Un dispositif de positionnement pour le placement des souris pendant la livraison de siRNA intranasal au système nerveux central

Résumé

Ici, nous présentons un protocole utilisant un dispositif de positionnement de souris qui permet le placement approprié des souris pour l'administration intranasale d'une formulation de peptide-siRNA de cerveau-ciblage permettant le silençage efficace de gène dans le système nerveux central.

Résumé

L'administration intranasale (IN) de médicaments au cerveau est apparue comme une méthode prometteuse pour contourner la barrière hémato-encéphalique (BBB) pour l'administration de médicaments dans le système nerveux central (SNC). Des études récentes démontrent l'utilisation d'un peptide, RVG9R, incorporant le domaine récepteur-contraignant minimal de la glycoprotéine de virus de la rage, en obtenant la livraison de siRNA dans les neurones dans le cerveau. Dans ce protocole, la formulation peptide-siRNA est livrée intranasally avec une pipette dans la main dominante, tandis que la souris anesthésié est retenue par le éraflure avec la main non dominante dans une « position de tête vers le bas et vers l'avant » pour éviter le drainage dans le poumon et l'estomac à l'inhalation. Cette préhension précise des souris peut être apprise mais n'est pas facile et exige la pratique et la compétence pour avoir comme conséquence l'utilisation efficace de CNS. En outre, le processus est tiré à long terme, nécessitant environ 45 min pour l'administration d'un volume total de 20-30 l de solution en 1-2 volumes de gouttelettes llet par inhalation, avec 3-4 min de périodes de repos entre chaque inhalation. L'objectif de cette étude est de divulguer un dispositif de positionnement de la souris qui permet le placement approprié des souris pour une administration efficace IN de la formulation peptide-siRNA. Plusieurs caractéristiques sont incorporées dans la conception de l'appareil, telles que quatre ou huit chaises de positionnement avec la hauteur réglable et l'inclinaison pour retenir les souris anesthésiés dans la position de tête vers le bas et vers l'avant, permettant une visualisation facile des nares des souris et un coussin chauffant intégré pour maintenir la température corporelle des souris pendant la procédure. Fait important, la capacité de traiter quatre ou huit souris simultanément avec des complexes RVG9R-siRNA de cette manière permet des études sur une échelle de temps beaucoup plus rapide, pour l'essai d'une approche in thérapeutique siRNA. En conclusion, ce dispositif permet un positionnement approprié et contrôlé de la tête de la souris pour l'application IN de RVG9R-siRNA et d'autres molécules thérapeutiques, telles que les nanoparticules ou les anticorps, pour la livraison du SNC.

Introduction

Le BBB empêche les molécules administrées par le système de 400-600 Da d'entrer dans le cerveau, posant un défi important à la livraison de biomolécules thérapeutiques pour les maladies affectant le SNC et le cerveau¹. L'administration directe de médicaments au cerveau peut être obtenue par injection stéréotaxique; cependant, ceci exige l'expertise chirurgicale et est fortement limité dans la livraison aux secteursproximal au site d'injection, le rendant impropre à l'usage clinique courant 2. Dans la livraison au cerveau peut également entraîner la livraison directe du cerveau en contournant le BBB, permettant le transfert direct et rapide d'une variété de substances au cerveau^3,4. Ce transfert est pensé pour se produire par les mécanismes de transport par l'intermédiaire des nerfs olfactifs et trigéminaux qui relient le passage nasal au cerveau, le fluide céphalo-rachidien, et les systèmes lymphatiques⁵. Comme la route directe du nez au cerveau n'implique pas les organes et les tissus périphériques, elle réduit considérablement les effets secondaires systémiques et améliore la puissance. IN administration est une alternative non invasive prometteuse aux voies locales et systémiques pour la livraison du cerveau des agents thérapeutiques et peut représenter une approche puissante pour combattre les troubles neurologiques, y compris la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, et cancer du cerveau, et est à l'étude dans plusieurs essais cliniques^6,7,8.

Plusieurs facteurs expérimentaux, tels que le volume et la méthode d'inoculation, ainsi que le pH de formulation, influencent fortement l'administration de médicaments au SNC par la voie nez-cerveau⁹. Dans les études sur des souris, le succès de l'administration de médicaments IN dépend fortement d'un bon positionnement de la tête, ce qui est essentiel pour un dépôt cérébral efficace et pour éviter le drainage des médicaments dans l'environnement externe ou les voies respiratoires. Notamment, la majorité des études de rongeurs emploient une position de tête-arrière (supine) avec une inclinaison de 70-90 degrés pour la livraison dedrogue à l'épithélium olfactif, même si le positionnement de tête à 0 degrés peut favoriser le drainage dans la trachée 9. DANS la livraison de médicaments chez les souris qui sont éveillés entraîne une réduction des dépôts cérébraux par rapport à toute application dans la position de supine, principalement en raison de l'incapacité des scientifiques à tenir les souris dans la position désirée pendant de plus longues périodes de temps. En outre, la position à l'envers requise par la méthode d'adhérence de la peau utilisée pour les souris éveillées entraîne un dépôt de médicaments principalement dans le nerf trigéninal et l'ampoule olfactive, ainsi que les organes périphériques, tels que les reins et les poumons, dans les 30 minutes postinoculation¹⁰. La position du corps la plus appropriée pour la livraison de produits thérapeutiques par le biais des nerfs olfactifs ou trigéminaux chez les grands animaux tels que les primates non humains dans les études cliniques semble être la position de tête vers le bas et vers l'avant (c.-à-d., la soi-disant «prier à la Mecque position")¹¹. Cependant, cette position n'a pas été bien étudiée dans le modèle de souris, et la position de supine est plus largement utilisée dans les études de rongeur.

Auparavant, nous avons montré que le RVG9R, un peptide conçu sur la base du domaine de liaison des récepteurs minimaux du virus de la rage, affiche le tropisme aux cellules exprimant des sous-unités de récepteurs d'acétylcholine nicotiniques comme les neurones et les macrophages et livraison intracellulaire de siRNA par un mécanisme impliquant l'engagement de récepteur et la délocalisation temporaire de membrane de plasma au site de l'agrégation de récepteur^12,13. Fait important, l'administration intraveineuse systémique des complexes RVG9R-siRNA permet la livraison transvasculaire de siRNA dans le CNS¹⁴. Cependant, la voie systémique dilue la quantité de siRNA livrée au SNC, et des données récentes démontrent que l'administration IN des complexes RVG9R:siRNA aux souris positionnées dans la position de tête vers le bas et vers l'avant suscite un renversement de gène cible largement répandu dans plusieurs régions du cerveau¹⁵. Fait important, ce niveau de knockdown a été atteint avec aussi peu que 13,5 g de siRNA administré s'il s'agit d'un régime de quatre doses et de 2 jours, tandis que l'itinéraire IV nécessite une dose de 5 fois plus élevée par injection pour atteindre un knockdown comparable. La seule lacune de l'approche IN est qu'il s'agit d'une procédure ardue, nécessitant l'utilisation des deux mains lors de l'administration de la solution tout en saisissant continuellement les souris alternativement dans la tête vers le bas et vers l'avant et dans des positions détendues entre chaque inhalation pendant une longue période de traitement considérable (une procédure de 30-45 minutes pour l'utilisation effective d'un volume de 20-30 Livres par souris). L'utilisation du dispositif de positionnement de la souris présenté ici permet le placement approprié des souris avec peu de contrainte physique pour les animaux et le personnel exécutant le protocole, ainsi que le traitement de plusieurs cohortes de souris dans un délai raisonnable, permettant une étude approfondie sur l'utilisation des siARN comme thérapeutique pour l'encéphalite du Nil occidental chez la souris aux stades avancés de la maladie¹⁵.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices et protocoles approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université de Hanyang. Dans ce protocole, des souris Balb/c de 6 semaines pesant 20-25 g ont été utilisées (n - 3 par groupe). Les animaux étaient logés dans une installation exempte d'agents pathogènes avec des cycles de lumière/obscurité de 12 h à un niveau de température et d'humidité contrôlé s'il n'y avait pas accès à l'eau et à la nourriture.

1. Assemblage de périphériques

1. Assembler les différentes parties du dispositif de positionnement comme indiqué à la figure 1A.
   REMARQUE : L'appareil est fourni en différentes parties qui peuvent être facilement assemblées et démontées.

2. Configuration matérielle

REMARQUE : L'administration IN de médicaments liquéfiés nécessite les étapes de prétraitement suivantes.

1. Préparer les matériaux requis, y compris le dispositif de positionnement, une micropipette de 10 L, des pointes de micropipette de 10 L, une solution de traitement (p. ex., complexe RVG9R-siRNA), une horloge de minuterie et 70 % d'éthanol (voir la figure 2A).
2. Branchez le code d'alimentation pour activer le système de chauffage de l'appareil au moins 15-20 minutes avant l'expérience. La température optimale pour les expériences animales est automatiquement maintenue à 37 oC.
3. Préparer l'anesthésie kétamine:xylazine:phosphate-tamponed saline (PBS) à un rapport de 1:0.5:8.5 et anesthésier chaque souris avec une seule injection intrapéritonéale (i.p.) dans un volume final de 200 L par souris de 20 g.
   REMARQUE: Veuillez noter que tout médicament optimisé pour assurer l'anesthésie pendant une période de 30-45 min peut être utilisé.

3. Positionnement de la souris

1. Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pince ment d'orteil ferme) pour maintenir le plan chirurgical.
2. Placez le dispositif de positionnement à une distance et une hauteur appropriées afin de fournir un accès pratique à tous les réactifs requis.
3. Une fois que les souris sont correctement anesthésiées, soulevez doucement chaque souris par le éraflure de leur cou avec le pouce et le doigt de pointeur et placez-la sur la chaise désignée.
4. Un bon positionnement de la souris sur la chaise est très important à ce stade. Poser le dos de la souris parallèlement au support arrière de la chaise, et à 90 degrés au siège de la chaise. Soulevez les mains de la souris et laissez l'animal se coucher naturellement dans la position de tête vers le bas et vers l'avant, sans pousser ni appuyer, comme le montre la figure 2B. Assurez-vous que les membres antérieurs de la souris fournissent un soutien naturel pendant que l'animal est dans cette position détendue, sans aucun inconfort pour la souris.
5. Une fois que les souris sont correctement positionnées, attachez les souris avec la ceinture de chaise, et commencez immédiatement l'inoculation IN.

4. Livraison intranasale

REMARQUE : Ce protocole décrit la livraison IN des complexes RVG9R:siRNA à l'aide du dispositif de positionnement de la souris. À l'aide de ce protocole, un maximum de 20 à 30 l de solution peut être facilement administré à chaque souris en 2 gouttes de L. Ce volume est inférieur à celui de la cavité nasale de la souris, qui est de 0,032 cm³, de sorte que la procédure n'entraîne pas d'obstruction ou d'asphyxie mortelle de la narine. Ce protocole permet l'inoculation simultanée d'au moins quatre souris et d'un maximum de huit souris par appareil, ce qui permet d'optimiser le temps et de réduire la variabilité.

1. Prenez la micropipette de 10 l et ajustez-la à 2 l.
2. Chargez la micropipette avec une solution complexe de 2 l de RVG9R:siRNA (p. ex., 5,2 g de siCy5 complexe avec 104 g de RVG9R pour l'expérience de livraison, et 13,5 g de siSOD1 complexe avec 270 g de RVG9R pour l'expérience de silence, dans un volume final de 25 'L de PBS contenant 5% de glucose.
3. Tout en tenant la pipette dans la main dominante, ajuster la position en plaçant un coude sur le dessus du banc. Soutenez la main en tenant la pipette de l'autre main pour éviter les mouvements incontrôlés pendant l'administration.
4. Placez une goutte de 2 l très près d'une narine afin que la souris puisse inhaler directement la gouttelette (voir figure 2B). Si une petite goutte n'est pas facilement formée, remplacez la pointe de pipette par une nouvelle et répétez l'opération. Utilisez le chronomètre pour vérifier l'intervalle de temps entre les vaccinations.
5. Ce dispositif permet le traitement d'au moins quatre souris à la fois. Si un autre groupe de souris est nécessaire pour répéter l'étape 4.4, mettre une autre barre avec quatre chaises au-dessus ou au-dessous de la première barre avec quatre chaises pour accueillir jusqu'à huit souris à la fois sur l'appareil.
6. Répétez l'étape 4.4 avec l'autre narine après 3-4 min de la première inoculation. Cet intervalle de temps est suffisant pour que la souris complète l'inhalation de la première dose et rétablisse la respiration normale. Si une goutte de la solution inhalée est délogée en raison d'un renix accidentel du naris de la souris, réinoculer une solution supplémentaire de 2 L.
7. Répétez l'ensemble du processus avec des narines alternatives jusqu'à ce que la dose de 20-30 L soit terminée. Il faudra 30-45 minutes pour terminer toute la procédure d'inoculation.
8. Mettez de l'onduleur humide sur les yeux des souris avant de les renvoyer dans leurs cages désignées.
   REMARQUE : Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu'à ce qu'elles aient retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la charge sternale.

5. Analyse des données

1. Pour confirmer le dépôt de cerveau du RVG9R Fluor-étiqueté, anesthésiez les souris (comme décrit dans l'étape 2.3) et isolez le cerveau, aussi bien que d'autres organes périphériques, tels que le poumon, le foie, la rate, et le rein. Placez chaque organe sur l'ImageStation et visualisez la fluorescence à l'aide d'ImageStation.
2. Pour visualiser la fluorescence due à l'étiquette Cy5, préparez des cryosections de 20 m d'épaisseur, costained avec Hoechst 33342, et effectuez le balayage de plein-cerveau avec un microscope confocal.
3. Pour évaluer le silençage génique, extraire l'ARN de diverses régions du cerveau, telles que l'ampoule olfactive, le cortex, l'hippocampe, le thalamus, l'hypothalamus, le cervelet et le tronc cérébral, avec un kit de purification de l'ARN, transcrit à l'envers en cDNA à l'aide d'un cDNA kit de synthèse, et effectuer qPCR avec des paires d'apprêt comme décrit précédemment¹⁵.

Résultats

La position principale pendant l'administration d'IN est une influence majeure sur l'efficacité de la livraison de drogue au cerveau. Ici, nous avons décrit la position de tête vers le bas et vers l'avant à l'aide d'un dispositif de positionnement de la souris pour l'administration IN d'une formulation peptide-siRNA ciblant le cerveau pour la livraison du mélange au SNC de la souris. Pour vérifier la livraison par l'intermédiaire de la route IN, nous avons utilisé le peptide RVG9R, précédemment montré pour se lier efficacement aux cellules neuronales à la fois in vitro et in vivo^14,16.

Nous avons d'abord testé la livraison nez-à-cerveau du peptide RVG9R étiqueté avec Alexa Fluor 488 (RVG9R-A⁴⁸⁸) en utilisant le dispositif de positionnement de la souris décrit ici. À la postinoculation de 48 h, divers organes, y compris le cerveau, le sinus, les poumons, le foie, la rate, et les reins ont été excisés pour mesurer la fluorescence de⁴⁸⁸ tissu-associée. Un⁴⁸⁸ seul, ou un peptide de contrôle (RVM9R-A⁴⁸⁸)¹⁴ qui ne lie pas nAchR, ont été utilisés comme contrôles négatifs. Comme prévu, ni A⁴⁸⁸ ni RVM9R-A⁴⁸⁸ n'ont été détectés dans aucun des organes à 48 h de postinoculation (figure3A, à gauche). D'autre part, un fort signal fluorescent A⁴⁸⁸ a été détecté exclusivement dans le cerveau du groupe RVG9R-inoculé. En outre, nous avons comparé cette position de placement de la souris à la méthode de position en supine qui a été utilisé précédemment¹⁷, ainsi que la méthode éveillée, pour l'efficacité. Nous avons inoculé une quantité fixe de RVG9R-A⁴⁸⁸ (100 g) et la biodistribution admisée à 48 h postinoculation. Les résultats ont indiqué que le positionnement des souris la tête vers le bas et vers l'avant a amélioré la pénétration et le dépôt de RVG9R-A⁴⁸⁸ dans tout le tissu cérébral (figure 3A, droite). En revanche, les animaux inoculés dans une position de supine ont eu comme conséquence la livraison de RVG9R-A⁴⁸⁸ au cerveau mais pas aussi fort qu'on le voit avec la méthode de dispositif de positionnement. Pour confirmer davantage la livraison de siRNA au cerveau, nous avons exécuté le balayage de plein-cerveau après une administration simple d'IN de RVG9R complexe à 400 pmol (5.2 g) de siRNA Cy5-étiqueté. Contrairement à PBS ou RVM9R, le complexisation avec RVG9R a entraîné une forte accumulation de siRNA dans les principales régions du cerveau, y compris l'ampoule olfactive, le cortex, l'hippocampe, le thalamus, l'hypothalamus, le cerveau moyen et le cervelet (Figure 3B ).

Enfin, nous avons utilisé l'analyse RT-qPCR pour vérifier la livraison intracellulaire de l'ARNs siARN fonctionnel ciblant le gène de dismutase-1 (SOD1) de superoxyde. Les souris ont été inoculées intranasally pendant 3 fois pendant des jours consécutifs avec RVG9R :siSOD1 (13.2 g de siRNA), et l'expression d'ARNm soD1 a été analysée 24 h après la dernière inoculation. L'administration de RVG9R:siSOD1 a eu comme conséquence une réduction substantielle de l'expression de SOD1 dans l'ampoule olfactive (63%), du cortex (47%), de l'hippocampe (61%), du thalamus (53%), de l'hypothalamus (55%), du cerveau moyen (39%), et du cervelet (30%) (Figure 4). En conclusion, l'utilisation d'un dispositif de positionnement permet une inoculation IN facile de l'ARNre complexe RVG9R chez la souris, résultant en la livraison de siRNA spécifique au cerveau induisant le silençage fonctionnel du gène cible.

Figure 1 : Présentation photographique de l'assemblage de l'appareil. Les chaises de positionnement sont assemblées sur le support à la hauteur appropriée avec des vis. Après l'assemblage, l'appareil est connecté à une alimentation pour le chauffage à la température physiologique pendant l'inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Présentation photographique de la procédure d'inoculation IN à l'aide du dispositif de positionnement. (A) Équipement expérimental requis pour l'inoculation IN. (B) Animaux dans la tête en bas et en avant assis sur l'appareil (à gauche) et le dépôt d'une gouttelette de 2 ll pour IN inoculation (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Distribution de peptide et de siRNA étiquetés fluorescents après l'administration IN. (A) Biodistribution du peptide RVG9R intranasally inoculé à 48 h après une seule inoculation IN. Le cerveau et d'autres organes périphériques ont été évalués pour la présence de fluorescence chez les souris inoculées avec salin (PBS), A⁴⁸⁸, RVM-A⁴⁸⁸, et RVG-A⁴⁸⁸ (à gauche). Imagerie des souris traitées comme mentionné ci-dessus alors qu'elles sont éveillées, en position de supine, et dans le positionnement de la souris concevoir dans la tête vers le bas et vers l'avant position (à droite). (B) Biodistribution du complexe RVG9R:siRNA dans le cerveau (n ' 3 par groupe). La distribution de l'ARNs iRNA étiqueté Cy5 a été visualisée en cryosections cérébrales complètes avec un microscope laser confocal chez des animaux inoculés avec saline (PBS), siRNA complexe avec peptide de contrôle (RVM9R-siCy5), ou le peptide ciblant le cerveau RVG9R (RVG9R-siCy5). La barre d'échelle représente 1 mm. Abréviations : o.b ' bulbe olfactif; ctx et cortex; hippopotame et hippocampe; hypo hypothalamus; tha et thalamus; m.b - midbrain; cer et cervelet. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : IN application de RVG9R:siSOD1 induit le silençage des gènes cibles dans plusieurs régions du cerveau. Analyse qPCR pour l'ARNm SOD1 murine dans les régions indiquées de cerveau 24 h après la dernière inoculation de saline (PBS), RVG9R:siCD4 (siCD4), RVM9R:siSOD1 (RVM9R), et RVG9R:siSOD1 (RVG9R). Le soD1 relatif silençant dans l'ampoule olfactive, le cortex, l'hippocampe (supérieur), le thalamus, l'hypothalamus, le cervelet (milieu), et le cerveau moyen (inférieur) est montré. Les données représentent la moyenne de La DD par rapport à GAPDH après normalisation avec les données correspondantes des souris traitées à la saline (n - 3 par groupe). Le dessin animé représentant le pourcentage de l'ARNm SOD1 dans la région du cerveau indiquée après l'inoculation IN est montré (en bas à droite). P lt; 0,01,P 'lt; 0.001. Abréviations: o.b ' ampoule olfactive; ctx et cortex; hippopotame et hippocampe; hypo et hippocampe; tha et thalamus; m.b - midbrain; cer et cervelet. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Nous avons développé un dispositif de positionnement de souris pour positionner de manière optimale les souris pour la livraison du nez au cerveau des produits thérapeutiques. L'appareil est équipé de différentes fonctionnalités, assurant la manipulation simultanée facile des animaux. Il est également équipé de coussins chauffants pour le maintien de la température physiologique du corps des animaux pendant l'expérimentation. Les souris anesthésiées peuvent être maintenues dans la position de tête vers le bas et vers l'avant au moyen de chaises spécialement conçues, avec un minimum d'inconfort pour les animaux. La hauteur des chaises de positionnement peut être ajustée de manière à visualiser les narines animales tout en administrant des médicaments.

Dans la livraison du cerveau a plusieurs limitations intrinsèques, y compris la petite surface des narines (permettant des volumes maximaux de 20-30 L par administration), irritation nasale, dommages à l'épithélium, et l'absorption limitée à travers l'épithélium nasal¹⁸. L'administration IN de médicaments aux souris placées en position de supine a été utilisée pour la livraison du cerveau en laissant tomber des médicaments liquides dans les nares alternatives des animaux via pipette ou tube de polyuréthane (24 G x 19 mm) relié s'il y a des seringues de microlitre^{19, 20}. Bien que l'utilisation de systèmes de tuyauterie pour libérer des drogues près de l'épithélium olfactif soit une approche potentiellement appropriée, elle cause l'irritation ou l'inflammation nasale sur l'administration répétitive. En outre, la petite taille de la cavité nasale limite cette approche, en particulier chez les souris qui peuvent être surmontées par la répétition, ainsi que par des formulations de médicaments qui persistent dans la muqueuse nasale. Une autre option est l'administration IN de la thérapeutique pour réveiller les souris¹⁰. Cependant, cette approche exige des procédures habiles pour la manipulation des animaux pendant l'inoculation IN. En outre, il provoque le stress animal et, par conséquent, n'est pas idéal pour les modèles de maladies, en particulier les modèles de maladies infectieuses. En outre, le dosage incohérent peut facilement résulter du drainage de drogue dans les poumons ou l'estomac dû à l'apaisement imparfait d'animal. L'approche présentée ici permet aux scientifiques de surmonter ces obstacles techniques. La position de tête vers le bas et vers l'avant réduit la possibilité de fuite de drogue du nez aux poumons tout en inhalant, favorisant la livraison directe et sélective de siRNA au cerveau. Dans la livraison à l'aide du dispositif de positionnement de la souris ne nécessite aucune technique spécialisée pour la manipulation ou la préhension des animaux pendant l'inoculation. Quatre animaux à la fois peuvent être traités pendant une période d'au moins 30-45 min. La procédure peut être mise à l'échelle en incluant une barre supplémentaire de quatre chaises, permettant la gestion facile de jusqu'à huit souris dans la même session expérimentale. Par conséquent, suivant cette méthode, un seul opérateur peut induire la livraison de médicaments au cerveau de grands groupes d'animaux sur de longues périodes de temps.

La structure anatomique de la cavité nasale influence fortement la livraison du nez au cerveau (tel qu'examiné par Merkus et al.¹¹ et Ruigrok et de Lange²¹). La surface relative de la cavité nasale chez la souris est 15 fois plus grande que celle des humains et la surface relative de l'épithélium olfactif est 6 fois plus grande. Bien qu'il existe des différences significatives dans l'anatomie de la cavité nasale chez l'homme aux rongeurs, il ya environ 45 essais cliniques en cours en utilisant l'approche IN pour traiter plusieurs troubles cérébraux (www.clinicaltrials.gov). L'étude présentée ici indique que lors de l'utilisation de la livraison IN de la thérapeutique, les scientifiques devraient tenir compte de plusieurs facteurs, tels que la position de la tête, le sommeil, et les agents de livraison appropriés.

Nous avons montré le dépôt efficace et spécifique de siRNA étiqueté fluorescent au cerveau de souris. En outre, la diminution significative de l'expression de gène de SOD1 observée après que la livraison de siRNA ait confirmé des effets fonctionnels. Nous avons précédemment montré uniformément que l'administration IN des complexes rvG9R-siRNA ciblant l'ARN de virus du Nil occidental (WNV) exerce un effet thérapeutique fort sur l'encéphalite de WNV^15. Notamment, la livraison de siRNA nez-à-cerveau a exigé un ligand de cellule-ciblage (RVG) et une molécule positivement chargée (9R) à l'ARNs complexe. En l'absence de ces éléments, les molécules ont été effacées par le circuit systémique et les vaisseaux lymphatiques 48 h posttraitement (Figure 3A)¹⁵. Par conséquent, dans la configuration expérimentale décrite ici, nous avons examiné la localisation de peptide/siRNA 48 h après l'inoculation pour imager seulement les niveaux retenus spécifiquement dans le cerveau. Cette approche pourrait être facilement mise en œuvre pour la livraison d'autres molécules, telles que les protéines, les peptides et les nanoparticules, ou d'autres thérapies, pour le traitement d'un certain nombre de troubles liés au cerveau.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comercial assays
iScript cDNA synthesis kit	BioRad	Cat# 1708891
RNAiso plus	TaKaRa Bio	Cat# 9108
SYBR Premix ExTaq	TaKaRa Bio	Cat# RR420A
Dyes
Alexa fluor 488	ThermoFisher	Cat# A30052
Mouse strain
Balb/c	Orient Bio	N/A	6-8 week old, 20-30g
Oligonucleotides and primers
Human CD4	ST Pharm	N/A	Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’
siSOD1	ST Pharm	N/A	Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’
GAPDH primers	ST Pharm	N/A	F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’
SOD1 primers	ST Pharm	N/A	F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’
Peptides
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
Software, algorithms and devices
FlowJo software 4.3	FlowJO, LLC	N/A	http://docs.flowjo.com/vx/
Mouse positioning device	Signet Biotech	N/A
Prism software	Graphpad	N/A	https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/
Prism software	Graphpad	N/A	https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/