Visualiser les Drosophila jambe axones des motoneurones à travers la cuticule de l’adulte

Résumé

Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser le ciblage axonale avec une protéine fluorescente dans jambes adultes de la drosophile par fixation, montage, imagerie et imageries après étapes.

Résumé

La majorité du travail sur la spécification neuronale a été effectuée dans des modèles génétiquement et physiologiquement docile comme C. elegans, des larves de drosophile et poisson, qui tous s’engager dans des mouvements ondulatoires (comme ramper ou natation) comme leur principal mode de locomotion. Toutefois, un plus sophistiqué de compréhension de la spécification individuelle des motoneurones (MN) — au moins en ce qui concerne l’informant des thérapies pour les maladies — exige un système tout aussi docile qui modélise mieux les schémas complexes de locomotion axée sur l’appendice de vertébrés. Système locomoteur drosophile adult responsable marche répond à tous ces critères avec facilité, étant donné que dans ce modèle, il est possible d’étudier la spécification d’un petit nombre de jambe se distingue facilement MNs (environ 50 MNs par jambe) fois en utilisant un vaste Tableau de puissants outils génétiques et dans le contexte physiologique d’un système de locomotion axée sur les appendices. Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser l’innervation musculaire de la jambe dans une mouche adulte.

Introduction

Comme la branche de vertébrés, les jambes chez l’adulte de drosophile est organisée en segments. Chaque jambe mouche contient 14 muscles, dont chacun est composé de plusieurs fibres musculaires^1,2. Les corps cellulaires de la MNs de jambes chez l’adulte se trouvent dans le T1 (prothoracique), T2 (mésothoracique) et T3 (métathoraciques) ganglions sur chaque côté du cordon nerveux ventral (VNC), une structure analogue à la moelle épinière vertébrée (Figure 1). Il y a environ 50 MNs dans chaque ganglions, qui ciblent les muscles en quatre segments de la jambe homolatérale (coxa, trochanter, fémur et tibia) (Figure 1)³. Ce qui est important, chaque jambe adulte individuel MN a une identité morphologique unique qui est fortement stéréotypée entre animaux^3,4. Tous ces MNs uniques proviennent de 11 souches de cellules, appelées neuroblastes (NBs) produisant des jambe MNs durant les stades larvaires^3,4. À la fin de l’état larvaire toute la MNs postmitotiques immature différencier durant la métamorphose d’acquérir leurs arbres dendritiques spécifiques et axonales cibles terminales qui définissent leur morphologie unique^3,4. Précédemment, nous avons testé l’hypothèse qu’un code combinatoire de facteurs de transcription (TFs) spécifie la morphologie unique de chaque jambe adulte Drosophila MN⁵. Comme un modèle, nous avons utilisé la lignée B, une des 11 lignées NB qui produit sept sur la MNs et a démontré qu’un code combinatoire de TFs exprimée dans les jambes chez l’adulte postmitotiques MNs dicte leur morphologie individuelle. Par reprogrammation du code TF de MNs, nous avons été en mesure de basculer les morphologies MN d’une manière prévisible. Nous appelons ces TFs : MTF (morphologiques TFs)⁵.

Une des parties plus difficiles des analyses morphologiques des adultes MNs est de visualiser les axones par une cuticule épaisse et auto-fluorescent à haute résolution. Nous l’étiquette habituellement des axones avec une membrane-tag GFP qui s’exprime en MNs avec un système d’expression binaire, comme DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP ou DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, où DVglut est un puissant moteur exprimé en ⁶de motoneurones. En combinant ces outils avec d’autres techniques clonales telles que l’analyse de la mosaïque avec un marqueur répressible (MARCM)⁷, cis-MARCM⁸ou MARCMbow⁵, nous pouvons restreindre l’expression de la GFP de sous-populations de MNs, rendant l’analyse phénotypique des axones plus faciles. Nous avons généré un protocole afin de garder la jambe morphologie axonale MN intact pour la reconstruction 3D d’imagerie et suivantes en se penchant sur des questions spécifiques intrinsèques à la jambe de drosophile adulte tels que la fixation de la structure interne de la jambe adulte (1) sans affecter la morphologie de l’axone, expression fluorescente endogène et musculature de la jambe, (2) montage de la jambe pour préserver la structure d’ensemble sous un lamelle couvre-objet et dans l’orientation appropriée pour le traitement afin d’obtenir la cuticule de l’image d’imagerie et (3) fond comme signal fluorescent axonale. Alors que ce protocole a été détaillé pour la détection d’expression fluorescente dans les axones de MN, il peut être appliqué pour visualiser les autres composantes de la neuromusculature de la jambe chez les arthropodes.

Protocole

1. Dissection et la Fixation des jambes

1. Prenez un verre plaque multipuits et le nombre approprié de remplissage des puits avec l’éthanol à 70 %. Ajouter 15 à 20 CO₂-mouches anesthésiés (de sexe et de tout âge) pour chaque bien et à l’aide d’un pinceau, Tamponner doucement les mouches dans la solution d’éthanol jusqu'à ce que les mouches sont complètement submergées.
   Remarque : Cette étape consiste à enlever de l’hydrophobie de la cuticule. Ne pas laver pendant plus de 1 min, parce que cela augmente auto-fluorescence de la cuticule.
2. Rincer les mouches 3 fois avec la solution détergente de 0,3 % tensioactifs non ioniques en 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Garder les mouches dans cette solution pendant au moins 10 min.
   NOTE : Jambes sont mieux fixés lorsque vous incluez un détergent, qui est susceptible d’accroître la pénétration du fixateur à l’intérieur de la jambe.
3. Posez une plaque multipuite sur la glace avec un tube de 4 % de paraformaldéhyde (PFA).
   Remarque : La préparation des frais 4 % PFA de solution stock gratuite 16 % PFA éthanol est essentiel.
4. Forceps permet d’enlever la tête et l’abdomen des mouches sans endommager le segment thoracique ou les jambes.
   NOTE : Enlever l’abdomen rend plus facile à tenir à la volée et disséquer les jambes.
5. Disséquer les jambes à partir du segment thoracique avec une pince et placez les pieds dans les puits contenant 4 % PFA. Pour ce faire, appuyez doucement mais fermement à la jonction de coxa-thorax à l’aide de la pointe de la pince fine jusqu'à ce que le pied se détache.
6. Fixer les jambes en PFA pour la nuit à 4 ° C (total environ 20 h), 4 %.
7. Laver les pieds avec la solution de détergent agent tensio-actif non ionique 0,3 % dans du PBS 1 x, 5 x 20 min chaque.
8. Remplacer le tampon de lavage avec milieu de montage. Garder la jambe dans le milieu de montage pour au moins une journée avant le montage afin de permettre sa pénétration complète dans la jambe.
   Remarque : Si le milieu de montage est très visqueux, diluer le milieu de montage à 80 % avec du PBS 1 x car le changement soudain de viscosité peut provoquer la cuticule pour s’effondrer et d’endommager la structure globale de la jambe. Selon le pilote Gal4 , les mouches peuvent être conservées pendant 1 à 3 semaines à 4 ° C dans les supports de montage jusqu’au montage.

2. patte de fixation

1. Déposer environ 20 µL de 70 % de glycérol sur le côté gauche d’une lame de microscope et de la recouvrir d’une lamelle de² carré 22 x 22 mm (Figure 2 a, B). Distribuer environ 10 µL de milieu de montage suivant une ligne parallèle et à une petite distance du bord droit de cette lamelle. Ajouter un autre 30 µL de milieu de montage plus loin sur le côté droit de la lame (Figure 2).
   Remarque : Lorsque vous appliquez un lamelle couvre-objet sur les jambes (voir ci-dessous) le milieu de montage doucement écartera sous la lamelle et autour des jambes sans les déplacer.
2. À l’aide de pinces fines soulever la jambe de la solution et placez-le délicatement sur le milieu de montage près de la lamelle de gauche. Faites de même pour chaque jambe et alignez-les de haut en bas (Figure 2D).
   1. Lever et transférer les jambes dans une goutte de médium qui s’est tenue entre les deux extrémités de la pince. Orienter les jambes de deux façons : sur le côté extérieur vers le haut ou vers le bas.
3. Une fois toutes les pattes (6 – 8 jambes peuvent être montés en haut) sont correctement alignés, mettre une seconde lamelle sur les jambes tels que cette lamelle repose légèrement sur la lamelle couvre-objet précédemment mis (Figure 2E) pour laisser un espace entre la lamelle et le tissu et à de prévenir les jambes d’obtenir endommagé (Figure 2).
   NOTE : Également utiliser autocollant puits ou la cire orthodontique pour créer un espace entre la lamelle et la diapositive.
4. Utilisez un vernis à ongles pour fixer la position des lamelles à chaque coin (Figure 2F).
   NOTE : Le tissu est maintenant prêt à l’image.

3. imagerie

1. Mettre en place une voie unique à l’aide du laser à 488 nm et deux détecteurs simultanément pour obtenir la fluorescence GFP et la cuticule auto-fluorescence. À l’aide de la commande de la gamme ou l’affichage du curseur dans la fenêtre spectrale de la fenêtre du trajet de la lumière du logiciel, définissez la plage de détection d’un détecteur (1) 498 – 535 nm et celui de l’autre (détecteur 2) entre 566-652 nm.
   Remarque : En général, le détecteur 1 doit avoir un détecteur GaAsP et le détecteur 2 un tube photomultiplicateur. Le canal de 498-535 optimale détecte le signal de GFP mais détecte aussi la fluorescence auto de la cuticule. Cependant, le canal de 566 – 652 détecte uniquement la fluorescence de l’auto de la cuticule (Figure 3 a).
2. Utilisez un 20 X ou 25 X objectif à immersion, résolution 1024 x 1024 pixels, 12-bit de profondeur de l’huile et définir l’espacement des Z comme 1 µm. pixel Set dwell temps que µs environ 1,58 et 2 cadres/image en moyenne. Utilisez les objectifs avec grande ouverture numérique.
3. Mettre tous les autres paramètres, selon le microscope confocal et les logiciels d’imagerie utilisée.
   1. Assurez-vous d’obtenir un signal lumineux de la cuticule du détecteur 566 – 652 plutôt que par le détecteur de 498 – 535. Pour ce faire, utilisez la même puissance de laser de 488-laser pour les deux détecteurs. En utilisant les marqueurs de saturation, tout d’abord régler le gain du détecteur 1 pour obtenir un signal assez brillant de la GFP (Figure 3 b, D). Puis régler le gain du détecteur 2 pour s’assurer que certaines zones avec signal haute cuticule (bords des jambes, articulations) produiront un signal saturé dans ce détecteur (Figure 3, E).
   2. Si la jambe est prolongée et trop volumineux pour être photographiée sur une seule image, utilisez l’option tuile ou Position du logiciel d’imagerie de microscope.
4. Reconstruire les images finales soit en utilisant le microscope des logiciels d’imagerie ou à l’aide de freeware ImageJ/Fidji (voir ci-dessous).

4. le post traitement d’imagerie

1. Ouvrez la pile confocale à ImageJ/Fidji.
   1. Utiliser le plugin Bioformats (Plugins | Bio-Formats | Bio-formats importateur) dans les îles Fidji pour ouvrir les images qui ne sont pas en. Format TIF de propriétaires imaging software packages⁹.
2. Fractionner les chaînes en sélectionnant Image | Couleur | Canaux Split.
   Remarque : Si les images de plusieurs postes ont été faites et doivent être recombinées, utiliser les paires couture plugin à Fidji du (Plugins > couture > Pairwise couture)^10,11.
3. Pour soustraire le signal de la cuticule du signal de la GFP, ouvrez la calculatrice d’Image (processus | Image Calculator) : sélectionnez la pile du détecteur 1 comme 1 Image (GFP + cuticule) (Figure 4 a), sur la fenêtre opération sélectionner soustraireet sélectionnez la pile du détecteur 2 comme Image 2 (cuticule) (Figure 4 b). En conséquence, seul le signal endogène de GFP (GFP) est obtenu (Figure 4).
   1. Fusionner retour cette pile (GFP) avec la pile « cuticule uniquement » obtenue par détecteur 2 (Figure 4 b Image | Couleur | Canaux de fusion) pour obtenir une image de RVB comprenant le signal GFP tissu-spécifique, ainsi le signal de la cuticule, qui aide à identifier les axes d’axone dans les segments de la jambe (Figure 4).
   2. Régler le contraste et la luminosité de chaque image (Image | Ajuster | Brightness/Contrast) puis de générer une seule image RVB (Image | Type | Couleur RVB).
      NOTE : Pour générer une projection maximale de la pile-Z (Image | Piles | Projet de Z...), utilisez la projection de l’intensité maximale pour le signal de la GFP et l’intensité moyenne pour la cuticule, qui peut alors être ajustée pour la luminosité avant de fusionner les deux canaux.
4. Vous pouvez également utiliser une macro pour soustraction automatique et traitement d’images à ImageJ/Fidji. Copiez le texte supplémentaire 1 fichier dans l’éditeur de macros (Plugins | Nouveau | Macro), enregistrer la macro dans le dossier Plugins et redémarrez ImageJ/Fidji une fois pour pouvoir utiliser la macro.
   1. Pour utiliser la macro, ouvrez la pile confocale et ouvrez la fenêtre de luminosité/contraste (Image | Ajuster | Brightness/Contrast). Puis exécutez la macro (Plugin | Macro | Exécutez) et suivez les instructions.
   2. Interrogé à préciser l’application (fenêtre de calculatrice d’Image), choisissez Image 1 pile 1 (GFP), Image 2 comme pile 2 (cuticule) et Subtract.
      Remarque : La macro génère une image de projection maximale du signal GFP transformé (MAX_Result de stack1), une projection moyenne de la cuticule (AVG_stack2), le résultat de la soustraction de la pile de la cuticule de la pile de la GFP (résultat de stack1) et l’état brut pile de cuticule (stack2).
   3. Quand on lui demande d’ajuster le contraste, utilisez les commandes dans la fenêtre de réglage de la luminosité/pour régler la luminosité/contraste de l’image de projection maximale de GFP et de la projection moyenne de la cuticule, pour générer une image fusionnée RVB des deux signaux montrant la GFP dans vert et la cuticule en gris. Fusionner les résultat de stack1 et stack2, pour générer de la même façon une pile combinée de GFP et la cuticule qui peut être utilisée à l’étape suivante.
5. Pour visualiser les jambes en trois dimensions, utiliser des logiciels 3D spécialisés avec les piles nouvellement générés (Figure 4E).
   1. Ouvrez la pile RGB avec logiciel 3D (voir la Table des matières). Dans la fenêtre pop-up boîte de dialogue, sélectionnez toutes les voies de la section de conversion de mode et entrez la taille d’un voxel (volume d’un pixel).
      Remarque : Toutes les informations nécessaires sont contenues dans les fichiers d’image de n’importe quel logiciel propriétaire microscope utilisé.
   2. Module de canal 2 (signal de GFP), faites un clic droit et sélectionnez affichage | volren. Ensuite, faites un clic gauche sur le module volren. Dans la section Propriétés (angle inférieur gauche de l’écran) cliquez gauche sur modifier et sélectionnez volrengreen.col. Module de canal 1 (signal de cuticule) avec le bouton droit et sélectionnez affichage | volren. Ensuite, faites un clic gauche sur le module volren. Dans la section Propriétés du clic gauche sur avancé et sélectionner ddr (un écran transparent de type radiographie), puis réglez la valeur gamma pour voir le fond de la cuticule (Figure 4E).
   3. Pour générer une rotation 3D, faites un clic droit sur le module de pile de projet. Puis sélectionnez animer | tourner. Cliquez sur le module de rotation.
   4. Dans les Propriétés section cliquez sur utilisation du centre de la bbox. Sur le module de rotation avec le bouton droit et sélectionnez calculer | réalisateur. Le réalisateur du module cliquez sur le bouton gauche de la souris. Dans la section Propriétés , cliquez sur gauche sur avancé (en haut à droite de la section properties).
   5. Dans le champ nom de fichier remplir le nom de la rotation de film. Dans le domaine de la qualité écrire 1 (qualité max). Quitter le cadre à 200 si vous désirez une rotation s 8,3 (ce nombre peut être diminué ou augmenté pour modifier la vitesse de rotation). Puis appuyez sur appliquer (bouton vert, bas à gauche de la section properties (voir vidéo 1)).

Résultats

Comme illustré à la Figure 4, cette procédure permet l’imagerie excellent des axones GFP-étiqueté dans les jambes drosophile adultes, ainsi que de leurs axes terminales. Ce qui est important, un signal propre de la GFP est obtenu sans toute contamination de la fluorescence émise par la cuticule de la jambe. Le signal de la cuticule est cumulable ensuite avec le signal GFP pour identifier le positionnement des axones dans les jambes (

Discussion

La cuticule de drosophile adulte et des autres arthropodes, qui contient de nombreux pigments sombres, constitue un obstacle majeur pour la visualisation des structures à l’intérieur de leur corps. En outre, il est fortement fluorescent auto qui est aggravée par la fixation. Ces deux caractéristiques sont très problématiques pour les observations des colorants fluorescents ou des molécules à l’intérieur de l’organisme des animaux avec un exosquelette.

La procédure que nous avon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI