Life Sciences Whatman	10462200	For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Infinite M200 Pro microplate reader	Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL	VWR	20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL	VWR	21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)	Edmund Buehler
Shaking incubator GFL3032	GFL	3032
Single-use pipet: serum pipet	Greiner bio-one	612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm)	Greiner bio-one	664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3	Sigma-Aldrich	17936	1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone	VWR Chemicals	22065.327
Bone growth medium (BGM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water	Carl Roth	3478.4
Ethanol (100% vol/vol)	VWR Chemicals	20821.365
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Fast red violet LB salt	Sigma-Aldrich	F3381
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM)	Gibco Life Technologies	11900-073
N,N-Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	D4551
Naphthol AS-MX phosphate	Sigma-Aldrich	N4875
Osteoclast differentiation medium (DM)			α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Prostaglandin E2 (PGE2)	Cayman Chemical Company	9003016	1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate	Sigma-Aldrich	S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0			Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free	VWR	L0970-500
24-well suspension culture plate	Greiner bio-one	662102
24-well tissue culture plate	Greiner bio-one	662160
50 mL conical tube	Greiner bio-one	227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R	VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240	Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm)	Buehler
Isomet low-speed saw	Buehler
Petri dish (6 cm)	Greiner bio-one	628,161
Screw cap glass bottle 20 mL	Carl Roth	EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Single-use pipet: serum pipet	Greiner bio-one	612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4''	Henry Schein Animal Health	9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g	Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution)	Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin	Carl Roth	2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL	B. Braun Surgical	1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown	Henry Schein Animal Health	1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''	Henry Schein Animal Health	9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Heating plate: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Sterile gauze swabs	Henry Schein Animal Health	220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20)	Henry Schein Animal Health	9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923	W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH	16929000
Handpiece type S-II	W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH	30056000
Trephine, diameter 4 mm	Hager&Meisinger GmbH	229040
Irrigation tubing set 2.2 m	W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH	4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm	Henry Schein Animal Health	472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm	Henry Schein Animal Health	300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit	Sigma-Aldrich	11647229001	The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution.
Concanavalin A (ConA)	MP Biomedicals	150710
Culture medium splenocytes			RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10500064
Gentamicin	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard	BioLegend	431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard	BioLegend	431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard	BioLegend	430801
Non-essential amino acids solution	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050
Penicillin-streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse	BD Bioscience	555899
RPMI 1640 medium, HEPES	Gibco, Thermo Fisher Scientific	52400025
β-Mercaptoethanol	Gibco, Thermo Fisher Scientific	31350010
50 mL conical tube	Greiner bio-one	227261
96-well tissue culture plate	Greiner bio-one	655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R	VWR
Cell strainer 40 µm	BD Bioscience	352340
Infinite M200 Pro microplate reader	Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g	Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard	BioLegend	431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard	BioLegend	431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit	Thermo Scientific	9990700	For differential cell count.
Heating plate: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber	Carl Roth	PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0	Ethicon	6683H
Resorbable suture: Polysorb	Covidien	SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin	Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Sterile gauze swabs	Henry Schein Animal Health	220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G	Henry Schein Animal Health	9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4%	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g	Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin	Carl Roth	2213.6
Heating plate: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0	Ethicon	6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown	Henry Schein Animal Health	1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Sterile gauze swabs	Henry Schein Animal Health	220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''	Henry Schein Animal Health	9003340, 420939