Galleria mellonella Waxworm инфекции модель для распространения кандидоз

Galleria mellonella служит беспозвоночных модель для распространенных кандидоз. Здесь, мы подробно инфекции протокол и предоставлять вспомогательные данные для модели эффективности.

Аннотация

Видов Candida являются общие грибковых Комменсалами людей колонизации кожи, слизистых поверхностей и желудочно-кишечного тракта. При определенных условиях Candida могут перерасти их природных ниш, что приводит к изнурительной слизистой инфекции как хорошо как опасные для жизни системных инфекций, которые являются одним из основных направлений расследования из-за их связанные высокой смертности. Животные модели распространения инфекции существуют для изучения прогрессирования заболевания и рассекает характеристики Candida патогенности. Из них Galleria mellonella waxworm инфекции модель обеспечивает экономически экспериментальный инструмент для исследования высок объём системных вирулентности. Многие другие бактерий и эукариот инфекционные агенты эффективно изучались в G. mellonella понять патогенности, что делает его широко принятой модели системы. Тем не менее изменения в метод, используемый для заразить G. mellonella можно изменить результаты фенотипических и затруднить интерпретацию результатов. Здесь мы приводим, преимущества и недостатки waxworm модели для изучения патогенеза системный кандидоз и подробно такой подход к улучшению воспроизводимость. Наши результаты выделить диапазон кинетики смертности в G. mellonella и описывают переменные, которые можно модулировать эти кинетики. В конечном итоге этот метод стоит как этического, быстрое и эффективное подход для изучения вирулентности в модели распространения кандидоза.

Введение

Видов Candida являются общие человеческие Комменсалами, которые способны как оппортунистических патогенов в сильно ослабленным и дисбиотических пациентов. Хотя многие виды Candida могут вызывать заболевания, C. albicans является самой распространенной причиной распространения кандидоз¹^,². Системных заболеваний результаты от C. albicans доступ кровоток через либо прямого проникновения ранее ограничительных хост барьеров или введение в хирургических сайтов и другие нарушения тела³. Candida видов использования ряда патогенных процессов могут вызвать системные заболевания в пределах узла, включая филаментацию, биопленки, уклонение иммунных клеток и бежать и железа, очистку⁴. В vitro подходы существуют для расследования индивидуальных патогенетических механизмов, но Животные модели продолжать предоставлять лучший вариант, чтобы исследовать весь исход болезни⁵^,⁶. Предыдущие исследования подробно многие случаи перспективным в vitro исследования вирулентности, неспособность воспроизводить в vivo⁷^,⁸. Таким образом, Животные модели по-прежнему необходимы для оценки вирулентности в vivo. Большинство моделей болезни полагаются на мышах в качестве суррогата для человека инфекции, несмотря на неспособность C. albicans естественно колонизировать мышиных систем как синантропных⁹. Беспозвоночных модели распространенных кандидоз включают нематоды Caenorhabditis elegans, фрукты fly Drosophila melanogasterи waxworm Galleria mellonella, хотя опасения по поводу основных различий в основных физиологии температуры тела пребывания и пути воздействия препятствовали их широкое признание¹⁰^,¹¹.

Совсем недавно была принята модель инфекции waxworm G. mellonella для модели патогенности широкого спектра бактериальных и грибковых патогенов¹²^,^,¹³¹⁴. Преимущества этой модели включают его относительно низкая стоимость, увеличение пропускной способности, простота использования и снижение этические соображения относительно животных благодеяние, по сравнению с мышиных моделях. Для исследователей это приводит к увеличению возможность протестировать несколько переменных, сильнее доверительные интервалы, более быстрое экспериментов и обход животных протоколов. G. mellonella служил в качестве платформы для быстро оценить C. albicans вирулентности после возмущения генов, необходимых для регулирования формирования, филаментацию и Джин биопленки через клинических изолятов¹¹^,¹⁵ ^,¹⁶. Недавние исследования включили расследования противогрибковая эффективность с использованием G. mellonella для оценки фармакокинетики препарата активности и сопротивления параметры в естественных условиях , которые в противном случае вызов и много времени¹⁷^,¹⁸. Тем не менее исследования C. albicans вирулентности в G. mellonella было осложнено сообщается, что высокие уровни вариации в рамках экспериментов и несовместимые протоколы между исследовательскими группами, которые производят различные вирулентности фенотипов между мышами и waxworms¹¹^,¹³^,¹⁹^,^,²⁰²¹. Здесь мы приводим G. mellonella протокол стандартизировать C. albicans воспроизводимость увеличение инфекции, в экспериментах вирулентности, и продемонстрировать соответствие ранее описанных исследований вирулентности в мышиных модели.

Предыдущие исследования показали, что C. albicans спаривания локус (MTL) тип как на хромосоме 5 регулирует ячеек самобытности и спаривания компетенции аналогичные Saccharomyces cerevisiae и других грибов аскомицетов²². Большинство C. albicans изолятов гетерозиготных в локусе мТл , кодирование один из каждого из мТл и MTLα аллелей (MTL/α) и следовательно стерильные¹⁵^, ²³ ^, ²⁴. потери одной из аллелей MTL через потери гетерозиготности (LOH) или мутация приводит к гомозиготных MTL или MTLα штаммов, которые могут пройти фенотипические переключатель от стерильного «белый» государства спаривания компетентные государственные «непрозрачного»²⁵. Предыдущая работа подчеркнул, что потеря гетерозиготности MTL также уменьшает вирулентности в мышиных моделях системной инфекции через различные деформации стола²⁶. Здесь мы подробно G. mellonella модель для распространения с помощью генетически аналогичны экспериментальный набор изображать вклад гетерозиготности мТл к вирулентности в G. mellonellaкандидоза. Мы покажем, что МРЛ конфигурации влияние C. albicans патогенности, где MTLα штаммы были менее вирулентные MTL/α и MTL клетки, подобные выводы в мышиных инфекции модель²⁶.

протокол

Все методы, описанные полагаются на использование беспозвоночных хостов и не требуют одобрения институциональный уход животных и использовать Комитет (IACUC).

1. galleria mellonella Waxworm личинок

Заказать личинок от оптовиков и поставщиков, не вводить, гормоны, антибиотики или другие процедуры для личинки и которые способны корабль и доставить образцов.
1. Убедитесь в том приобрести все личинки от того же поставщика в ходе экспериментов. Будьте внимательны при заказе личинок в летние месяцы, как температура превышает 30 ° C уменьшение жизнеспособности личинки.
2. Контролировать температуру по всему маршруту ожидается доставка и соответствующим образом планировать и доставки или выбрать ускоренной доставки для сведения к минимуму их воздействие на условия окружающей среды.
Когда личинки прибывают, проверьте каждый контейнер для обеспечения жизнеспособного, здоровые личинки присутствуют. Здоровые личинки будут полностью погруженным под постельные принадлежности, перемещение и обладают светло желтый/Тан окраски с несколько личинок, содержащие черные метки или пятна вдоль тела.
Храните личинок в их контейнере в вентилируемое пространство при комнатной температуре (25 ° C). В зависимости от первоначального состояния личинки они могут использоваться для до двух недель.

2. Культура подготовка Galleria mellonella инфекции

Примечание: Надлежащего лаборатории наряд должен носить в течение этой части протокола, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки.

Сделайте дрожжи Пептон Декстроза плиты жидкости и агар (YPD). Подготовка 1 x-фосфатный буфер (PBS) и 70% растворы этанола.
Расти штаммов C. albicans будет введен на ночь в 3 мл свежего YPD в стандартных культуры трубы на вращающийся барабан на средней скорости и 30 ° C.
Вращать клетки вниз на 2500 x g 5 мин в настольной центрифуги. Слить супернатанта, стараясь не нарушить Пелле ячейки.
1. Ресуспензируйте клетки полностью в 5 мл ПБС неоднократные закупорить или vortexing. Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в два раза больше PBS для обеспечения удаления всех культуры средств массовой информации.
После окончательного мыть Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS и передавать их на пробки microcentrifuge.
Проводить набор серийных разведений в PBS для генерации 1: 100, 1:1, 000 и картирование разрежения серии.
Примечание: Альтернативные разведениях может быть необходимо достичь желаемого клеток.
1. С помощью Горяева, подсчитать ячейки от 1: 100 или 1:1,000 разрежения. Чаще всего 1:1,000 разрежения обеспечивает соответствующую ячейку подсчитывает для культур, C. albicans .
2. Расчет общей концентрации клеток в пределах первоначальной культуры с помощью математика сетка Горяева, направленных для между 30-300 клетки быть подсчитанным в сетке Центральной 5 x 5. Счетчик автоматизированной клеток может использоваться в качестве альтернативы; Однако использование оптической плотности для определения клеток приветствуется как морфология клеток (размер, форма и т.д.) может существенно повлиять на ее точность.
Используя измеренные клеток, сделайте новый разрежения 2, 5х10⁷ кл/мл в ПБС в пробки microcentrifuge. Это раствора будет служить основой для каждой прививки G. mellonella с C. albicans. Каждая инъекция потребует 10 мкл этой посевным материалом для инфекционных дозы 250.000 клеток C. albicans .
Подтвердите точность инфекционных дозы, покрытие правильный объем картирование разрежения на 100 единиц образуя колонии (CFUs) на YPD агар для каждой культуры, которые будут использоваться в инфекции.
Инкубации клеток количество пластин из шага 2.7 для 48 часов (h) при 30 ° C и подсчитать количество колоний на пластину. Между 80 и 120 колоний представляет собой приемлемый диапазон для точности в посевным материалом.

3. инфекции Galleria mellonella личинки с Candida культур

Добавьте 1 мл 100% этанола и 1 мл ПБС в двух отдельных microcentrifuge трубы. Этанола и PBS будет использоваться для мытья иглу между инфекции.
Спред небольшое количество waxworm кроватей в пустой, стерильные Петри 100 x 15 мм, которая разместится личинок после прививки для каждой независимой штамма. Кроме того постельные принадлежности ограничивает соблюдение мертвых G. mellonella личинок на Петри блюдо поверхности.
Стерилизуйте 26 G, 10 мкл шприц, принимая и стирания 10 мкл 70% этанола, три раза, после чего три автомойки с 10 мкл ПБС. Вихрь прививка разрежения C. albicans и занять 10 мкл культуры. Убедитесь, что есть нет пузырьков воздуха в шприц, как инъекции воздуха способствует смерти и осложнит течению анализ.
Откройте контейнер, содержащий G. mellonella личинок и осторожно перевернуть постельные принадлежности с пальцем, чтобы раскрыть личинки. Выберите личинки, которые находятся в добром здравии, выявленные активное движение, светло желтый/коричневый цвет и отсутствие черной пигментации на теле личинки. Эти личинки следует быть аналогичного размера через экспериментальных полный набор.
Забрать одну личинок и удерживайте его нежно между индекс/средний палец и большой палец похож на держа карандаш. Ролл личинки на его обратно, поэтому ноги вверх. Провести полную длину тела между пальцами и большого пальца, так что личинки не может свернуться или тянуть от инъекций.
Примечание: При желании, стерилизуйте месте инъекции, используя ватный тампон, смоченный в 100% этанола.
Вращать шприц так скос иглы обращена вверх и медленно вставьте кончик иглы, включая длину фаски в тело на стыке с задней левой ноги. Убедитесь, что игла проникает в тело и не просто нажимаем тела личинки внутрь. Не использовать силу в проникновении тело, как игла может пробить полностью личинки быстро. Аккуратно лифтинг с иглой подтвердит соответствующим проникновения. Придать посевным материалом Candida полный 10 мкл и извлеките иглу.
Повторите шаг 3.3-3.5 для каждого личинки. Чтобы предотвратить ячейку, оседая, вихревой Candida культур для прививки после каждого третьего инъекции. Как элемент управления придать набор G. mellonella 10 мкл ПБС.
Совместное дом 10 личинки вводят от той же культуры Candida в каждом Петри 100 x 15 мм, после прививки. Инкубируйте личинки при 37 ° C в течение восьми дней, проверка личинки каждые 24 ч для мониторинга смерти.
1. Оценить смертность первоначально по темной пигментации, формирование черные пятна или органов и отсутствие движения. Для подтверждения смертности, используйте пинцет нежно рулон умирающий личинок на их обратно и слегка толкать нижней личинки с помощью пинцета. Non оперативность как отмечалось отсутствие видимых движения тела или ног оценивается как смерть и личинки, удаляются из Петри.
Запись личинки смертности в течение времени. Личинки, которые начинают окукливаются в моли могут быть включены в анализ, но должны быть удалены, если они начинают линьки. Pupating личинок может подвергаться цензуре от конечной точки анализа как вирулентность различия между личинки и куколки являются неясными.
Оценка статистической значимости, используя статистический тест Mantel-Кокс.

Результаты

Здесь мы демонстрируем воспроизводимый метод для использования waxworms G. mellonella расследовать модель распространенных кандидоз инфекции с использованием C. albicans. Хранения, обслуживания и отбора личинок для инфекции являются критическим компонентом обеспечивая...

Обсуждение

Модель waxworm G. mellonella стоит как эффективный инструмент для быстрого и воспроизводимость анализа C. albicans вирулентности. Этот подробный протокол опирается на последовательной доставки определенных инфекционных дозы на тот же сайт через партию личинок. Инфекционные доза имеет гл?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить помощь, Памела Вашингтон и Лия Андерсон в получении Galleria mellonella для использования в данном исследовании.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH₂O