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요약

그람 양성, 그람 음성, mycobacterial 종 등 다양 한 박테리아에 무기 polyphosphate의 급속 한 정량화를 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

초록

무기 polyphosphate (폴립) 셀 생활의 모든 도메인에 있는 생물학 고분자 이며 독성 및 많은 박테리아에 스트레스 반응. 많은 노동 집약 하거나 구분 하지 않습니다, 그들의 유용성을 제한 하는 생물 자료에 측량 용 종에 대 한 방법의 다양 한이 있다. 선물이 여기 박테리아, 부 량 폴립에 대 한 효율적인된 방안을 여러 샘플, 폴립 전용 exopolyphosphatase ScPPX와 폴립의 소화 및 감지의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 사용 하는 결과 민감한 ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과 함께 무료 인산 염. 이 절차 간단, 저렴, 이며 다양 한 세균성 종에 신뢰할 수 있는 폴립 정량화를 수 있습니다. 그램 음성 박테리아 (대장균), 그람 양성 젖 산 박테리아 (유산 균 reuteri), 및 mycobacterial 종 (진 균 smegmatis)에서 대표적인 폴립 정량화 선물이. 우리는 또한 어떤은 현재 상업적으로 사용할 수 밀리 그램 양의 ScPPX, 니켈 친 화력 정화에 대 한 간단한 프로토콜 포함.

서문

무기 polyphosphate (폴립)은 인생1,2,3의 모든 도메인에 있는 phosphoanhydride 연결 인산 염 단위의 선형 biopolymer 이다. 다양 한 박테리아에서 폴립 스트레스 반응, 운동 성, biofilm 형성, 세포 주기 제어, 항생제 내성, 및 독성4,,56,7,8이 필수적입니다. ,9,,1011. 박테리아 물질 대사 폴립의 연구는 따라서 질병의 원인이 다양 한 환경에서 번 창 하는 박테리아의 기능에 대 한 근본적인 통찰력을 얻을 수가 있다. 그러나 많은 경우에,, 세균성 세포 측정 폴립에 대 한 사용할 수 있는 방법 이러한 연구에 제한 요인이 있습니다.

현재 생물학 물자에서 폴립 수준을 측정 하는 데 사용 하는 여러 방법이 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 두 가지 단계를 포함: 폴립을 추출 하 고는 폴립 측정 그 추출 물에 존재. Bru와 동료12, DNA 및 RNA 페 놀을 사용 하 여 추출 폴립 효 모 Saccharomyces cerevisiae 에 대 한 개발 현재 골드 표준 방법 및 클로 프롬, 에탄올 강수량, 치료 뒤 deoxyribonuclease (DNase) 및 ribonuclease (RNase), 그리고는 S. cerevisiae 폴립 저하 효소 exopolyphosphatase (ScPPX)13 를 사용 하 여 계량 다음은 자유로운 인산 염, 결과 순화 된 폴립의 소화는 말라 카이트 그린 기반 색도계 분석 결과입니다. 이 절차는 매우 양적 하지만 단일 실험에서 처리할 수 있는 세균성 샘플에 대 한 최적화 되지 않은 샘플의 수를 제한 하는 노동 집약. 다른 다양 한 세포와 실리 카 비즈 (이 하 "glassmilk") 또는 실리 카 막 열6,14,15,,1617를 사용 하 여 조직에서에서 폴립을 추출 보고 있다 18. 이 방법을 할 효율적으로 추출 하지 짧은 체인 폴립 (60 인산 염 단위)12,,1415, 비록이 일반적으로 생각 되 고 주로 합성 박테리아에 대 한 더 적은 관심 긴 체인 용 종3. 강한 산19,20 를 사용 하 여 폴립 추출의 이전 방법 더 이상 널리 사용 폴립12산 성 조건 안정 되어 있기 때문.

또한 측정 폴립에 대 한 보고 방법의 다양 한이 있다. 가장 일반적인 가운데 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 더 일반적으로 DNA를 얼룩 사용 형광 성 염료 이다. DAPI 폴립 단지 DAPI DNA 단지21,22, 보다 다른 형광 여기 및 방출 맥시 마 하지만 상당한 간섭 RNA, 뉴클레오티드, 이노 시 톨 등 다른 세포질 분 대에서 인산 염12,15,,1623, 특이성 및이 메서드를 사용 하 여 만든 폴립 측정의 감도 감소. 폴립과 아데노신 diphosphate (ADP)를 아데노신 3 인산 염 (ATP) 사용 하 여 순화 된 대장균 으로 변환할 수 또는 폴립 키 (ppk 모델)와 luciferase14,17 사용 하 여 계량 결과 ATP ,18. 이 매우 적은 양의 폴립, 탐지를 허용 하지만 두 효소 반응 단계와 소와 매우 순수한 ADP, 비싼 시 약입니다. ScPPX로 특별히 다이제스트 폴립 무료 인산 염6,12,13,24, 간단 방법, 하지만 ScPPX을 사용 하 여 감지 될 수 있는 DNA와 RNA12, 저해 포함 하는 폴립의 필요로 DNase 및 RNase 처리를 추출합니다. Ppk 모델도 ScPPX 상업적으로 사용할 수 있으며 ppk 권총 정화는 상대적으로 복잡 한25,26.

있으 나 세포 lysates 또는 추출에 폴립 DAPI 부정적인 얼룩27,,2829,30, 체인 길이의 평가 허용지 않습니다 하지만 하는 방법에 의해 polyacrylamide 젤에도 구상 될 수 있다 낮은 처리량 그리고 저조한 양적.

우리는 이제 다양 한 세균성 종의 수준 폴립의 급속 한 정량화를 허용 하는 빠르고, 저렴 한, 중간 처리량 폴립 분석 결과 보고 합니다. 이 메서드는 셀룰러 가수분해, 여러 샘플의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 다음 비활성화를 4m guanidine isothiocyanate (GITC)14 에서 95 ° C에서 세균성 세포를 lysing 여 시작 합니다. 결과 폴립 포함 된 추출 다음 DNase 및 RNase 처리를 위한 필요를 제거 하는 ScPPX의 큰 과잉을 가진 소화 된다. 우리는 ScPPX 밀리 그램 양의 간단 니켈 친 화력 정화에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 마지막으로, 무료 인산 폴립 파생 된 간단 하 고, 민감한, ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과24 정량 이며 총 세포질 단백질에 정규화. 이 메서드 세균성 세포에 폴립의 측정을 간소화 하 고 우리 그람 음성 세균, 그람 양성 세균 및 mycobacteria의 대표 종으로 그것의 사용을 보여 줍니다.

프로토콜

1. 정화 효 모 Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. 대장균 단백질 overexpression 스트레인 플라스 미드 pScPPX26 BL21(DE3)31 electroporation32 또는33화학 변환 의해 변환.
  2. Lysogeny 국물 (파운드) 100 µ g mL-1 암 피 실린 포함 하는 pScPPX2 BL21(DE3)의 단일 식민지와 2 L unbaffled 플라스 크에 포함 된의 1 L를 접종 하 고 하룻밤 없이 떨고, 600에서 흡 광도를 37 ° C에서 품 어 nm (600)의 약 0.3, 한 분 광 광도 계에서 측정 된
  3. (180 rpm)를 동요 하는 문화를 시작 하 고 어느 시간 동안 셀 A600 0.4-의 성장 37 ° C에서 30 분 동안 품 어 0.5.
  4. 1mm 및는 추가 100 µ g mL-1 암 피 실린의 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가한 다음 180 rpm에서 떨고와 37 ℃에서 4 h에 대 한 품 어.
    참고:이 overexpression 프로토콜 녹는 ScPPX의 큰 금액을 생성합니다. 그러나, ScPPX overexpression은 아주 용 서, 그리고 다양 한 다른 일반적인 단백질 overexpression 프로토콜 성공적으로 ScPPX 정화에 사용 되었습니다.
  5. 1 L 원심 분리기 병 셀 전송 및 4 ° c.에 5000 x g에서 20 분 동안 centrifuging 여 수확 상쾌한을 제거 하 고 셀 펠 렛 50 mL 원뿔 튜브에 전송.
    참고: 셀 펠 릿에 저장 될 수 무기한-80 ° c.
  6. 얼음에 펠 릿을 녹여 다음 50 mm HEPES 9 mL, 0.5 M NaCl 및 5mm 이미 (pH 8) 약 10 ml 전체 볼륨에 대 한 resuspend.
  7. (최종 농도) 1 mg mL-1 lysozyme, 2 mM MgCl2및 RNA 및 DNA 저하 endonuclease의 50 단위 mL-1 추가 ( 재료의 표참조)와 얼음에 30 분 동안 품 어.
    참고: ScPPX 묶는 핵 산 (데이터 표시 되지 않음), 그래서 nuclease 치료 정화 동안 필수적 이다.
  8. sonicator는 microtip 사용 ( 재료의 표참조), 50% 전력, 펄스 5에서 얼음에 쥡니다의 2 주기에 의해 세포를 lyse s 주기 사이 2 분 나머지와 함께, 및 5 s.
    참고: 적절 한 청력 보호 쥡니다 동안 사용 합니다. 마찬가지로 overexpression의 경우, 세포 세포의 용 해 방법의 다양 한 ScPPX 정화에 대 한 사용할 수 있습니다.
  9. 20000 x g 4 ° c.에 20 분에 대 한 lysate centrifuging 여 불용 성 파편을 제거 0.8 µ m 기 공 크기 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터를 통해 결과 상쾌한 (약 10ml)를 필터링 합니다.
  10. 킬레이트 화 열 니켈 충전 5 mL에 lysate 로드 ( 재료의 표참조) 연동 펌프 또는 큰 주사기를 사용 하 여.
  11. 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5mm 이미 (pH 8)의 열을 씻어.
  12. 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20mm 이미 (pH 8)의 열을 씻어.
  13. ScPPX 50 mm HEPES, 0.5 M NaCl, 그리고 0.5 M 이미 (pH 8) 수집 15 1 mL 분수 elute. 테스트 콘텐츠 Bradford 단백질 분석 결과34 와 단백질에 대 한 이러한 차입 분수 ( 재료의 표참조) SDS 페이지 젤35 는 분수 포함 순화 ScPPX 확인을 실행 하 고 (분자량 = 45 kDa).
  14. 순수한 ScPPX를 포함 하는 분수를 풀 고 50 mm HEPES 약 2 mg mL-1 을 0.5 M NaCl 풀링된 단백질의 농도 조정 합니다. 높은 단백질 농도 다음 단계에서 침전 수 있습니다.
  15. 투 석 정화 ScPPX 저장소 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5], 50 m m KCl, 10% [v] 글리세롤)으로 교환 합니다. 12000-14000 다 분자량 컷오프 투 석 막 튜브 ( 재료의 표참조)의 봉인된 길이에 풀링된 ScPPX 분수를 놓고 연속 교 반 4 ° C에서 최소한 4 h. 신선한와 함께이 단계를 반복 하는 동안 저장소 버퍼의 1 L에 일시 중단 3 버퍼 변경의 총 저장소 버퍼입니다.
  16. 원심 분리기 튜브 또는 튜브와 모든 불용 성 집계 제거 하 4 ° C에서 20000 x g에서 20 분 동안 원심 분리기를 순화, dialyzed 단백질을 전송 합니다. 조심 스럽게 깨끗 한 15 mL 원뿔 튜브는 상쾌한 전송.
  17. 1 mg mL-1 저장 버퍼를 순화 ScPPX의 농도 조정, 0.1% (w/v) 추가 protease 무료 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 최종 농도), 및 4 ° c.에서 최대 6 개월까지 저장
    참고: ScPPX 때 냉동된13에 그것의 활동의 90% 이상 잃는다.

2. Polyphosphate 추출에 대 한 샘플 채취

  1. 폴립 콘텐츠 결정에 대 한 관심의 조건 하에서 박테리아 성장. 이 프로토콜에 대 한 유산 균 reuteri36 37 ° C에서 하룻밤 malic 효소 유도 (메이) 중간37 시스테인 (메이-C) 없이 떨고 없이 성장 합니다.
  2. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 총 세포질 단백질의 50-100 µ g를 원심 분리 하 여 충분 한 세포를 수확 (3 단계 참조). 대장균이 0.2-A600 에서 로그 단계 문화 1 mL는 0.4. L. reuteri, 하룻밤 문화의 1 mL입니다. 관심의 다른 종에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.
  3. 셀 펠 릿에서는 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
  4. GITC 세포의 용 해 버퍼 (4m guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris HCl, pH 7)의 250 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend와 10 분-80 ° c.에 게 lysates 95 ° C에 외피에 의해 lyse
    참고: 수 세포의 용 해 시간, 일치 때문에 고온에서 장시간된 보육 가수분해38에 의해 폴립의 저하에서 될 수 있습니다. Lysates-80 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있다
    주의: Guanidine isothiocyanate chaotropic 소금 및 장갑 처리와 있어야 유해 폐기물로 폐기 합니다.

3. 세포 Lysates의 단백질 함량을 측정

  1. BSA 기준 0, 0.1, 0.2, 그리고 GITC 세포의 용 해 버퍼에 BSA의 0.4 mg mL-1 을 준비 합니다.
    참고: GITC 색상 개발 Bradford 분석 실험의 영향 때문에 GITC, BSA 기준 수 있도록 중요 하다. BSA 기준-20 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있다
  2. Aliquot 5 µ L, 잘 혼합 해 동 세포 lysates의와 명확한 96 잘 접시에 우물을 BSA 기준의.
  3. 각 잘을 Bradford 시 약34 의 195 µ L을 추가 하 고 595에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에서 nm (595) ( 재료의 표참조).
  4. 수식 y를 사용 하 여 BSA 표준 곡선을 비교 하 여 각 우물에서 단백질의 양을 계산 = mx + b, 어디 y는595x는 BSA의 µ g, m은 표준 곡선의 기울기 이며, b는 표준 곡선의 y 절편. 0.05 각 샘플에 있는 단백질의 총 mg를 결정 하 여 결과 값을 곱하면 됩니다.

4. 추출 Polyphosphate

  1. 각 GITC lysed 샘플 및 혼합 소용돌이를 95% 에탄올의 250 µ L를 추가 합니다.
  2. 실리 카 막 스핀 열 및 30에 대 한 원심 분리기에 그 혼합 적용 16,100 x g에서 s.
  3. 흐름을 통해 삭제 후 추가 750 µ L 5 mM Tris HCl의 (pH 7.5), 50 m m NaCl, 5 mM EDTA, 50% 에탄올과 30 대 분리기 16,100 x g에서 s.
  4. 흐름을 통해 및 16,100 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 삭제 합니다.
  5. 깨끗 한 1.5 mL microfuge 관에서 열을 놓고 50 mM Tris HCl (pH 8)의 150 µ L를 추가 합니다.
  6. 5 분 동안 실내 온도에 incubate 다음 8000 x g에서 2 분 동안 centrifuging 여 폴립을 elute.
    참고: 원하는 경우는 있다 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 1 주 동안.

5. 소화 Polyphosphate

  1. 0, 5, 50, 또는 50 mm Tris HCl (pH 8) 200 µ M 칼륨 인산 염을 포함 하는 표준 준비.
    참고: 칼륨 인산 염 표준 실 온에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.
  2. Aliquot 100 µ L 각 인산 염 표준의 명확한 96 잘 접시의 별도 우물으로 폴립 샘플을 추출.
  3. (샘플) 당 포함 하는 마스터 믹스 준비: 5 x ScPPX 반응 버퍼 (100 mM Tris HCl, 25 m m MgCl2, 250 m m 염화 아세테이트, pH 7.5)1330 µ L, H2O, 19 µ L 및 순화 된 ScPPX (1 mg mL-1)의 1 µ L.
  4. 96 잘 접시의 각 음을 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 15 분 동안 품 어
    참고: 원하는 경우, 소화 용 종 샘플 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.

6. 검색 무료 인산24

  1. 그래서 4 N H2의 150 mL을 추가 물 200 mL에 안티모니 칼륨 주석산의 0.185 g을 용 해 하 여 탐지 솔루션 기본 준비4, 암모늄 heptamolybdate의 1.49 g 추가. 해산 하 고 그 후 456 mL의 최종 볼륨을가지고 저 어. 최대 1 개월 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 솔루션 입자를 제거 하 고 저장을 필터링 합니다.
  2. 1 M 의약품의 재고 솔루션을 준비 합니다. 상점 최대 1 개월 4 ° C에서 빛 으로부터 보호.
  3. 매일 1 M 의약품의 0.88 mL와 탐지 솔루션 베이스의 9.12 mL를 혼합 하 여 탐지 솔루션의 신선한 작업 재고를 준비 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도에 서 검색 솔루션을 수 있습니다.
  4. 각 샘플을 표준 96 잘 접시에 탐지 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 색상 개발을 허용 하도록 약 2 분 동안 실 온에서 품 어.
  5. 882에서 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm 칼륨 인산 염 표준 곡선을 비교 하 여 각 샘플의 인산 염 농도 계산 하 고.
    주의: 탐지 솔루션 독성 염 및 강한 산을 포함 한다. 장갑을 착용 하 고 독성 폐기물 초과 솔루션 취급.

7. 계산 셀룰러 Polyphosphate 콘텐츠

  1. 각 전체 셀 다음 공식에 따라 lysate에 폴립 파생 인산 nanomoles 6.5 단계에서 결정 하는 인산 염 농도 변환:
    nmol 폴립 = 1.5 x (µ M 인산 / 10)
    참고: 6 단계에서 표준 곡선 기반 메서드는 각 100 µ L 폴립 샘플 단계 5.2에서에서 aliquoted (µ M)에서 인산 염의 농도를 결정합니다. 변환 하려면이 농도 nmol의 수, 100 µ L 나눈 10 L에 볼륨을 주고6 농도 (µmol L-1)을 곱한 다음 곱한 1000 (nmol에는 µmol 수). 이 10에 나누어 농도를 감소 시킨다. 총 추출 볼륨 4 단계에서 준비 150 µ L 이므로 1.5 전체 추출 물에 있는 인산 염의 nmol 계산 하 여 결과 값을 번 식 해야 합니다.
  2. 3.4 단계에서 결정 하는 각 샘플에 mg 총 단백질 nmol 폴립 나누어 총 세포질 단백질을 세포 폴립 콘텐츠를 정상화. 폴립 수준의 개별 폴립 파생 무료 인산 염의 농도 관점에서 표현 됩니다.
    참고: 경우에 따라 샘플에 폴립 파생 인산의 양을 인산 염 표준 곡선 (단계 6.5)의 선형 범위 밖에 빠지다 수 있습니다. 폴립의 수준이 매우 높은 경우에, 단계 4.6에서에서 초과 폴립 포함 eluate 희석된 1시 10분 또는 1: 100, 필요에 따라 수 하 고 5-7 단계에 설명 된 대로 다시 측정.

결과

프로토콜의 주요 단계는 diagrammed 그림 1에서 단순화 된 형태에서.

그램 음성 박테리아, 야생-타입 E. 콜라 이 프로토콜의 사용을 MG165539 파운드에서 37 ° C (200 rpm) 떨고 풍부한 매체에 중간 로그 단계로 성장, 다음 씻어 서 되었고에 추가 2 h에 대 한 인 큐베이 팅 morpholinopropanesulfonate ...

토론

여기에 설명 된 프로토콜 간소화 되 고 완전히 처리 약 1.5 h 복용 24 샘플의 전형적인 세트와 함께 다양 한 박테리아에서 폴립 레벨의 정량화를 가속 한다. 이 샘플의 신속한 심사 및 돌연변이 라이브러리의 분석을 허용 하 고 운동 실험 시간이 지남에 폴립의 축적을 측정을 단순화 합니다. 우리는 프로토콜 대표자 3 다른 문의에 효과적으로 작동 증명: proteobacteria firmicutes, 그리고 actinobacteria, 그들의...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 프로젝트는 알라바 마의 대학 버밍엄과 미생물학의 시동 자금 및 NIH 부여 R35GM124590 (MJG), 및 NIH 부여 R01AI121364 (FW)에 지원 됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmid pScPPX2Addgene112877available to academic and other non-profit institutions
LB brothFisher ScientificBP1427-2E. coli growth medium
ampicillinFisher ScientificBP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
HEPES bufferGold BiotechnologyH-400-1
potassium hydroxide (KOH)Fisher ScientificP250500for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazoleFisher ScientificO3196500
lysozymeFisher ScientificAAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP columnGE Life Sciences17040901any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrateFisher ScientificAC415611000for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filtersFisher Scientific09-302-168
Bradford reagentBio-Rad5000205
Tris bufferFisher ScientificBP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Bother dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144-212for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl)Fisher ScientificP217500
glycerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS medium mixtureTeknovaM2101E. coli growth medium
glucoseFisher ScientificD161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
dehydrated yeast extractFisher ScientificDF0886-17-0
tryptoneFisher ScientificBP1421-500
magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificM63-50
manganese sulfate monohydrateFisher ScientificM113-500
guanidine isothiocyanateFisher ScientificBP221-250
bovine serum albumin (protease-free)Fisher ScientificBP9703100
clear flat bottom 96-well platesSigma-AldrichM0812-100EAany clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate readerTecan, Inc.not applicableany plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanolFisher Scientific04-355-451
silica membrane spin columnsEpoch Life Science1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1.5 mL microfuge tubesFisher ScientificNC9580154
ammonium acetateFisher ScientificA637-500
antimony potassium tartrateFisher ScientificAAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
ammonium heptamolybdateFisher ScientificAAA1376630
ascorbic acidFisher ScientificAC401471000

참고문헌

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