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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons une méthode simple pour la quantification rapide de polyphosphate inorganique dans diverses bactéries, y compris les espèces Gram négatifs, bactéries gram-positives et mycobactériennes.

Résumé

Polyphosphate inorganique (polype) est un polymère biologique dans les cellules de tous les domaines de la vie et est exigé pour la virulence et la réponse au stress chez les nombreuses bactéries. Il existe une variété de méthodes de quantification polype en biomatériaux, dont beaucoup sont fastidieuses ou insensible, limitant leur utilité. Nous présentons ici une méthode simplifiée pour la quantification des polypes chez les bactéries, en utilisant une extraction de colonne silice membrane optimisée pour un traitement rapide de plusieurs échantillons, digestion du polype avec le polype spécifiques exopolyphosphatase ScPPX et la détection de la phosphate de libre qui en résulte avec un dosage colorimétrique sensible-à base d’acide ascorbique. Cette procédure est simple, peu coûteux et permet la quantification fiable polype dans diverses espèces de bactéries. Nous présentons la quantification de polype représentatifs de la bactérie à gram négatif (Escherichia coli), la bactérie Gram-positive lactiques (Lactobacillus reuteri) et les espèces de mycobactéries (Mycobacterium smegmatis). Nous incluons également un protocole simple pour la purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX, qui n’est pas actuellement disponible dans le commerce.

Introduction

Polyphosphate inorganique (polype) est un biopolymère linéaire d’unités de phosphate lié à phosphoanhydride que l'on retrouve dans tous les domaines de la vie1,2,3. Diverses bactéries, polype est essentiel pour la réponse au stress, motilité, la formation de biofilm, contrôle du cycle cellulaire, la résistance aux antibiotique et virulence4,5,6,7,8 ,9,10,11. Études du polype métabolisme chez les bactéries ont donc la possibilité de déboucher sur des connaissances fondamentales sur la capacité des bactéries causent la maladie et se développent dans divers environnements. Dans de nombreux cas, toutefois, les méthodes permettant de quantifier polype dans les cellules bactériennes sont un facteur limitant dans ces études.

Il y a plusieurs méthodes actuellement utilisées pour mesurer les niveaux de polype en matières biologiques. Ces méthodes impliquent généralement deux étapes distinctes : extraction de polype et quantifier le polype présent dans ces extraits. La méthode actuelle de l’étalon-or, développé pour la levure Saccharomyces cerevisiae par Bru et ses collègues12, polype extraits ainsi que l’ADN et l’ARN à l’aide de phénol et de chloroforme, suivie par précipitation à l’éthanol, le traitement par désoxyribonucléase (DNase) et ribonucléase (RNase) et la digestion du polype purifiée obtenue avec le S. cerevisiae dégradant le polype enzyme exopolyphosphatase (ScPPX)13 à céder gratuitement phosphate, qui est ensuite quantifié à l’aide une Malachite verte essai reposant sur la colorimétrie. Cette procédure est très quantitative, mais fastidieux, limitant le nombre d’échantillons qui peuvent être traitées dans une expérience simple, n’est pas optimisé pour les échantillons bactériens. D’autres ont rapporté extraction polype d’une variété de cellules et de tissus à l’aide de perles de silice (« glassmilk ») ou silice membrane colonnes6,14,15,16,17, 18. Ces méthodes ne retirer pas efficacement à chaîne courte polype (moins de 60 unités de phosphate)12,14,15, bien que cela soit moins préoccupante pour les bactéries, qui sont généralement réputés pour synthétiser principalement polype de longue chaîne3. Anciennes méthodes d’extraction de polype à l’aide d’acides forts19,20 sont n’est plus largement utilisés, étant donné que le polype est instable sous conditions acides12.

Il existe également une variété de méthodes déclarées pour quantifier polype. Parmi les plus courantes est 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), un colorant fluorescent plus généralement utilisé pour colorer les ADN. DAPI-polype complexes ont des maxima d’excitation et d’émission de fluorescence différente que DAPI-ADN complexes21,22, mais il y a beaucoup d’autres composants cellulaires, y compris les ARN, nucléotides et inositol phosphates12,15,16,23, réduisant la spécificité et la sensibilité des mesures de polype effectuées à l’aide de cette méthode. Alternativement, les polypes et adénosine diphosphate (ADP) peuvent être convertis en adénosine triphosphate (ATP) à l’aide de purifiée Escherichia coli kinase polype (PPK) et l’ATP qui en résulte, quantifiée à l’aide de la luciférase14,17 ,,18. Cela permet la détection de très petites quantités de polype, mais nécessite deux étapes de la réaction enzymatique et luciférine et ADP très pure, qui sont des réactifs coûteux. ScPPX spécifiquement digestions polype en phosphate libre6,12,13,24, qui peut être détectée par des méthodes plus simples, mais ScPPX est inhibée par l’ADN et l’ARN12, nécessitant un traitement DNase et RNase polype contenant des extraits. PPK ni ScPPX sont disponibles dans le commerce, et purification de PPK est relativement complexe25,26.

Polype dans les lysats cellulaires ou des extraits aussi peut être visualisée sur gel de polyacrylamide par DAPI27,28,29,30, une méthode qui permet l’évaluation de la longueur de la chaîne, mais est une coloration négatif bas-débit et mal quantitative.

Nous rapportons un dosage de polype moyen débit, peu coûteux et rapide qui permet la quantification rapide de polype niveaux chez diverses espèces bactériennes. Cette méthode commence par la lyse des cellules bactériennes à 95 ° C en 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 pour inactiver des phosphatases cellulaires, suivies d’une extraction de colonne silice membrane optimisée pour le traitement rapide des échantillons multiples. L’extrait contenant du polype qui en résulte est ensuite digéré avec un grand excès de ScPPX, éliminant le besoin de traitement DNase et RNase. Nous incluons un protocole pour simple purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX. Enfin, phosphate libre dérivé de polype est quantifié avec un dosage colorimétrique simple, sensible, à base d’acide ascorbique24 et normalisée à total des protéines cellulaires. Cette méthode simplifie la mesure de polype dans des cellules bactériennes, et nous montrer son utilisation avec des espèces représentatives des bactéries à gram négatif, bactéries gram-positives et mycobactéries.

Protocole

1. purification de levure Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Transformer la souche de la surexpression de protéines Escherichia coli BL21 (de3)31 avec le plasmide pScPPX26 par électroporation32 ou33de la transformation chimique.
  2. Ensemencer 1 L de bouillon de lysogénie (LB) contenant 100 µg, ampicilline des-1 mL dans une fiole débafflé 2 L avec une seule colonie de BL21 (de3) contenant pScPPX2 et incuber une nuit à 37 ° C, sans agitation, à une absorbance à 600 nm (une600) d’environ 0,3, tel que mesuré dans un spectrophotomètre.
  3. Commencer la culture secouant (180 tr/min) et incuber 30 min à 37 ° C, au cours de laquelle les cellules passera à un A600 de 0,4 - 0,5.
  4. Ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et le des 100 µg mL-1 ampicilline, puis incuber pendant 4 h à 37 ° C sous agitation à 180 tr/min.
    Remarque : Ce protocole surexpression génère une grande quantité de ScPPX soluble. Toutefois, la surexpression de ScPPX est très indulgente, et une variété d’autres protocoles de la surexpression de protéines communes ont été utilisés pour purifier avec succès ScPPX.
  5. Transférer les cellules dans une bouteille de centrifugeuse de 1 L et leur capture par centrifugation pendant 20 min à 5 000 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant et le culot de transfert à un tube conique de 50 mL.
    Remarque : Boulettes de cellule peuvent être stockés indéfiniment à-80 ° C.
  6. Décongeler le culot sur la glace, puis il resuspendre dans 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl et imidazole de 5 mM (pH 8) pour un volume total d’environ 10 mL.
  7. Ajouter (concentration finale) 1 mg mL-1 lysozyme, 2 mM MgCl2et 50 unités mL-1 d’une endonucléase ADN-dégradant le RNA et (voir Table des matières) et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
    Remarque : ScPPX lie les acides nucléiques (données non présentées), traitement de nucléase est donc essentiel au cours de la purification.
  8. En utilisant un sonicateur avec un microtip (voir Table des matières), lyse des cellules de 2 cycles de sonication sur glace à 50 % de puissance, impulsions 5 s sur et 5 s, avec un 2 min de repos entre les cycles.
    Remarque : Utiliser une protection auditive appropriée au cours de la sonication. De la même façon à l’affaire avec surexpression, une variété de méthodes de lyse cellulaire sont acceptables pour la purification de ScPPX.
  9. Enlever les débris insoluble en CENTRIFUGEANT le lysat pendant 20 min à 20 000 x g à 4 ° C. Filtrer le liquide surnageant obtenu (environ 10 mL) à travers un filtre de seringue 0,8 µm pore taille acétate de cellulose.
  10. Charger le lysat sur un colonne de chélation nickel-chargé de 5 mL (voir Table des matières) à l’aide d’une pompe péristaltique ou une grande seringue.
  11. Rincer la colonne avec 50 mL d’imidazole de 5 mM 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl (pH 8).
  12. Rincer la colonne avec 50 mL d’imidazole de 20 mM 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl (pH 8).
  13. Éluer ScPPX avec 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl et 0,5 M imidazole (pH 8), collecteurs 15 fractions de 1 mL. Tester ces fractions d’élution pour la teneur en protéines avec la Bradford protéine test34 (voir Table des matières) et exécutez un de gel SDS-PAGE35 pour confirmer les fractions contiennent ScPPX purifié (poids moléculaire = 45 kDa).
  14. Mettre en commun les fractions contenant ScPPX pure et ajuster la concentration de la protéine mise en commun d’environ 2 mg mL-1 avec 50 mM HEPES et 0,5 M de NaCl. Des concentrations plus élevées de protéines peuvent précipiter dans l’étape suivante.
  15. Échanger le ScPPX purifiée dans le tampon de stockage (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, glycérol à 10 % [v/v]) par la dialyse. Placer des fractions de ScPPX mise en commun dans une longueur scellée de 12 000-14 000 Da poids moléculaire limite dialyse membrane tube (voir Table des matières) et mettre en suspension dans 1 L de stockage tampon avec agitation continue à 4 ° C pendant au moins 4 h. Répétez cette étape avec frais tampon de stockage pour un total de 3 changements de tampon.
  16. Transférer la protéine purifiée, dialysée dans un tube à centrifuger ou tubes et centrifuger pendant 20 min à 20 000 x g à 4 ° C pour éliminer n’importe quel agrégat insolubles. Transvaser avec soin le surnageant dans un tube conique propre de 15 mL.
  17. Ajuster la concentration de le ScPPX purifié à mg 1 mL-1 avec le tampon de stockage, ajouter 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine exempt de protéase (BSA ; concentration finale) et magasin pendant 6 mois à 4 ° C.
    Remarque : ScPPX perd plus de 90 % de son activité lorsqu’il est congelé13.

2. récolte des échantillons pour l’Extraction de Polyphosphate

  1. Cultiver des bactéries dans les conditions d’intérêt pour le dosage du polype. Pour ce protocole, poussent de Lactobacillus reuteri36 pendant une nuit à 37 ° C sans trembler dans l’enzyme malique induction (MEI) moyen37 sans cystéine (MEI-C).
  2. Récolter suffisamment de cellules par centrifugation dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour un total de 50 à 100 µg de protéines cellulaires (voir étape 3 ci-dessous). Pour e. coli, c’est 1 mL d’une culture en phase log à un A600 de 0,2 - 0,4. Il s’agit de L. reuteri, 1 mL d’une culture d’une nuit ou plus. Ajuster au besoin pour d’autres espèces d’intérêt.
  3. Enlevez complètement le surnageant des granules cellulaires.
  4. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 250 µL de tampon de lyse GITC (4 M guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) et lyse par incubation à 95 ° C pendant 10 min. de lysats de magasin à-80 ° C.
    NOTE : Être cohérent avec le temps de lyse, puisque l’incubation prolongée à haute température peut entraîner une dégradation du polype par hydrolyse,38. Lysats peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C.
    Attention : Isothiocyanate de Guanidine est un sel de chaotropes et devrait être manipulé avec des gants et éliminé comme déchets dangereux.

3. mesurer la teneur en protéines de lysats cellulaires

  1. Élaborer des normes de BSA contenant 0, 0,1, 0,2 et 0,4 mg mL-1 de BSA dans le tampon de lyse GITC.
    Remarque : Il est important de faire les normes BSA dans GITC, puisque GITC influe sur le développement de la couleur de l’analyse de Bradford. Normes de BSA peuvent être conservés indéfiniment à-20 ° C.
  2. Aliquote 5 µL de lysats cellulaires décongelés, homogènes et des normes de BSA à différents puits dans une plaque à 96 puits clair.
  3. Ajouter 195 µL de réactif de Bradford34 dans chaque puits et mesurer l’absorbance à 595 nm (un595) dans un lecteur de plaque (voir Table des matières).
  4. Calculer la quantité de protéines dans chaque puits par rapport à la courbe d’étalonnage de BSA, à l’aide de la formule y = mx + b, où y est un595, x est µg de BSA, m est la pente de la courbe d’étalonnage, et b est l’ordonnée à l’origine de la courbe standard. Multipliez la valeur obtenue par 0,05 pour déterminer le total mg de protéine dans chaque échantillon.

4. extraction des polyphosphates

  1. Ajouter 250 µL d’éthanol à 95 % à chaque échantillon GITC-lysées et vortex pour mélanger.
  2. Appliquer ce mélange sur une colonne de silice membrane spin et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
  3. Jeter le cheminement, puis ajoutez 750 µL de 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 % d’éthanol et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
  4. Jeter le cheminement et centrifuger pendant 2 min à 16 100 x g.
  5. Placer la colonne dans un tube à centrifuger propre 1,5 mL et ajouter 150 µL de 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis éluer le polype par centrifugation pendant 2 min à 8 000 x g.
    Remarque : Si vous le souhaitez, les éluats peuvent être stockés à-20 ° C pendant au moins 1 semaine.

5. digérer Polyphosphate

  1. Élaborer des normes contenant 0, 5, 50 ou phosphate de potassium 200 µM au 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Remarque : Les normes de phosphate de Potassium peuvent être stockés indéfiniment à la température ambiante.
  2. Aliquotes de 100 µL de chaque norme de phosphate et d’extraites des échantillons de polype dans puits séparés d’une plaque 96 puits clair.
  3. Préparer un mélange maître contenant (par exemple) : 30 µL de 5 x ScPPX réaction tampon (25 mM MgCl2, acétate d’ammonium 250 mM, 100 mM Tris-HCl, pH 7,5)13et 19 µL d’H2O 1 µL de ScPPX purifié (mg 1 mL-1).
  4. Ajouter 50 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Incuber pendant 15 min à 37 ° C.
    Remarque : Si vous le souhaitez, les polype digérées échantillons peuvent être conservés à-20 ° C indéfiniment.

6. détection de Phosphate libre24

  1. Préparer la solution de détection des base en dissolvant 0,185 g antimoine de tartrate de potassium dans 200 mL d’eau, ajouter 150 mL de 4 N H2SO4, puis en ajoutant 1,49 g d’heptamolybdate d’ammonium. Remuer pour dissoudre, puis l’outil pour un volume final de 456 mL. Filtrer la solution pour enlever les particules et les stocker abri de la lumière à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  2. Préparer une solution d’acide ascorbique 1 M. Boutique abri de la lumière à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  3. Préparation d’un stock de travail frais de solution de détection chaque jour en mélangeant 9,12 mL de solution de détection base 0,88 ml d’acide ascorbique 1 M. Laisser la solution de détection à venir à température ambiante avant utilisation.
  4. Ajouter 50 µL de solution de détection pour chaque échantillon et de la norme dans la plaque à 96 puits et incuber à température ambiante pendant environ 2 min permettre le développement de la couleur.
  5. Mesurer l’absorbance à 882 nm avec un lecteur de plaque et calculer la concentration de phosphate de l’échantillon par rapport à la courbe standard de phosphate de potassium.
    Attention : La solution de détection contient des sels toxiques et acides forts. Porter des gants et traiter l’excédent de solution comme un déchet toxique.

7. on calcule le contenu cellulaire Polyphosphate

  1. Convertir les concentrations de phosphate, déterminées à l’étape 6.5 nanomoles de polype dérivés de phosphate dans chaque cellule entière lysat selon la formule suivante :
    polype nmol = 1,5 x (phosphate µM / 10)
    Remarque : La méthode basée sur des courbes standard à l’étape 6 détermine la concentration de phosphate (en µM) dans chaque échantillon de polype 100 µL aliquotés à l’étape 5.2. Pour convertir cette concentration à un certain nombre de nmol, 100 µL est divisé par 106 pour obtenir un volume en L, multiplié par la concentration (µmol L-1), puis multiplié par 1 000 (le nombre de nmol dans un µmol). Cela réduit à divisant la concentration par 10. Le volume total extrait préparé à l’étape 4 est 150 µL, il est donc nécessaire de multiplier la valeur obtenue par 1,5 pour calculer la nmol de phosphate présent dans l’extrait entier.
  2. Normaliser le contenu cellulaire polype de protéines cellulaires totales en divisant le polype nmol par mg de protéine totale dans chaque échantillon déterminé à l’étape 3.4. Polype niveaux sont exprimés en fonction de la concentration d’individuel phosphate libre dérivé de polype.
    Remarque : Dans certains cas, la quantité de dérivés de polype phosphate présent dans un échantillon peut tomber à l’extérieur de la gamme de linéarité de la courbe standard de phosphate (étape 6.5). Si les niveaux de polype sont très élevés, l’éluat contenant du polype excédentaire de l’étape 4.6 peut être dilué 01:10 ou au 1/100, au besoin et ensuite mesuré à nouveau comme décrit aux étapes 5 à 7.

Résultats

Les étapes clés du protocole sont schématisés sous une forme simplifiée de la Figure 1.

Pour illustrer l’utilisation de ce protocole avec des bactéries gram-négatives, sauvage, e. coli MG165539 a été passé à la phase logarithmique en milieu riche LB à 37 ° C sous agitation (200 tr/min), puis rincé et incubées pendant 2 h supplémentaires dans morphol...

Discussion

Le protocole décrit ici simplifie et accélère la quantification des niveaux de polype dans diverses bactéries, avec un ensemble typique de 24 échantillons prenant environ 1,5 h à traiter entièrement. Cela permet le dépistage rapide des échantillons et l’analyse des bibliothèques mutantes et simplifie les expériences cinétiques mesurant l’accumulation de polype au fil du temps. Nous avons démontré que le protocole fonctionne efficacement sur les représentants de trois différents phyla : proteobacteria...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce projet a été soutenu par l’Université de l’Alabama au fonds de démarrage de Birmingham département de microbiologie et NIH grant R35GM124590 (à MJG) et NIH subvention R01AI121364 (FW).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmid pScPPX2Addgene112877available to academic and other non-profit institutions
LB brothFisher ScientificBP1427-2E. coli growth medium
ampicillinFisher ScientificBP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
HEPES bufferGold BiotechnologyH-400-1
potassium hydroxide (KOH)Fisher ScientificP250500for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazoleFisher ScientificO3196500
lysozymeFisher ScientificAAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP columnGE Life Sciences17040901any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrateFisher ScientificAC415611000for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filtersFisher Scientific09-302-168
Bradford reagentBio-Rad5000205
Tris bufferFisher ScientificBP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Bother dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144-212for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl)Fisher ScientificP217500
glycerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS medium mixtureTeknovaM2101E. coli growth medium
glucoseFisher ScientificD161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
dehydrated yeast extractFisher ScientificDF0886-17-0
tryptoneFisher ScientificBP1421-500
magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificM63-50
manganese sulfate monohydrateFisher ScientificM113-500
guanidine isothiocyanateFisher ScientificBP221-250
bovine serum albumin (protease-free)Fisher ScientificBP9703100
clear flat bottom 96-well platesSigma-AldrichM0812-100EAany clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate readerTecan, Inc.not applicableany plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanolFisher Scientific04-355-451
silica membrane spin columnsEpoch Life Science1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1.5 mL microfuge tubesFisher ScientificNC9580154
ammonium acetateFisher ScientificA637-500
antimony potassium tartrateFisher ScientificAAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
ammonium heptamolybdateFisher ScientificAAA1376630
ascorbic acidFisher ScientificAC401471000

Références

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