Contrôle de Cluster cellule 3D initial dans un dispositif hybride Gel Cube modèle répétable Formations

Résumé

Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.

Résumé

L’importance des cultures in vitro de 3D est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus. Toutefois, l’absence de répétabilité expérimentale est l’un des ses restrictions. Quelques résultats reproductibles de la formation détériore l’analyse les mécanismes sous-jacents à l’auto-organisation. Réduire la variation dans des conditions de culture initiale, comme la densité cellulaire et la distribution de la matrice extracellulaire (ECM), est cruciale pour améliorer la répétabilité d’une culture 3D. Dans cet article, nous démontrons une procédure simple mais robuste pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir des formations modèle hautement reproductible. Un micromold avec une forme désirée a été fabriqué à l’aide de la photolithographie ou un processus d’usinage, et il forma une poche 3D dans l’ECM contenue dans un cube de gel hybride (HGC). Très concentrée de cellules ont été ensuite injectés dans la poche pour que la forme des cellules cluster mis en correspondance avec la forme du moule fabriqué. Le HGC indépendant autorisés multidirectionnel le balayage par sa rotation, qui a permis d’imagerie à haute résolution et la capture de la structure du tissu entier même si une lentille de grossissement faible a été utilisée. Les cellules épithéliales bronchiques humaines normales ont été utilisés pour démontrer la méthodologie.

Introduction

L’importance d’une culture 3D, qui mieux imite des milieux biologiques que ne le fait une culture 2D, est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus^1,2,3. L’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices importants au sujet de la morphogenèse^4,5. Nombreuses formations tissulaires peuvent apparaître uniquement dans des environnements 3D, comme le pliage processus^6,7, invagination⁸et formation tubulaire^9,10. Toutefois, nombreuses difficultés empêchent les chercheurs de se déplacer à des expériences 3D d’expériences 2D sur un plat. Une des difficultés majeures dans les expériences 3D est celui de l’imagerie 3D échantillons. Par rapport aux expériences planaires, acquisition d’images 3D appropriés est toujours difficile dans de nombreux cas. En particulier, l’obtention d’une image 3D appropriée est une tâche difficile lorsque la taille de l’échantillon atteint la plage de millimètre en raison de la grande profondeur focale des lentilles de grossissement faible. Par exemple, la profondeur focale atteint plus de 50 µm lorsqu’un 10 x grossissement objectif est utilisé alors que la taille de la cellule unique est normalement inférieur à 10 µm. Afin d’améliorer la qualité d’imagerie, systèmes de microscopie de haute technologie sont développées (p. ex., microscopie biphotonique¹¹ et système de microscopie de lumière-fiche¹²), mais leur disponibilité est limitée en raison de leur prix élevé. Comme alternative, nous avons déjà développé un hybride gel cube (HGC) dispositif¹³. Le dispositif se compose de deux types d’hydrogels : gel d’agarose comme un gel de l’aide et un ECM comme le collagène ou Matrigel comme un gel de la culture. Le HGC permet de recueillir les échantillons au cours de la mise en culture et faire pivoter le cube pour atteindre l’imagerie multidirectionnel, qui aborde le problème de profondeur focale¹⁴.

Une autre difficulté dans des expériences 3D est leur faible répétabilité en raison de la piètre contrôlabilité des environnements 3D. Contrairement à une culture plane sur un plat en plastique, des variations dans les conditions de culture initiale se produisent facilement dans un espace 3D, entouré d’un matériau doux. Une variation significative dans les résultats expérimentaux détériore l’analyse qui suit et qui masque les mécanismes sous-jacents. Ingénierie de nombreuses technologies ont été développées pour aligner dans l’espace des cellules individuelles, par exemple bioprinting^15,16,¹⁷et¹⁸d’échafaudage, de tissage de fibres, mais elles nécessitent un prétraitement complexes ou spécifiquement matériel conçu. En revanche, nous avons développé une méthodologie pour réaliser l’alignement de cellule 3D dans un HGC¹⁹.

Dans ce protocole, nous montre une procédure simple avec équipement couramment utilisé pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale 3D dans un HGC. Tout d’abord, le processus de fabrication de la HGC a été démontré. Puis, micromolds fabriquées par photolithographie ou un processus d’usinage ont été placés dans la HGC pour produire une poche avec une forme arbitraire dans un ECM. Par la suite, des cellules très denses après centrifugation ont été injectées dans la poche pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans la HGC. L’amas de cellule contrôlée avec précision pourrait être photographié de nombreuses directions en raison de la HGC. Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisées pour démontrer le contrôle de la forme de grappe de cellule initiale et l’imagerie des branches dans des directions multiples, pour améliorer la qualité d’imagerie.

Protocole

1. fabrication de dispositif de cube pour le gel hybride

1. Préparer un cadre de cubes en polycarbonate (PC) à l’aide d’un procédé d’usinage ou une imprimante 3D. La taille de la trame de la PC dépend de la taille de l’échantillon. Dans cette étude, nous avons utilisé un cadre de 5 mm de chaque côté afin que les branches avaient suffisamment d’espace pour s’allonger au cours de la mise en culture.
2. Poser le cadre de la PC sur une lame de verre préalablement refroidi ou une autre surface lisse dans une glacière (< 0 ° C) (Figure 1 a).
3. Ajouter 12 µL d’agarose préchauffé de 1,5 % (p/v) de la face supérieure de l’armature cubique à l’intrados avec une pipette. Caresser la pipette afin que l’agarose se propage pour créer une surface plane (Figure 1 b).
4. En quelques minutes, l’agarose sera guéri. Ramasser le châssis du PC en le faisant glisser jusqu’au bord de la lame de verre à l’aide de la pince à épiler. Veuillez noter que verticalement reprenant la trame de la lame de verre peut en détacher de l’agarose de la structure cubique en raison de la force d’adhérence entre l’agarose et la lame de verre (Figure 1).
5. Faire pivoter le cadre cube pour faire la face ouverte vers le bas, puis placez sur la lame de verre (Figure 1).
6. Répétez les étapes 1,3 – 1,5 jusqu'à trois surfaces sont remplis de gel d’agarose (Figure 1E).
7. Pour former un mur d’agarose sur les visages des quatrième et cinquième, déposez l’agarose dans un visage ouvert (Figure 1F). Une fois qu’un mur d’agarose est formé sur le visage de cinquième, la préparation de la HGC est terminée.

2. fabrication de micromolds par photolithographie ou un processus d’usinage

1. Fabrication par photolithographie
   1. Nettoyer une plaquette de silicium (Si) via un nettoyage par ultrasons avec de l’acétone, l’alcool isopropylique (IPA), puis (DI) de l’eau distillée pendant 5 min chaque. Après l’azote soufflant la plaquette Si avec de l’azote, déshydrater dans un four à 140 ° C pendant 20 min (Figure 2 a(i)).
   2. Spin-manteau, une couche sacrificielle comme LOR et Az résiste sur la plaquette de tr (2 000 tr/min, 30 s) en utilisant un essorage-coater sous une lumière jaune. Immédiatement après l’essorage-enduit, chauffer les tranches sur une plaque chauffante à 90 ° C pendant 3 min (Figure 2 a(ii)). L’épaisseur souhaitée de la couche sacrificielle est supérieure à 1 µm afin que le décollage de processus peut être effectué facilement, mais une épaisseur précise n’est pas nécessaire.
   3. Placer les tranches sur une plaque de cuisson à 70 ° C et ensuite laminé une feuille épaisse de résine photosensible négative avec l’épaisseur désirée sur la couche sacrificielle à l’aide d’un rouleau à main (Figure 2 a(iii))
   4. Cinq minutes après stratification, placer la plaquette sur un aligneur de masque pour l’exposition aux UV. Mettre un photomasque avec le motif désiré sur la feuille de résister et exposer avec lumière UV pendant une durée appropriée. Le temps d’exposition est déterminé par l’épaisseur de la résine photosensible et l’intensité de la lumière ultraviolette. Par la suite, placer les tranches sur une plaque de cuisson pour une cuisson au four après l’exposition à 60 ° C pendant 5 min, suivie d’une cuisson à 90 ° C pendant 10 min. (Figure 2 a(iv))
   5. Développer une résine photosensible négative en immergeant la plaquette en acétate de l’éther monométhylique propylèneglycol (PGMEA) jusqu'à dissolution complète de la zone non exposée (environ 20 min) (Figure 2 a(v)).
   6. Dissoudre la couche sacrificielle à l’aide d’IPA pour le nettoyage par ultrasons de décoller de la microstructure. Une fois que la microstructure est décollée de la gaufrette, rincer à l’eau DI de nettoyage par ultrasons pendant 10 min (Figure 2 a(vi)).
   7. Plonger le moule dans 30 µL du polymère MPC pendant 30 min à température ambiante (environ 20 ° C) pour sécher complètement. Figure 2 b montre le moule fabriqué prisme.
2. Fabrication d’un moule de cylindre
   1. Fabriquer un moule de cylindre en acier avec la taille désirée par un procédé d’usinage. Vous pouvez également utiliser commercialement disponible en acier inoxydable. (Dans cette étude, un cylindre de 600 µm φ est utilisé.)
   2. Immerger l’acier cylindre dans 30 µL du polymère MPC pendant 30 min à température ambiante (environ 20 ° C) pour sécher complètement.
   3. Préparation liquide polydiméthylsiloxane (PDMS) en mélangeant la résine de base et de son rôle de catalyseur (voir Table des matières) dans un rapport de 10:1 suivi de dégazage avec un aspirateur dégazage système pendant 20 min. Puis versez le PDMS dans une plaque-puits-12.
   4. La valeur le cylindre en acier perpendiculairement à la surface de référence et fixe une z-platine afin qu’il peut être inséré perpendiculairement à la surface PDMS non polymérisée dans une plaque 12-puits-placée sur la même surface de référence en déplaçant la z-scène. Incuber le PDMS avec l’acier cylindre dans le four pendant 20 min à 90 ° C pour le durcissement. Couper le PDMS pour former une surface de flanc afin que la pipette peut être insérée dans le processus suivant (Figure 2).

3. contrôler la forme des cluster initial de cellules dans un hydrogel

1. Injecter un ECM approprié pour la culture de la cellule souhaitée, comme le collagène et artificielle des membranes basales, l’HGC pour remplir l’espace de culture (Figure 3 a).
2. Mis le micromold fabriqué sur la HGC directement ou indirectement avec un support approprié, tel qu’illustré à la Figure 3 b. Par la suite, placer la HGC dans un incubateur à CO₂ pendant 25 min à 37 ° C, pour guérir.
3. Soulevez soigneusement le micromold afin que l’ECM ne détériore pas (Figure 3). La poche, comme la forme du moule désiré, sera fabriquée dans l’ECM.
4. Récolter les cellules du plat cultivé par la trypsine – EDTA ou son équivalent selon les types de cellules. Par la suite, centrifuger les cellules afin d’obtenir des cellules très concentrées (pour la culture NHBE, appliquer 0,25 % de trypsine-EDTA et incuber les cellules pendant 3 min, puis neutralisez avec milieu contenant du FBS et centrifugation à 300 x g pendant 4 min).
5. Après centrifugation, enlever le milieu surnageant pour condenser les cellules et injecter les cellules hautement concentrés (3,0 × 10⁴ cellules/µL de cellules NHBE) dans la poche dans l’ECM (Figure 3D).
6. Incuber le HGC avec des cellules dans un incubateur à CO₂ pendant 20 min à 37 ° C pour que les cellules entrent dans la poche de l’ECM pour combler l’espace créé par la micromolds. Si moyen excessif ou les cellules sont présentes sur la surface supérieure, retirez soigneusement à l’aide d’une pipette.
7. Placez la HGC sur un 24-puits-plaque et ajouter 100 µL de milieu approprié (Figure 3E). Pour les cellules NHBE, utilisez un mélange de 1:1 de support spécialisé disponible dans le commerce pour les NHBE et les cellules endothéliales (voir Table des matières).
8. Injecter des ECM supplémentaire pour fermer la poche de la mec et puis incuber à 37 ° C pendant 25 min.
9. Refroidir préchauffé 1,5 % d’agarose à température ambiante (environ 20 ° C). Déposer environ 10 µL de l’agarose sur l’extrados de la HGC pour fermer la surface et empêcher l’ECM de tomber hors de la HGC au cours de la culture et de l’imagerie (Figure 3F). Puis, incuber la HGC pendant 20 min à 37 ° C pour guérir l’agarose.
10. Ajouter le support pour couvrir la HGC ensemble afin que la pression osmotique peut aider à assurer une nutrition aux cellules à l’intérieur de la HGC.

4. multidirectionnel imagerie

1. Reconnaissance de forme 3D non invasive par observation multidirectionnelle
   1. Placez la boîte de Petri ou bien plat contenant le HGC sur un microscope et d’orienter la HGC à l’image de la caméra. Ensuite, obtenir une image de l’échantillon par contraste de phase ou de champ lumineux.
   2. Ramasser et faire pivoter le HGC pour poser une autre surface.
   3. Répétez les étapes 4.1.1 et 4.1.2 jusqu'à obtient des images de tous les six côtés.
2. Imagerie d’immuno-fluorescence par observation multidirectionnelle
   1. Pour la fixation, appliquer paraformaldéhyde à 4 % de l’échantillon sur la HGC à température ambiante (environ 20 ° C) pendant 20 min, suivie de deux rinçages de PBS pendant 10 min chaque.
   2. Permeabilize la HGC avec du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 pendant 10 min à 4 ° C, puis laver le x 3 pendant 10 min avec du PBS.
   3. Incuber le HGC avec 10 % de sérum de chèvre en tampon IF (0,2 % X-100 Triton, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,05 % Tween-20 dans du PBS) pendant 60 min à température ambiante pendant une étape primaire de blocage.
   4. Pour la coloration d’une molécule spécifique, utilisez l’anticorps appropriés. Pour observer la géométrie de la cellule collective, Alexa Fluor 488 Phalloïdine peut être utilisée pour colorer l’actine.
   5. Placez la HGC sur un plat en verre bas sous un microscope laser ou fluorescentes et effectuer l’analyse de six faces pour obtenir l’image de l’ensemble de l’échantillon.

Résultats

Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisés pour démontrer la méthode illustrée et contrôler la géométrie de la cellule collective initiale pour obtenir la forme d’un cylindre et une forme de prisme, respectivement dans un environnement ECM. Les résultats d’imagerie multidirectionnels obtenus par contraste de phase comme phalloïdine coloration d’une forme de cylindre (Figure 4 aB) et la forme...

Discussion

La méthode présentée dans cet article est simple et peut s’effectuer sans le matériel de haute technologie. Parallèlement, un résultat de contrôle précis cell cluster forme dans l’espace 3D d’hydrogel peut être obtenu. Après le contrôle initial, les cellules peuvent croître dans la HGC autant qu’ils sont cultivés sur un plat. L’imagerie multidirectionnelle s’effectue en faisant tourner l’échantillon avec la HGC en utilisant n’importe quel système de microscopie, et il améliore considérabl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well-plate	Corning  Inc.	3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM bullet kit	Lonza	CC-3170	Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-3162	Specialized medium for endothelial cells
Lipidure	NOF co.		MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix	Corning  Inc.	354230
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Normal human bronchial epithelial cells	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416