Визуализировать дрозофилы ноги мотонейрона аксоны через взрослых кутикулы

Резюме

Здесь мы описываем протокол для визуализации аксональное ориентации с флуоресцентными белка в взрослых ноги дрозофилы , фиксации, монтаж, обработка изображений и шаги пост изображений.

Аннотация

Большая часть работы по нейрональных спецификации были проведены в генетически и физиологически шансов справиться с возникающими моделей, таких как C. Элеганс, дрозофилы личинок и рыбы, которые занимаются волнообразно движений (как обход или плавание) как их основной режим локомоции. Однако, более сложный понимание спецификации индивидуального двигательного нейрона (MN) — по крайней мере с точки зрения информирования терапии болезни — требует столь же шансов справиться с возникающими системы, которая лучше моделирует комплекс на базе придаток локомоции схемы позвоночных животных. Взрослых дрозофилы опорно-двигательного аппарата отвечает за ходьба отвечает всем из этих критериев с легкостью, поскольку в этой модели это можно изучить спецификации небольшое количество легко отличить ноги MNs (примерно 50 MNs на ноги) как с использованием обширной массив из мощных инструментов генетических и в контексте физиологические системы на основе придаток локомоции. Здесь мы описываем протокол для визуализации иннервации мышц ног в взрослых летать.

Введение

Как позвоночных конечности дрозофилы взрослых ноги делится на сегменты. Каждый полет нога содержит 14 мышцы, каждая из которых включает в себя несколько мышечных волокон^1,2. Клетки тела взрослых ноги MNs расположены в Т1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 и T3 (metathoracic) ганглиев на каждой стороне воспалении брюшины шнура (VNC), структурный аналог позвоночных спинного мозга (рис. 1). Есть примерно 50 MNs в каждом ганглии, какие целевые мышцы в четырех сегментах ипсилатеральной ноге (coxa, вертела, бедра и голени) (рис. 1)³. Важно отметить, что каждый индивидуальный Взрослый ноги MN имеет уникальный морфологической идентификации, который весьма стереотипно между животных^3,4. Все эти уникальные MNs являются производными от 11 стволовых клеток, называемых нейробласты (НБС) производства ногу MNs в личиночной стадии^3,4. В конце все личиночной стадии незрелых Постмитотические MNs дифференцировать во время метаморфозы приобретать их конкретных дендритных беседки и аксональной терминала цели, которые определяют их уникальной морфологии^3,4. Ранее мы тестировали гипотеза, комбинаторные код транскрипционных факторов (TFs) определяет уникальный морфология каждой дрозофилы ноги MN⁵взрослых. Как модель мы использовали линии B, один из 11 линий NB, которые производит семь из МНБ и продемонстрировал, что комбинаторной кода TFs, выраженные в Постмитотические взрослых ногу MNs диктует свои индивидуальные морфологии. Reprograming код TF МНБ мы были в состоянии переключиться MN морфологии на предсказуемой основе. Мы называем эти TFs: mTFs (морфологические TFs)⁵.

Одна из самых сложных частей морфологического анализа взрослых MNs является визуализировать аксоны через толстые и авто люминесцентные кутикулы с высоким разрешением. Мы обычно ярлык аксоны с меткой мембраны GFP, что выражается в MNs с системой двоичного выражения, такие как DVglut-Gal4/бла mCD8::GFP или DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, где DVglut — это сильное драйвер, выраженных в ⁶мотонейронов. Объединив эти инструменты с другими клоновых методы, как анализ мозаика с repressible маркер (MARCM)⁷,⁸стран СНГ MARCM или MARCMbow⁵, мы можем ограничить экспрессия гена GFP в субпопуляции МНБ фенотипического анализа аксонов проще. Мы породили протокол для того, чтобы держать ноги MN аксональное морфология нетронутыми для изображений и последующих 3D-реконструкции путем решения конкретных проблем, присущих взрослых дрозофилы ноги как (1) фиксация внутренних структур взрослых ноги не затрагивая аксона морфологии, эндогенного флуоресцентные выражение и мускулатура ноги, (2) монтаж ноги, чтобы сохранить общую структуру под coverslip и соответствующей ориентации для обработки для получения кутикулы изображений изображений и (3) фон, а также аксональное флуоресцентного сигнала. Хотя этот протокол был подробно для обнаружения флуоресцентные выражения в MN аксонов, он может применяться для визуализации другие компоненты ноги neuromusculature в членистоногих.

протокол

1. ноги диссекции и фиксация

1. Возьмите стеклянную пластину и несколькими хорошо и заполнить соответствующее количество скважин с 70% этиловом спирте. Добавить 15 – 20 CO₂-наркотизированных мух (и либо пола любого возраста) каждому хорошо и с помощью кисти, аккуратно промокните мух в этанола раствор до тех пор, пока летит полностью погружены.
   Примечание: Этот шаг заключается в удалении гидрофобность кутикулы. Не мойте для более чем 1 мин, потому что это увеличивает auto флуоресценции кутикулы.
2. Промывайте мух 3 раза с 0,3% раствором моющего средства неионогенных ПАВ в 1 x-фосфатный буфер (PBS). Мух в это решение, по крайней мере 10 минут.
   Примечание: Лучше ноги фиксируются при том числе моющее средство, которое может увеличить проникновение фиксатором внутри ногу.
3. Место несколько хорошо пластины на льду вместе с трубки параформальдегида 4% (PFA).
   Примечание: Подготовка свежие 4% PFA от 16% PFA этанола бесплатно Стоковый раствор имеет решающее значение.
4. Используйте пинцет, чтобы удалить головы и живота мух без повреждения грудной сегмент или ноги.
   Примечание: Удаление живота делает его легче держать лету и вскрыть ноги.
5. Вскрыть ноги от грудного сегмента с щипцами и поместите ноги в скважинах, содержащий 4% PFA. Для этого нажимаем мягко, но твердо на стыке coxa-грудной клетки, используя кончик тонкой щипцы, до тех пор, пока ноги отсоединяется.
6. Исправьте ноги в 4%, PFA на ночь при 4 ° C (всего около 20 h).
7. Мойте ноги с 0,3% раствором моющего средства неионогенных ПАВ в однократном ПБС, 5 x 20 мин.
8. Отмывающий буфер замените монтажа средних. Держите ноги в среде установки для по крайней мере за день до монтажа для его полного проникновения в ногу.
   Примечание: Если монтажа средних высоковязких, разбавляют монтажа средних 80% с ПБС потому, что при резком изменении вязкости может вызвать кутикулы, чтобы свернуть и ущерб общей структуры ногу. В зависимости от драйвера Gal4 мухи могут быть сохранены для 1-3 недель при 4 ° C в монтаж СМИ до монтажа.

2. нога монтажа

1. Место примерно 20 мкл 70% глицерина на левой стороне микроскопа и крышка с coverslip² квадратный 22 x 22 мм (рис. 2A, B). Пипетка около 10 мкл монтажа среды вдоль линии, параллельной и на небольшом расстоянии от правого края этой coverslip. Мкл еще 30 монтажа средних далее на правой стороне слайда (рис. 2 c).
   Примечание: При применении coverslip над ногами (см. ниже) монтажа средних будет мягко распространяться под coverslip и вокруг ноги без вытесняя их.
2. С помощью тонкой щипцы поднять ногу из раствора и осторожно положил его на носителе монтажа возле левой coverslip. Сделайте то же самое для каждой ноги и выровнять их сверху вниз (рис. 2D).
   1. Поднимите и передаче ноги в капле среднего между обоих советов щипцы. Ориент ноги двумя способами: внешняя сторона вверх или вниз.
3. После того, как все ноги (в возрасте до 6-8 ног может быть установлен) были надлежащим образом выровнены, положите второй coverslip над ноги, таким образом, что это coverslip лежит слегка на ранее размещенных coverslip (рисунок 2E) для пространства между coverslip и ткани и предотвратить ноги от получать поврежденные (рис. 2 g).
   Примечание: в качестве альтернативы, используйте наклейку скважин или ортодонтических воск для создания пространства между coverslip и слайд.
4. Используйте Лак для фиксации положение coverslips на каждом углу (Рисунок 2F).
   Примечание: Ткани теперь готов к изображению.

3. томография

1. Настройте один трек с использованием 488 нм лазер и два детекторы одновременно для получения GFP флуоресценции и кутикулы auto флуоресценции. С помощью элемента управления диапазона или ползунок Отображение в окне спектральный свет путь окна программного обеспечения, комплекс обнаружения один детектор (1) между 498-535 Нм и другое одно (детектор 2) между 566-652 Нм.
   Примечание: Как правило, детектор 1 должно быть Хаасп детектор и детектор 2 трубки фотоэлектронный умножитель. 498-535 канал оптимально обнаруживает сигнал GFP, но также обнаруживает флуоресценции авто от кутикулы. Однако 566 – 652 канал обнаруживает только auto флуоресценции от кутикулы (рис. 3A).
2. Используйте 20 X или 25 X нефти цель погружения, 1024 x 1024 пикселей, 12-бит глубины и задать интервал Z 1 µm. набор пикселей останавливаться время как около 1,58 МКС, а средняя 2 кадров/изображения. Использование задач с высокой числовая апертура.
3. Установите все остальные параметры, в зависимости от Конфокальный микроскоп и изображений используется.
   1. Убедитесь в том получить сигнал ярче кутикулы от 566 – 652 детектора, а не из 498-535 детектор. Для этого, используйте же мощность лазера 488-лазера для обоих детекторов. С помощью маркеров насыщения, сначала необходимо настройте усиление детектор 1 для получения достаточно яркий GFP сигнал (рис. 3B, D). Затем отрегулируйте усиление детектор 2 обеспечить, что некоторые районы с высоким кутикулы сигнала (края ног, суставов) производить насыщенный сигнала в этот детектор (рис. 3 c, E).
   2. Если нога расширенный и слишком большой для записи образа в одном кадре, используйте параметр плитки или позиции от Микроскоп визуализации программного обеспечения.
4. Реконструировать окончательного изображения, либо с помощью несвободных микроскопа изображений или с помощью freeware ImageJ/Фиджи (см. ниже).

4. пост обработки изображений

1. Откройте конфокальный стека в ImageJ/Фиджи.
   1. Использовать плагин Bioformats (плагины | Био форматы | Импортер Bio-formats) в Фиджи для открытия изображения, которые не являются в. Формат TIF от проприетарное программное обеспечение пакеты⁹изображений.
2. Разделение каналов, выбрав изображение | Цвет | Разделение каналов.
   Примечание: Если изображения с нескольких позиций были сделаны и должны быть recombined, используйте парные строчки плагин в Фиджи (плагины > колющие > Pairwise шить)^10,11.
3. Чтобы вычесть кутикулы сигнал от сигнала GFP, откройте изображение калькулятор (процесс | Изображения калькулятор): выберите стек от детектора 1 изображение 1 (GFP + кутикулы) (рис. 4A), в окне операции выберите вычестьи выберите стек от детектора 2 изображение 2 (кутикула) (рис. 4В). В результате только эндогенного GFP сигнал (ГПУП) получается (рис. 4 c).
   1. Снова объединить этот стек (ГПУП) с «только для кутикулы» стек, полученные от детектора 2 (рис. 4В изображение | Цвет | Объединить каналы) для получения изображения RGB, состоящий из ткани конкретных GFP сигнала, а также сигнал для кутикулы, который помогает выявлению аксон беседки в сегментах ноги (рис. 4 d).
   2. Отрегулируйте контраст и яркость каждого изображения (изображения | Отрегулируйте | Brightness/Contrast), а затем создать один RGB-изображения (изображения | Тип | Цвета RGB).
      Примечание: Для создания максимальной проекции Z-стека (изображения | Стеки | Проект Z...), Проекция максимальной интенсивности использования GFP сигнала и средней интенсивности для кутикулы, который затем может быть скорректирована для яркости до слияния двух каналов.
4. Альтернативно используйте макрос для автоматического вычитания и обработки изображений в ImageJ/Фиджи. Скопируйте текст дополнительного файла 1 в редакторе макросов (плагины | Новые | Макрос), сохранить макрос в папке плагинов и перезапустите ImageJ/Фиджи один раз, чтобы иметь возможность использовать макрос.
   1. Чтобы использовать макрос, откройте конфокальный стека и откройте окно яркость/контрастность (изображения | Отрегулируйте | Brightness/Contrast). Затем запустите макрос (плагин | Макрос | Запуск) и следуйте инструкциям.
   2. Когда его спросили, для указания операции (окно калькулятора изображения), выберите изображение 1 как стек 1 (КГВ), 2 изображения как стек 2 (кутикула) и вычитания.
      Примечание: Макрос создает образ максимальной проекции обработанного сигнала GFP (MAX_Result stack1), средняя проекция кутикулы (AVG_stack2), в результате вычитание стек кутикулы от GFP стека (результат stack1), а необработанные Кутикула стека (stack2).
   3. Когда попросили контраст, используйте элементы управления в окне регулировки яркости для регулировки яркости и контраста максимальной проекции изображения GFP и средняя проекция кутикулы, создания объединенного изображения RGB обоих сигналов, показаны GFP в зеленый и кутикулы серым цветом. Слияние в результате stack1 и stack2, аналогичным образом сформировать объединенные GFP и кутикулы стека, который может использоваться на следующем этапе.
5. Чтобы визуализировать ноги в трех измерениях, используйте специализированное программное обеспечение 3D с созданным стеков (Рисунок 4E).
   1. Откройте стек RGB с 3D программного обеспечения (см. Таблицу материалы). В всплывающем диалоговом окне выберите все каналы в разделе режим преобразования и введите размер вокселом (количество пикселей).
      Примечание: Вся необходимая информация содержится в файлах изображений из любых несвободных Микроскоп программного обеспечения используется.
   2. На канале 2 модуля (GFP сигнал), щелкните правой кнопкой мыши и выберите дисплей | volren. Затем щелкните левой кнопкой мыши на volren модуль. В разделе Свойства (слева внизу экрана) щелкните слева на редактирования и выберите volrengreen.col. На канале 1 модуль (кутикулы сигнал) щелкните правой кнопкой мыши и выберите дисплей | volren. Затем щелкните левой кнопкой мыши на volren модуль. В разделе Свойства левой кнопкой мыши на Дополнительно и выберите ddr (прозрачный дисплей рентгенограмме подобных) затем отрегулируйте значение гаммы для кутикулы фон (Рисунок 4E).
   3. Для создания 3D вращение, щелкните правой кнопкой мыши на модуле стека проекта. Затем выберите анимировать | повернуть. Щелкните левой кнопкой мыши на модуле поворот.
   4. В окне свойств щелкните на bbox центр. На модуле вращать правой кнопкой мыши и выберите вычислить | киностудии. На модуле киностудии нажмите левую кнопку мыши. В разделе Свойства щелкните левой на Advanced (вверху справа в разделе Свойства).
   5. В поле имя файла введите имя фильма вращения. В поле качество записи 1 (Макс качество). Оставить кадра на 200, по желанию 8.3 вращение s (это число может уменьшилось или увеличилось до изменения скорости вращения). Нажмите кнопку Применить (зеленая кнопка, внизу слева в разделе Свойства (см. видео 1)).

Результаты

Как показано на рисунке 4, эта процедура позволяет отличные снимки GFP-меченых аксоны в взрослых дрозофилы ноги, вместе с их терминала беседки. Главное чистый сигнал GFP получается без любого загрязнения от флуоресценции, испускаемых кутикулу ног. Си?...

Обсуждение

Кутикула взрослых дрозофилы и других членистоногих, который содержит много темные пигменты, является основным препятствием для просмотра структуры внутри своего тела. Кроме того это сильно авто люминесцентная, которая усугубляется фиксации. Эти две функции являются весьма проблемат?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI