Il modello di infezione del Waxworm di Galleria mellonella per candidosi disseminata

Riepilogo

Galleria mellonella serve come un modello di invertebrati marini per candidosi diffusa. Qui, abbiamo dettaglio l'infezione protocollo e fornire dati di supporto per l'efficacia del modello.

Abstract

Specie di candida sono comuni fungine commensals degli esseri umani colonizzando superfici mucose, pelle e tratto gastrointestinale. In determinate condizioni, la Candida può Erbaiuto loro nicchie naturali conseguente debilitante infezioni delle mucose come bene come pericolose infezioni sistemiche, che sono degli obiettivi principali di indagine a causa di loro associati alti tassi di mortalità. Modelli animali di infezione diffusa esistano per studiare la progressione della malattia e le caratteristiche di patogenicità di Candida di dissezione. Di questi, il modello di infezione waxworm Galleria mellonella fornisce un conveniente strumento sperimentale per le indagini di alto-rendimento di virulenza sistemica. Molti altri agenti infettivi batterici ed eucariotici sono state studiate in modo efficace in g. mellonella capire patogenicità, che lo rende un sistema di modello ampiamente accettato. Eppure, variazione nel metodo utilizzato per infettare g. mellonella può alterare i risultati fenotipici e complicare l'interpretazione dei risultati. Qui, descriviamo i vantaggi e svantaggi del modello waxworm per studiare la patogenesi di Candida sistemica e un approccio per migliorare la riproducibilità di dettaglio. I nostri risultati selezionare l'intervallo di cinetica di mortalità in g. mellonella e descrivono le variabili che possono modulare questi cinetica. In definitiva, questo metodo si pone come un approccio etico, rapido e conveniente per lo studio di virulenza in un modello della candidosi diffusa.

Introduzione

Specie di candida sono comuni commensals umano che sono in grado di emergendo come patogeni opportunisti in severamente immunocompromised e dysbiotic pazienti. Sebbene molte specie di Candida possono causare malattia, c. albicans è la causa più prevalente di candidosi diffusa^1,2. Malattia sistemica deriva da c. albicans l'accesso nella circolazione sanguigna tramite entrambi penetrazione diretta delle barriere restrittive precedentemente ospite o introduzione presso siti chirurgici e altre violazioni del corpo³. Candida specie utilizzano una gamma di processi patogeni per causare la malattia sistematica all'interno dell'ospite tra cui filamentazione, formazione di biofilm, l'evasione delle cellule immuni e fuga e ferro lo scavenging⁴. Esistono in vitro approcci per studiare i meccanismi patogeni individuali, ma modelli animali continuano a fornire la migliore opzione per indagare l'interezza di malattia risultato^5,6. La ricerca precedente ha dettagliato molte istanze della promettente indagini in vitro della virulenza non riuscendo a riprodurre in vivo^7,8. Così, modelli animali sono ancora necessari per valutare la virulenza in vivo. Maggior parte dei modelli di malattia si basano sui topi per servire come un surrogato per le infezioni umane nonostante albicans del c. impossibilità di colonizzare naturalmente sistemi murini come un commensale⁹. Invertebrati marini modelli della candidosi diffusa includono il nematode Caenorhabditis elegans, il frutto per volare Drosophila melanogastere la waxworm Galleria mellonella, anche se le preoccupazioni circa le differenze fondamentali in fisiologia di base, le temperature del corpo ospite e vie di esposizione hanno ostacolato la loro vasta accettazione^10,11.

Più recentemente, è stato adottato il modello di infezione di waxworm g. mellonella alla patogenicità di modello di una vasta gamma di patogeni batterici e fungini^12,13,14. Vantaggi di questo modello includono la relativamente basso costo, una maggiore produttività, facilitano d'uso e ridotto preoccupazioni etiche per quanto riguarda animali beneficenza rispetto ai modelli murini. Per i ricercatori, questo si traduce in una maggiore possibilità di testare più variabili, gli intervalli di confidenza più forti, più rapida sperimentazione e bypass dei protocolli degli animali. G. mellonella ha servito come una piattaforma per valutare rapidamente la virulenza di albicans del c. dopo perturbazione dei geni richiesti per regolamento di formazione, FILAMENTAZIONE e gene di biofilm in isolati clinici^{11,15 ,16}. Studi recenti hanno incorporato indagine dell'efficacia antifungina tramite mellonella g. per valutare la farmacocinetica di attività della droga e resistenza sotto impostazioni di in vivo , che sono altrimenti impegnativo e richiede tempo ^17,18. Ancora, gli studi della virulenza dei albicans del c. di g. mellonella hanno stati complicati da riferito alti livelli di variazione all'interno di esperimenti e protocolli incoerenti tra gruppi di ricerca che producono differenti fenotipi di virulenza tra topi e waxworms^{11,13,19,20,21}. Qui, descriviamo un protocollo mellonella g. per standardizzare i albicans del c. infezioni, aumento riproducibilità in esperimenti di virulenza e dimostrare la coerenza con gli studi precedentemente descritti della virulenza di murino modelli.

Gli studi precedenti hanno dimostrato che la c. albicans accoppiamento tipo-come (MTL) locus sul cromosoma 5 regola della microcella e accoppiamento competenza simile a Saccharomyces cerevisiae e altri di funghi ascomiceti²². La maggior parte degli isolati di c. albicans è eterozigotica del locus MTL , codifica uno di ciascuno degli MTLun e MTLα alleli (MTLun/α) e è di conseguenza sterile^{15, 23 , 24}. perdita di uno degli alleli MTL attraverso la perdita di eterozigosi (LOH) o mutazione conduce ad omozigotica MTLun o ceppi α MTLche possono subire un interruttore fenotipico dello stato sterile 'bianco' per la accoppiamento di stato competente 'opaque'²⁵. Il lavoro precedente ha evidenziato che la perdita di eterozigosi MTL riduce anche virulenza in modelli murini di infezione sistemica per il ceppo diverso sfondi²⁶. Qui, abbiamo dettaglio il modello di g. mellonella per candidosi diffusa utilizzando un set sperimentale geneticamente simile per rappresentare il contributo di eterozigosi MTL alla virulenza in g. mellonella. Mostriamo che configurazione MTL influenzato albicans del c. patogenicità, dove MTLα ceppi erano meno virulenti rispetto al MTLun/α sia MTLun celle, simile ai risultati all'interno di infezione murina modello²⁶.

Protocollo

Tutti i metodi descritti si basano sull'impiego di invertebrati marini padroni di casa e non richiedono l'approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).

1. galleria mellonella Waxworm larve

1. Larve di ordine da grossisti e fornitori che non introducono ormoni, antibiotici o altri trattamenti per le larve e che sono in grado di spedire e consegnare esemplari vivi.
   1. Essere sicuri di acquistare tutte le larve dallo stesso fornitore nel corso della sperimentazione. Prestare attenzione quando si ordinano le larve durante i mesi estivi, come temperature superiori ai 30 ° C diminuiscono la vitalità di larve.
   2. Monitoraggio delle temperature in tutto il percorso di spedizione prevista e pianificare la spedizione e la consegna di conseguenza o scegliere spedizione celere per minimizzare la loro esposizione alle condizioni ambientali.
2. Quando le larve arrivano, check ogni contenitore per assicurare le larve vitali, sane sono presenti. Larve sane saranno completamente sommersa sotto la biancheria da letto, in movimento e possiedono una leggera colorazione giallo/tan con poche larve contenenti segni neri o macchie lungo il corpo.
3. Memorizzare le larve nel loro contenitore in uno spazio ventilato a temperatura ambiente (25 ° C). A seconda della condizione iniziale delle larve, possono essere utilizzati fino a due settimane.

2. cultura preparazione per Galleria mellonella infezione

Nota: Un abbigliamento adeguato laboratorio deve essere indossato in tutta questa parte del protocollo tra cui guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.

1. Fare destrosio di lievito peptone (YPD) liquido e agar tavole. Preparare 1 x tamponato fosfato salino (PBS) e soluzioni di etanolo 70%.
2. Crescere di ceppi di C. albicans deve essere iniettato durante la notte in 3 mL di YPD fresco in provette di coltura standard su un tamburo rotante a velocità medie e 30 ° C.
3. Selezione celle verso il basso a 2.500 x g per 5 min in una centrifuga da tavolo. Versare il sovranatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare.
   1. Risospendere le cellule completamente in 5 mL di PBS 1X ripetute pipettando o Vortex. Ripetere la centrifugazione e risospensione delle cellule in PBS altre due volte per garantire la rimozione di tutti i terreni di coltura.
4. Dopo un lavaggio finale, risospendere le cellule in 1 mL di PBS e trasferirli in una provetta da microcentrifuga.
5. Condurre una serie di diluizioni in PBS per generare un 1: 100, 1:1, 000 e serie di diluizioni 1: 100.000.
   Nota: Diluizioni alternativi potrebbero essere necessari raggiungere i conteggi delle cellule desiderata.
   1. Utilizzando un emocitometro, contare le celle da 1: 100 o la diluizione di 1:1,000. Più spesso, la diluizione di 1:1,000 fornisce che la cella appropriata conta per c. albicans culture.
   2. Calcolare la concentrazione totale di cellule all'interno della cultura iniziale utilizzando la matematica di griglia dell'emocitometro, puntando tra 30-300 celle da contare nella centrale griglia 5 x 5. Un contatore di cellule automatizzato può essere utilizzato come alternativa; Tuttavia, uso di densità ottica per determinare la conta delle cellule è sconsigliato come morfologia delle cellule (dimensione, forma, ecc.) possa influire significativamente l'esattezza.
6. Utilizzando i conteggi delle cellule misurata, fare una nuova diluizione di 2.5x10⁷ cellule/mL in 1X PBS in una microcentrifuga. Questa diluizione servirà come base per ogni inoculazione di mellonella g. con c. albicans. Ogni iniezione richiederà 10 µ l di questo inoculo per una dose infettiva di 250.000 cellule di c. albicans .
7. Verificare l'accuratezza della dose infettiva di placcatura il corretto volume della diluizione 1: 100 000 per 100 unità formanti colonie (CFU) su agar YPD per ogni cultura essere utilizzato in infezione.
8. Incubare le piastre conte cellulari dal passaggio 2.7 per 48 ore (h) a 30 ° C e contare il numero di colonie per piastra. Tra 80 e 120 colonie costituisce un intervallo accettabile per accuratezza nell'inoculo.

3. infezione delle larve di Galleria mellonella con culture di Candida

Nota: Un abbigliamento adeguato laboratorio deve essere indossato in tutta questa parte del protocollo tra cui guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.

1. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% e 1 mL di 1X PBS a due separati per microcentrifuga. L'etanolo e PBS serviranno per lavare l'ago per iniezione tra le infezioni.
2. Stendere una piccola quantità di biancheria da letto di waxworm in un vuoto, sterile di Petri 100 x 15 mm, che ospiterà le larve dopo inoculazione per ogni sforzo indipendente. Aggiunta di biancheria da letto limita l'aderenza dei morti mellonella g. larve sulla superficie della piastra di Petri.
3. Sterilizzare un 26 G, 10 siringa µ l prendendo e espungere 10 µ l di etanolo al 70% tre volte seguita da tre lavaggi con 10 µ l di 1X PBS. Vortice la diluizione di inoculazione di albicans del c. e occupano 10 µ l di cultura. Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria all'interno della siringa, come iniezione di aria promuove la morte e complicherà analisi a valle.
4. Aprire un container contenente le larve mellonella g. e attentamente capovolgere biancheria da letto con un dito per scoprire le larve. Selezionare le larve che sono in buona salute, come identificato dal movimento attivo, una luce di colore giallo/tan e una mancanza di pigmentazione nera sul corpo di larve. Queste larve devono essere di dimensioni simili tutta la sperimentale impostate.
5. Pick up un singolo larve e tenerlo delicatamente tra il pollice e indice e medio simile a che tiene una matita. Rotolare le larve sul lato posteriore in modo che le gambe sono rivolto verso l'alto. Tenere l'intera lunghezza del corpo tra le dita e il pollice in modo che le larve è in grado di arricciatura o tirare lontano l'iniezione.
   Nota: Se lo si desidera, sterilizzare il sito di iniezione con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 100%.
6. Ruotare la siringa in modo smusso dell'ago rivolto verso l'alto e inserire lentamente la punta dell'ago, compresa la lunghezza della smussatura nel corpo allo svincolo con la gamba sinistra più arretrata. Assicurarsi che l'ago penetra il corpo e non semplicemente spingere il corpo dello dentro le larve. Non forzare mai a penetrare il corpo come l'ago può perforare completamente attraverso le larve rapidamente. Si sollevano delicatamente con l'ago confermerà la penetrazione adeguata. Iniettare l'inoculo di Candida completa 10 µ l ed estrarre l'ago.
7. Ripetere il passaggio 3,3-3,5 per ogni larve. Per evitare la sedimentazione, vortice la Candida cella culture per inoculazione dopo ogni terza iniezione. Come un controllo, è possibile iniettare un insieme di g. mellonella con 10 µ l di 1X PBS.
8. Co-house 10 larve iniettate dalla stessa coltura Candida in ogni capsula di Petri 100 x 15 mm dopo l'inoculazione. Incubare le larve a 37 ° C per otto giorni, il controllo di larve ogni 24 h per monitorare la morte.
   1. Valutare la mortalità inizialmente da pigmentazione buia, la formazione di macchie nere o corpi e la mancanza di movimento. Per confermare la mortalità, è necessario utilizzare una pinzetta a rotolare delicatamente moribonde larve sulla loro schiena e poke leggermente inferiore di larve con le pinzette. Non-responsività come osservato da una mancanza di movimento visibile del corpo o della gamba è segnato come la morte e le larve vengono rimossi da di Petri.
9. Mortalità di larve di registrare nel corso del tempo. Le larve che iniziano a pupate in falene possono essere inclusi nell'analisi ma dovrebbero essere rimosso se cominciano a muta. Pupating larve possono essere censurate dal punto finale analisi come le differenze di virulenza tra larve e pupa sono poco chiare.
10. Valutare la significatività statistica utilizzando test statistico Mantel-Cox.

Risultati

Qui, dimostriamo un metodo riproducibile per l'uso di waxworms g. mellonella per studiare un modello di candidosi diffusa di infezione usando c. albicans. Il deposito appropriato, la manutenzione e la selezione delle larve per infezione sono una componente fondamentale di assicurare la riproducibilità della mortalità mellonella g. (Figura 1A). Larve sane che sono attive, hanno una luce di colore giallo/tan, e patc...

Discussione

Il modello di waxworm g. mellonella si pone come strumento efficace per l'analisi rapida e riproducibile di virulenza di albicans del c. . Questo protocollo dettagliato si basa sulla distribuzione uniforme di una dose infettiva definita allo stesso sito attraverso un batch delle larve. Dose infettiva ha un profondo impatto sulla mortalità mellonella g. considerando che l'uso di larve tra loro arrivo iniziale e dieci giorni dal ricevimento prodotto risultati simili. Perdita dell'allele c. a...

Materiali

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