성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

요약

여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.

초록

대부분 신경 사양에 대 한 작업의 유전자와 순수 세공 모델 C에서 실시 되었습니다. 선 충, 초파리 애벌레 및 물고기, 모든 운동의 그들의 기본 모드 (예: 크롤링 또는 수영) undulatory 운동에 참여. 그러나, 보다 정교한 개별 모터 신경 (미네소타) 규격의 이해-이상 질병 치료를 알리는 측면에서-더 나은 모델의 복잡 한 돌출부 기반 운동 체계는 동등 하 게 세공 시스템 요구 척추 동물입니다. 걸어 담당 성인 초파리 운전 시스템 모두 충족 이러한 기준의 쉽게, 이후이 모델에서 쉽게 고유 다리 MNs (다리 당 약 50 MNs) 작은 수의 규격을 연구 수 둘 다 광대 한 사용 강력한 유전자 도구, 및 돌출부 기반 운동 체계의 생리 적 맥락에서 배열입니다. 여기 우리는 성인 비행에 다리 근육 신경 분포를 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다.

서문

척 추가 있는 사지 처럼 초파리 성인 다리 세그먼트로 구성 됩니다. 각 비행 다리는 각각의 구성 하는 여러 근육 섬유^1,214 근육을 포함 되어 있습니다. 성인 다리 MNs의 셀 시체 (prothoracic) T1, t 2 (mesothoracic), 및 복 부 신경 코드 (VNC), 척추 척수 (그림 1)에 유사한 구조의 각 측에 T3 (metathoracic) 중추에 있습니다. 어떤 대상 근육은 동측 다리 (고관절, trochanter, 대 퇴 골, 경골)의 4 개의 세그먼트에서 (그림 1)³각 중추에 약 50 MNs가 있다. 중요 한 것은, 각 개별 성인 다리 미네소타 동물^3,4사이 진부 매우 독특한 형태학 상 id를 있다. 이러한 독특한 MNs 라는 neuroblasts (NBs) 다리 MNs 애벌레 단계^3,4생산 11 줄기 세포에서 파생 됩니다. 모든 애벌레 단계의 끝에 미 숙 postmitotic MNs 취득 그들의 특정 수지상 아 버 및 axonal 터미널 대상 그들의 독특한 형태^3,4를 정의 하는 변 태 중 분화. 이전 녹음 방송 요인 (TFs)의 조합 코드 각 초파리 성인 다리 미네소타⁵의 독특한 형태를 지정 하는 가설 테스트. 모델, 우리 혈통 B 11 주의 계보는 MNs에서 7을 생산 하 고 조합 코드 postmitotic 성인 다리 MNs에에서 표현 하는 TFs의 그들의 개별 형태학 지시 증명 중 하나를 사용 합니다. MNs의 TF 코드 reprograming 여 우리 미네소타 형태학 예측 가능한 방식으로 전환할 수 있다. 우리는 이러한 TFs 전화: mTFs (형태학 TFs)⁵.

성인 MNs의 형태소 분석의 가장 어려운 부분 중 하나는 높은 해상도 자동 형광 표 피를 통해 축 삭을 시각화입니다. 우리는 일반적으로 DVglut Gal4같은 이진 식 시스템과 MNs에 표현 되는 막 태그 GFP와 축 삭 라벨 /UAS-mCD8::GFP 또는 DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, DVglut 는에 표현 하는 강한 드라이버 motoneurons⁶. Repressible 마커 (MARCM)⁷,⁸, cis-MARCM 또는 MARCMbow⁵모자이크 분석 등 다른 클론 기술로 이러한 도구를 결합 하 여 MNs phenotypic 분석의 모집단 GFP 식이 제한할 수 있습니다. 축 삭 쉽게. 우리는 프로토콜 성인 다리의 내부 구조 (1) 고정 등 성인 초파리 다리에 본질적인 특정 문제를 해결 하 여 이미징 및 후속 3D 재구성 그대로 다리 미네소타 axonal 형태를 유지 하기 위해 생성 된 축 삭 형태학, 형광 식 생과 다리 근육에 영향을 주지 않고 전체 구조는 coverslip 아래와 표 피를 처리 하는 이미지, 그리고 (3) 이미지에 대 한 적절 한 방향으로 유지 하기 위해 다리의 (2) 장착 배경으로 axonal 형광 신호입니다. 이 프로토콜 미네소타 axons에서 형광 식의 검출에 대 한 자세한 되었습니다 동안 시각화 절지동물의 다리 neuromusculature의 다른 구성 요소에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 다리 절 개 및 고정

1. 유리 다 잘 접시와 채우기 적절 한 수의 70% 에탄올과 웰 스 가져가 라. 추가 15-20 공동₂-각 (중 섹스의 모든 나이) 마 취 파리 잘와 브러쉬를 사용 하 여 부드럽게 소량 에탄올 솔루션으로 파리 파리 완전히 잠긴 때까지.
   참고:이 단계는 표 피의 hydrophobicity를 제거 하는. 이 자동-형광 표 피의 증가 하기 때문에 1 분 이상 씻지 않는.
2. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에서 3 번 0.3% 비 계면 활성 제 세제 솔루션으로 파리를 헹 구 십시오. 적어도 10 분 동안이 솔루션에 파리를 유지.
   참고: 때 다리 안쪽 정착 액의 침투를 증가 하는 세제를 포함 하 여 다리 고정 잘 됩니다.
3. 4 %paraformaldehyde (PFA) 튜브 함께 얼음에 다 잘 접시를 놓습니다.
   참고: 신선한 4%의 준비는 16 %PFA 에탄올 무료 재고 솔루션에서 PFA이 중요 합니다.
4. 집게를 사용 하 여 머리와 파리의 복 부 흉부 세그먼트 또는 다리를 손상 없이 제거 하.
   참고: 비행 하 고 다리 부를 쉽게 제거 하는 복 부.
5. 집게와 흉부 세그먼트에서 다리를 해 부하 고 4%를 포함 하는 우물에서 다리 PFA. 이 위해, 다리 분리 될 때까지 잘 집게의 팁을 사용 하 여 고관절 흉부 접합에서 부드럽게 하지만 단단히 밀어.
6. 4% PFA 4 ° C (대략 20 h 총)에서 하룻밤에 다리를 수정.
7. 1 x PBS에 0.3% 비 계면 활성 제 세제 솔루션, 20 분 동안 5 배 다리를 씻어.
8. 설치 중간에 세척 버퍼를 바꿉니다. 다리에 그것의 완전 한 침투 수 있도록 장착 전에 적어도 하루에 대 한 설치 중간에 다리를 유지.
   참고: 경우 장착 매체는 높은 점성, 점도에 급격 한 변화는 붕괴 하 고 다리의 전체 구조를 손상 표 피를 발생할 수 있습니다 때문에 장착 매체 1 x PBS와 80%에 희석. Gal4 드라이버에 따라 장착까지 미디어를 마운트에 4 ° C에서 1 ~ 3 주 위해 파리를 유지 수 있습니다.

2. 다리 장착

1. 70% 글리세롤의 약 20 µ L 현미경 슬라이드와 커버 평방 22 x 22 m m² coverslip (그림 2A, B)의 왼쪽에 놓습니다. 평행 하는 작은 거리에서이 coverslip의 오른쪽 가장자리에서 라인을 따라 설치 매체의 약 10 µ L 플라스틱 (그림 2C) 슬라이드의 오른쪽에 추가 장착 매체의 또 다른 30 µ L를 추가 합니다.
   참고: 다리 (아래 참조)는 coverslip를 적용할 때 설치 매체 부드럽게 확산 됩니다는 coverslip 아래와 다리 주위 그들을 전치 하지 않고.
2. 미세 집게를 사용 하 여 솔루션에서 다리를 들어올려 고 부드럽게 왼쪽된 coverslip 근처 장착 매체에 그것을 넣어. 각 다리에 대해 동일 하 고 위에서 아래로 (그림 2D) 그들을 정렬.
   1. 들어올린 다리는 집게의 두 끝 사이 매체의 한 방울에 전송. 두 가지 방법으로 다리 방향: 외부 측 위 또는 아래로.
3. 모든 다리 (최대 6-8 다리 거치 될 수 있다) 올바르게 정렬 하 고, 일단 넣어 두 번째 coverslip 다리는이 coverslip 이전 배치 coverslip (그림 2E) 하는 coverslip와 조직 사이의 공간에 대 한 있도록 약간 달려있다 점점 손상된 (그림 2G)에서 다리를 방지 합니다.
   참고: 또는 스티커 우물 또는 교정 왁 스는 coverslip와 슬라이드 사이의 공간에 사용.
4. 매니큐어를 사용 하 여 각 모서리 (그림 2F)에서 coverslips의 위치를 확보.
   참고: 조직 이미지 준비가 이제는.

3입니다. 영상

1. GFP 형광과 표 피 자동 형광을 동시에 488 nm 레이저 및 두 개의 검출기를 사용 하는 단일 트랙을 설정 합니다. 소프트웨어의 빛 경로 창의 스펙트럼 창에서 범위 컨트롤 또는 슬라이더 디스플레이 사용 하 여 하나의 검출기 (검출기 1) 498-535 nm와 다른 하나 (감지기 2) 566-652 nm 사이 사이 감지 범위를 설정 합니다.
   참고: 일반적으로, 발견자 1 이어야 한다 GaAsP 검출기와 검출기 2 광 전 증폭 관 관. 498-535 채널 최적의 GFP 신호를 감지 하지만 표 피에서 자동 형광 탐지. 그러나, 566-652 채널 (그림 3A) 표 피에서 자동 형광만 감지합니다.
2. X 20을 사용 하 여 또는 25 X 기름 침수 목표, 1024 x 1024 픽셀 해상도, 12-비트 깊이 Z 간격으로 1 µ m. 설정된 픽셀 면만 약 1.58 µs, 시간 평균 2 프레임/이미지 설정. 목표를 사용 하 여 높은 수 가늠 구멍으로.
3. Confocal 현미경 및 이미징 소프트웨어 사용에 따라 다른 모든 설정을 설정 합니다.
   1. 498-535 검출기 보다 566-652 검출기에서 밝은 표 피 신호를 얻을 수 있는지 확인 합니다. 이렇게 하려면 두 탐지기 488-레이저 같은 레이저 파워를 사용 합니다. 채도 마커를 사용 하 여 먼저 검출기 충분히 밝은 GFP 신호 (그림 3B, D)를 1의 이득을 조정 합니다. 그런 다음 높은 표 피 신호 (다리, 관절의 가장자리)와 일부 지역이이 검출기 (그림 3C, E)에서 포화 신호 생성 되도록 감지기 2의 이득 조정.
   2. 다리 확장 하 고 단일 프레임에 이미지를 너무 큰 경우 현미경 이미징 소프트웨어에서 타일 또는 위치 옵션을 사용 합니다.
4. 중 독점 현미경 이미징 소프트웨어 또는 ImageJ/피지 프리웨어 (아래 참조)를 사용 하 여 사용 하 여 최종 이미지를 재구성 합니다.

4입니다. 게시물 처리 이미징

1. ImageJ/피지에 confocal 스택을 엽니다.
   1. Bioformats 플러그인을 사용 하 여 (플러그인 | 바이오-형식 | Bio-formats 수입)에 되지 않은 이미지를 열고 피지에서. 독자적인 이미징 소프트웨어 패키지⁹에서 TIF 형식입니다.
2. 이미지를 선택 하 여 채널 분할 | 컬러 | 분할 채널.
   참고: 여러 위치에서 이미지 되었다 재결합 해야 하는 경우는 없음을 사용 바느질에서 피지에 플러그인 (플러그인 > 바느질 > 쌍 바느질)^10,11.
3. GFP 신호에서 표 피 신호를, 열고 이미지 계산기 (과정 | 이미지 계산기): 이미지 1 (GFP + 표 피) 탐지기 1에서에서 스택 선택 (그림 4A), 작업 창에서 빼기, 선택한 스택 탐지기 2에서에서 이미지 2 (표 피) (그림 4B). 그 결과, GFP 생 신호 (GFP)에 (그림 4C) 얻을 수 있다.
   1. 발견자 2에서에서 얻은 ' 표 피 전용 ' 스택 (GFP)이이 스택을 다시 병합 (그림 4B 이미지 | 컬러 | 병합 채널)는 RGB 이미지 구성 된 조직 관련 GFP 신호 뿐만 아니라 (그림 4D) 다리 세그먼트 내의 축 삭 아 버를 식별 하는 데 도움이 표 피 신호를.
   2. 각 이미지의 밝기 및 대비 조정 (이미지 | 조정 | Brightness/Contrast) 단일 RGB 이미지를 생성 하 고 (이미지 | 유형 | RGB 색상).
      참고: Z 스택의 최대 투영 생성 하 (이미지 | 스택 | Z 프로젝트...), GFP 신호 및 다음 두 개의 채널을 병합 하기 전에 밝기 조정 될 수 있는 표 피에 대 한 평균 강도 대 한 최대 강도 투영을 사용 하 여.
4. 또는 매크로 사용 하 여 자동 뺄셈과 ImageJ/피지에 이미지의 처리에 대 한. 매크로 편집기에서 추가 파일 1에서 텍스트를 복사 (플러그인 | 새로운 | 매크로), 플러그인 폴더에 매크로 저장 하 고 매크로 사용할 수에 ImageJ/피지 한 번 다시 시작.
   1. 매크로 사용 하려면 confocal 스택 열고 밝기/대비 창을 엽니다 (이미지 | 조정 | Brightness/Contrast). 다음 매크로 실행 (플러그인 | 매크로 | 실행) 지침을 따릅니다.
   2. 작업 (이미지 계산기 창)을 지정 하도록 요청 하는 경우 스택 1 (GFP) 이미지 1, 이미지 2 스택 2 (표 피), 그리고 빼기를 선택 합니다.
      참고: 매크로 생성 최대한 프로젝션 이미지 처리 GFP 신호 (stack1 MAX_Result)의 표 피 (AVG_stack2), 표 피 스택 GFP 스택 (stack1의 결과), 그리고는 처리에서 뺄셈의 결과의 평균 투영 표 피 스택 (stack2)입니다.
   3. 대비를 조정 하도록 요청 받을 때 밝기/제어 창에서 컨트롤을 사용 하 여 GFP, 최대한 프로젝션 이미지의 밝기/명암 대비를 조정 하 고 RGB를 생성 하는 표 피의 평균 투영의 두 신호에 GFP를 보여주는 이미지를 병합 녹색 그리고 회색에 표 피입니다. 마찬가지로 다음 단계에서 사용할 수 있는 결합된 GFP와 표 피 스택 생성을 stack1, 그리고 stack2의 결과 병합 합니다.
5. 3 차원에 다리를 시각화 하려면 새로 생성 된 더미 (그림 4E)와 전문된 3D 소프트웨어를 사용 합니다.
   1. 3D 소프트웨어와 RGB 스택 엽니다 ( 재료의 표참조). 팝업 대화 상자 창에서 모드 전환 섹션에 모든 채널을 선택 하 고 복 (픽셀의 볼륨)의 크기를 입력 합니다.
      참고: 필요한 모든 정보는 사용 되 고 어떤 독점 현미경 소프트웨어에서 이미지 파일에 포함 됩니다.
   2. 채널 2 모듈 (GFP 신호), 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 디스플레이 | volren. 그런 다음, volren 모듈에 왼쪽 클릭 하십시오. 속성 섹션 (화면 왼쪽 아래)에서 왼쪽 편집을 클릭 하 고 volrengreen.col를 선택 합니다. 채널 1 모듈 (표 피 신호)에 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 디스플레이 | volren. 그런 다음, volren 모듈에 왼쪽 클릭 하십시오. 고급 선택 ddr (투명 한 방사선 사진 처럼 디스플레이)에 속성 섹션 왼쪽에서 다음 표 피 배경 (그림 4E) 보러 감마 값을 조정 합니다.
   3. 3 차원 회전을 생성 하려면 프로젝트 스택 모듈에 마우스 오른쪽 단추로. 다음 선택 애니메이션 | 회전. 회전 모듈에서 왼쪽 클릭 하십시오.
   4. 속성 에서 섹션 bbox 센터를 사용 하 여클릭 합니다. 회전 모듈에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 계산 | 영화 제작자. 무비 메이커 모듈에서 마우스 왼쪽된 버튼을 클릭 합니다. 속성 섹션에서 클릭 왼쪽된에 고급 (속성 섹션의 오른쪽 상단).
   5. 파일 이름 필드에 영화 회전의 이름 입력. 품질 분야에서 1 (최고 품질)을 작성 합니다. 8.3 s 회전 바란다면 200 프레임 을 두고 (이 수 감소 또는 증가 하는 회전의 속도 수정). (녹색 버튼, 속성 섹션 (참조 비디오 1)의 왼쪽 아래) 적용 을 누릅니다.

결과

그림 4에서 같이,이 절차 그들의 터미널 버는 함께 성인 초파리 다리 GFP 표시 된 축 삭의 우수한 영상이 있습니다. 중요 한 것은 깨끗 한 GFP 신호 다리 표 피에 의해 방출 하는 형광에서 어떤 오염 없이 얻은 것입니다. 표 피에서 신호는 GFP 신호 식별 (그림 4E, 그림 1및 비디오 1) 다리에 축 삭의 위치를...

토론

표 피 성인 초파리와 다른 절지동물의 많은 어두운 안료를 포함 하는 그들의 신체 내부 구조를 보기 위한 중요 한 장애 이다. 또한, 그것은 강력 하 게 고정 하 여 악화 시킨 자동 형광입니다. 이 두 기능은 매우 형광 염료 또는 외 골격을 가진 동물의 체 내 분자의 관찰에 대 한 문제가 있다.

우리가 설명 하 고 우리가 일상적으로 실험실에서 사용 하는 절차는 축 삭 궤도의 고 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI