Le modèle d’Infection de teigne Galleria mellonella pour candidose disséminée

Résumé

Galleria mellonella sert d’un modèle d’invertébrés pour la candidose disséminée. Ici, nous détaillons l’infection du protocole et de prévoir l’efficacité du modèle de données à l’appui.

Résumé

Les espèces de Candida sont commun champignons commensaux des humains qui colonisent la peau, des muqueuses et tube digestif. Sous certaines conditions, le Candida peut proliférer leurs niches naturelles entraînant débilitante infections muqueuses comme bien comme menaçant les infections systémiques, qui sont un élément majeur de l’enquête en raison de leur taux de mortalité élevé. Les modèles animaux d’infection disséminée existent pour étudier la progression de la maladie et de disséquer les caractéristiques de pathogénicité de Candida . Parmi ces, le modèle d’infection de teigne Galleria mellonella offre un outil expérimental rentable à haut débit des investigations de virulence systémique. De nombreux autres agents infectieux bactériens et eucaryotes ont été étudiés efficacement dans g. mellonella de pathogénicité, de comprendre ce qui en fait un système modèle largement accepté. Pourtant, variation de la méthode utilisée pour infecter g. mellonella peut altérer les résultats phénotypiques et compliquer l’interprétation des résultats. Ici, nous présentons les avantages et les inconvénients du modèle réalisé pour étudier la pathogenèse de Candida systémique et une approche pour améliorer la reproductibilité en détail. Nos résultats soulignent l’éventail des cinétiques de la mortalité chez les g. mellonella et décrivent les variables qui peuvent moduler ces cinétiques. En fin de compte, cette méthode se présente comme une approche éthique, rapide et rentable pour étudier la virulence dans un modèle de candidose disséminée.

Introduction

Les espèces de Candida sont des commensaux humaines communes qui sont capables d’en train de devenir des agents pathogènes opportunistes dans sévèrement immunodéprimés et les patients dysbiotic. Bien que plusieurs espèces de Candida peuvent provoquer des maladies, c. albicans est la cause prédominante de candidose disséminée^1,2. Maladie systémique résultant c. albicans , accès à la circulation sanguine grâce à une pénétration directe des barrières de l’hôte déjà restrictives ou introduction au sites chirurgicaux et d’autres violations du corps³. Les espèces de Candida utilisent un éventail de processus pathogènes provoquent des maladies systémiques au sein de l’hôte, y compris la filamentation, la formation de biofilm, évasion de cellules immunitaires et évasion et fer nettoyage⁴. In vitro des approches existent pour étudier les mécanismes pathogènes individuels, mais des modèles animaux continuent de fournir la meilleure option pour enquêter sur l’ensemble des maladies résultat^5,6. Des recherches antérieures a détaillé les nombreux cas de promettre en vitro enquêtes de virulence avoir omis de reproduire in vivo^7,8. Ainsi, les modèles animaux sont encore nécessaires afin d’évaluer la virulence in vivo. La plupart des modèles de la maladie dépendent de la souris pour servir de substitut pour les infections humaines malgré l’incapacité de c. albicans naturellement coloniser murines systèmes comme un commensal⁹. Invertébrés ultrarésistant de candidose disséminée le nématode Caenorhabditis elegans, le fruit fly Drosophila melanogasteret la teigne Galleria mellonella, bien que les préoccupations au sujet des différences fondamentales en physiologie de base, la température du corps hôte et voies d’exposition ont entravé leur acceptation large^10,11.

Plus récemment, le modèle d’infection de teigne g. mellonella a été adopté à la pathogénicité de modèle d’un large éventail d’agents pathogènes bactériens et fongiques^12,13,14. Avantages de ce modèle incluent son coût relativement faible, une augmentation débit, facilité d’utilisation et réduit les préoccupations d’ordre éthique concernant les animaux par rapport aux modèles murins de la bienfaisance. Pour les chercheurs, cela se traduit par une capacité accrue de tester plusieurs variables, des intervalles de confiance plus fortes, l’expérimentation plus rapide et contournement des protocoles animaux. G. mellonella a servi de plateforme d’évaluer rapidement la virulence de c. albicans après perturbation des gènes nécessaires à biofilm formation filamentation et gène règlement dans l’ensemble des isolats cliniques^{11,15 ,},¹⁶. Des études récentes ont intégré l’enquête d’efficacité antifongique avec g. mellonella pour évaluer la pharmacocinétique de drogues est très actif et résistance sous in vivo paramètres, qui sont autrement difficile et chronophage ^17,,¹⁸. Pourtant, les études de c. albicans virulence chez g. mellonella ont été compliquées par aurait été de hauts niveaux de variation au sein des expériences et des protocoles incompatibles entre les groupes de recherche qui produisent différents phénotypes de résistance entre la souris et waxworms^{11,13,19,20,21}. Ici, nous exposons un protocole de g. mellonella visant à normaliser les infections, de c. albicans augmentation reproductibilité dans les expériences de virulence et démontrer leur cohérence avec les études décrites précédemment de virulence dans murin modèles.

Des études antérieures ont démontré que c. albicans , accouplement de type semblable (MTL) locus sur le chromosome 5 régule identité cellulaires et accouplement de compétence similaire à Saccharomyces cerevisiae et autres de champignons ascomycètes²². La majorité des isolats de c. albicans est hétérozygote au locus MTL , codant chacun des MTLun et MTLα allèles (MTLun/α) et est par conséquent stériles^{15, 23 , 24}. perte de l’un des allèles MTL par le biais de perte d’hétérozygotie (LOH) ou mutation conduit à homozygotes MTLune ou des souches α de MTLqui peuvent subir une commutation phénotypique de l’état stérile « blanc » à la accouplement d’État compétent de « opaque »²⁵. Les travaux précédents a mis en évidence que perte d’hétérozygotie MTL réduit également virulence dans les modèles murins d’infection systémique à travers de souche différente origines²⁶. Ici, nous détaillons le modèle de g. mellonella pour candidose disséminée utilisant un jeu expérimental génétiquement semblable pour illustrer la contribution d’hétérozygotie MTL de virulence chez g. mellonella. Nous montrons que MTL configuration influencé pathogénicité de c. albicans , où MTLα souches étaient moins virulentes MTLun/α tant MTLa cellules, semblables aux conclusions au sein de l’infection murine modèle²⁶.

Protocole

Toutes les méthodes décrites s’appuient sur l’utilisation des hôtes d’invertébrés et ne nécessitent pas d’approbation institutionnelle animalier et utiliser Comité (IACUC).

1. les larves de teigne galleria mellonella

1. Commander des larves de grossistes et fournisseurs qui n’introduisent pas d’hormones, antibiotiques ou autres traitements aux larves et qui sont en mesure d’expédier et livrer des spécimens vivants.
   1. N’oubliez pas d’acheter toutes les larves auprès du même fournisseur au cours de l’expérimentation. Soyez prudent lorsque vous passez votre commande de larves pendant les mois d’été que des températures supérieures à 30 ° C diminuent la viabilité des larves.
   2. Surveiller les températures dans l’ensemble de l’itinéraire de livraison prévue et plan d’expédition et livraison en conséquence ou choisir une expédition accélérée afin de minimiser leur exposition aux conditions environnementales.
2. Lorsque les larves arrivent, vérifier chaque conteneur afin d’assurer des larves viables, en bonne santés sont présents. Les larves saines seront complètement submergées sous la literie, le déplacement et possèdent une légère coloration jaune/navy/red avec peu de larves contenant des marques noires ou décoloration le long du corps.
3. Ranger les larves dans le contenant dans un endroit ventilé à température ambiante (25 ° C). Selon la condition initiale des larves, ils peuvent servir jusqu'à deux semaines.

2. culture préparation pour Infection Galleria mellonella

NOTE : Vêtements de laboratoire approprié doit être porté tout au long de cette partie du protocole notamment gants, blouse et lunettes de sécurité.

1. Faire dextrose peptone levure plaques de liquide et l’agar (DPJ). Préparer 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et solutions d’éthanol 70 %.
2. Croissance des souches de C. albicans à injecter du jour au lendemain dans 3 mL de la DPJ fraîche dans des tubes de culture standard sur un tambour rotatif à vitesse moyenne et 30 ° C.
3. Faire tourner les cellules vers le bas à 2 500 g pendant 5 min dans une centrifugeuse de table. Décanter le liquide surnageant, en veillant à ne pas déranger le culot cellulaire.
   1. Remettre en suspension les cellules entièrement dans 5 mL de PBS 1 x par la pipette répétées ou l’utilisation du vortex. Répétez la centrifugation et la remise en suspension des cellules dans deux fois plus de PBS pour garantir l’élimination de tous les milieux de culture.
4. Après un lavage final, remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS et transférez-les sur un tube de microcentrifuge.
5. Procéder à une série de dilutions en série dans du PBS pour générer un 1/100, 1:1, 000 et série de dilution de 1/100 000.
   Remarque : Dilutions Alternative peuvent être nécessaires pour atteindre les globules désirée.
   1. Utilisant un hémocytomètre, compter les cellules depuis le 1/100 ou la dilution de 1 : 1 000. Le plus souvent, la dilution de 1 : 1 000 fournit que la cellule appropriée compte pour cultures de c. albicans .
   2. Calculer la concentration totale des cellules dans la culture initiale en utilisant le calcul de la grille de l’hémocytomètre, viser entre les cellules de 30-300 pour être comptés dans la grille de 5 x 5 centrale. Un compteur de cellules automatisées peut-être être utilisé comme alternative. Cependant, l’utilisation de la densité optique pour déterminer le nombre de cellules est déconseillée tant que la morphologie cellulaire (taille, forme, etc.) peut affecter significativement l’exactitude des informations.
6. En utilisant le nombre de cellules mesurées, faire une dilution nouvelle de 2.5x10⁷ cellules/mL dans une solution de 1 PBS x dans un tube de microcentrifuge. Cette dilution servira de base pour chaque inoculation de g. mellonella avec c. albicans. Chaque injection nécessitera 10 µL de cet inoculum pour une dose infectieuse de 250 000 cellules de c. albicans .
7. Confirmer la précision de la dose infectieuse en ensemençant le volume exact de la dilution 1/100 000 pour 100 unités formant colonies (UFC) sur agar de la DPJ pour chaque culture à utiliser dans l’infection.
8. Incuber les plaques de numération des cellules de l’étape 2.7 pendant 48 heures (h) à 30 ° C et compter le nombre de colonies par boîte. Entre 80 et 120 colonies constitue une plage acceptable pour une précision dans l’inoculum.

3. infection des larves de Galleria mellonella avec des Cultures de Candida

NOTE : Vêtements de laboratoire approprié doit être porté tout au long de cette partie du protocole notamment gants, blouse et lunettes de sécurité.

1. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % et 1 mL de solution 1 PBS x à deux tubes de microcentrifuge distinct. L’éthanol et PBS servira à laver l’aiguille d’injection entre les infections.
2. Étendre une petite quantité de litière de teigne dans un vide, 100 x 15 mm boîte de Petri stérile, qui abritera les larves après inoculation pour chaque souche indépendante. Ajout de la literie limite l’adhérence des morts g. mellonella larves à la surface de la boîte de Pétri.
3. Stériliser un 26 G, 10 seringue µL en reprenant et en radiation 10 µL d’éthanol 70 % trois fois suivie de trois lavages avec addition de 10 µL de solution 1 PBS x. Vortex la dilution de l’inoculation de c. albicans et prennent 10 µL de la culture. S’assurer qu’il n’y a aucune bulle d’air dans la seringue, injection d’air favorise la mort et va compliquer l’analyse en aval.
4. Ouvrir un conteneur renfermant les larves de g. mellonella et retournez soigneusement literie avec un doigt pour découvrir des larves. Sélectionnez les larves qui sont en bonne santé, tels qu’identifiés par le mouvement actif, une lumière de couleur jaune/Navy/Red et un manque de pigmentation noire sur le corps de la larve. Ces larves doivent être de taille similaire à travers le plein expérimental définis.
5. Ramasser une seule larve et maintenez-le délicatement entre le pouce et l’index ou du majeur semblable à tenir un crayon. Rouler les larves sur le dos afin que les jambes soient vers le haut. Maintenez toute la longueur du corps entre les doigts et le pouce afin que les larves ne parvient pas à boucler ou s’arracher de l’injection.
   NOTE : Si vous le souhaitez, Stérilisez le point d’injection à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol à 100 %.
6. Faire pivoter la seringue pour coupe en biseau de l’aiguille vers le haut et introduire doucement la pointe de l’aiguille dont la longueur du biseau dans le corps à la jonction avec la jambe gauche plus en arrière. Veiller à ce que l’aiguille pénètre dans le corps et ne pousse pas simplement le corps de l’intérieur des larves. Ne forcez pas à pénétrer le corps comme l’aiguille peut percer complètement par les trématodes rapidement. Soulever délicatement avec l’aiguille confirmera la pénétration appropriée. Injecter l’inoculum de Candida complet 10 µL et extraire l’aiguille.
7. Répétez l’étape 3.3-3.5 pour chaque larve. Pour empêcher la cellule de décantation, vortex le Candida cultures pour l’inoculation après chaque troisième injection. Comme contrôle, injecter 10 µL de solution 1 PBS X un ensemble de g. mellonella .
8. Maison Co 10 larves injectés de la même culture de Candida dans chaque boîte de Pétri 100 x 15 mm suivant l’inoculation. Incuber à 37 ° C, les larves pendant huit jours, vérification des larves toutes les 24 h pour surveiller la mort.
   1. Évaluer la mortalité initialement par pigmentation sombre, la formation de taches noires ou des organes et le manque de mouvement. Pour confirmer la mortalité, utiliser des pinces à rouler doucement les larves moribonds sur leur dos et pousser légèrement dessous de larve avec la pince à épiler. Non-réactivité tel qu’observé par l’absence de mouvement de corps ou de la jambe visible est marquée comme mort et les larves sont supprimés de la boîte de Pétri.
9. Mortalité des larves record au cours du temps. Les larves qui commencent à se nymphoser dans papillons peuvent être incluses dans l’analyse mais doivent être retirés si ils commencent à muer. Larves de poupée peuvent être censurés de point de terminaison analyse que les différences de virulence entre la larve et la nymphe ne sont pas claires.
10. Évaluer la signification statistique en utilisant le test statistique de Mantel-Cox.

Résultats

Ici, nous démontrons une méthode reproductible pour l’utilisation de g. mellonella waxworms pour enquêter sur un modèle de candidose disséminée de l’infection à l’aide de c. albicans. Le rangement, l’entretien et la sélection des larves d’infection sont une composante essentielle d’assurer la reproductibilité mellonella g. mortalité (Figure 1A). Les larves saines qui sont actifs, ont une légè...

Discussion

Le modèle de teigne g. mellonella se présente comme un outil efficace pour l’analyse rapide et reproductible de la virulence de c. albicans . Ce protocole détaillé s’appuie sur une prestation uniforme d’une dose infectieuse définie au même endroit dans un lot de larves. Dose infectieuse a un impact profond sur la mortalité mellonella g. considérant que l’utilisation de larves entre leur arrivée et les dix jours suivant la réception produit des résultats similaires. Perte de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O