Erste 3D Cluster Zellkontrolle in einem Hybrid Gel Cube Gerät für wiederholbare Muster Formationen

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen ein Verfahren zur Steuerung der erste Zellform der Cluster in einer 3D extrazelluläre Matrix, eine wiederholbare Musterbildung zu erhalten. Eine kubische Gerät mit zwei verschiedenen Hydrogele wird eingesetzt, um Multi-direktionalen Imaging für Gewebebildung Muster zu erreichen.

Zusammenfassung

Die Bedeutung der in-vitro-3D Kulturen wird deutlich im Zellgewebe/Kultur betont. Jedoch ist der Mangel an experimentellen Wiederholbarkeit eines seine Einschränkungen. Einige wiederholbare Resultate der Musterbildung, verschlechtert sich die Analyse der Mechanismen, die die Selbstorganisation. Reduzierung Variation im ersten Kulturbedingungen, wie z. B. die Zelldichte und Verteilung in der extrazellulären Matrix (ECM), ist entscheidend für die Wiederholbarkeit von 3D Culture zu verbessern. In diesem Artikel zeigen wir eine einfache, aber robuste Verfahren zur Steuerung der erste Zellform der Cluster in einer 3D extrazelluläre Matrix sehr wiederholbare Muster Formationen zu erhalten. Micromold mit einer gewünschten Form mittels Photolithographie oder einer Bearbeitung hergestellt wurde, und bildete eine 3D Tasche in das ECM in einem Hybrid-Gel-Cube (HGC) enthalten. Hochkonzentrierte Zellen wurden dann in der Tasche injiziert, so dass die Zellform-Cluster mit den vorgefertigten Form aufeinander abgestimmt. Die eingesetzten HGC erlaubt Multi-direktionalen Abtastung durch seine Drehung, die hochauflösende Bildgebung und die Erfassung der gesamten Gewebestruktur ermöglicht, obwohl eine niedrige Vergrößerungslinse verwendet wurde. Normalen menschlichen bronchiale Epithelzellen wurden verwendet, um die Methodik zu demonstrieren.

Einleitung

Die Bedeutung von einem 3D Culture, die biologische Umgebungen besser imitiert als eine 2D Kultur tut, ist deutlich im Zellgewebe/Kultur^1,2,3betont. Die Interaktion zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) bietet wichtige Hinweise bezüglich Morphogenese^4,5. Viele Gewebe Formationen können nur unter 3D Umgebungen, z. B. die klappbare Prozess^6,7, Einstülpen⁸und röhrenförmigen Bildung^9,10entstehen. Jedoch verhindern, dass zahlreiche Schwierigkeiten Forscher Verlagerung auf 3D Experimente von 2D Experimente auf einen Teller geben. Eine der Hauptschwierigkeiten in 3D Experimenten ist die Frage der bildgebenden 3D Proben. Verglichen mit planaren Experimente, ist Erwerb der entsprechenden 3D-Bilder in vielen Fällen immer noch herausfordernd. Insbesondere ist die Erlangung einer entsprechenden 3D Bild eine schwierige Aufgabe, wenn die Stichprobengröße Millimeterbereich aufgrund großer Fokustiefe Low-Vergrößerung Objektive erreicht. Beispielsweise erreicht die Schärfentiefe mehr als 50 µm bei einer 10-fach Vergrößerung Objektiv verwendet wird, während die Größe der einzelnen Zelle normalerweise weniger als 10 µm beträgt. Um die Bildqualität zu verbessern, werden High-Tech-Mikroskopiesysteme entwickelt (z. B. zwei-Photonen-Mikroskopie¹¹ und Licht-Blatt Mikroskopie System¹²), aber ihre Verfügbarkeit ist begrenzt aufgrund ihrer teuren Preis. Als Alternative haben wir zuvor ein Hybrid Gel Cube (HGC) Gerät¹³entwickelt. Das Gerät besteht aus zwei Arten von Hydrogele: Agarose als eine Unterstützung Gel und einem ECM wie Kollagen oder Matrigel als Kultur Gel. Die HGC ermöglicht es uns, sammeln der Probenmaterials während der Kultivierung und drehen Sie den Würfel um Multi-direktionalen Bildgebung zu erreichen, richtet sich die Fokustiefe Problem¹⁴.

Eine weitere Schwierigkeit in 3D Experimenten ist ihre geringe Reproduzierbarkeit aufgrund der schlechten Steuerbarkeit der 3D Umgebungen. Im Gegensatz zu einer planaren Kultur auf einer Plastikschale treten Abweichungen in der anfänglichen Kulturbedingungen leicht in einem 3D Raum, umgeben von einem weichen Material. Eine signifikante Variation in den experimentellen Ergebnissen verschlechtert sich die folgende Analyse und Masken die zugrunde liegenden Mechanismen. Viele Technologien wurden entwickelt, um räumlich ausrichten einzelne Zellen, z. B. Bioprinting^15,16, Faser weben¹⁷und Gerüste¹⁸, aber sie erfordern komplexe Vorverarbeitung oder speziell konstruierte Geräte. Im Gegensatz dazu haben wir eine Methodik zur Erreichung 3D Zellausrichtung in eine HGC¹⁹entwickelt.

In diesem Protokoll dargestellt wir ein einfaches Verfahren mit häufig verwendeten Ausrüstung zur Steuerung der 3D ursprünglichen Cluster Zellform in eine HGC. Zunächst zeigte sich der Fertigungsprozess von der HGC. Dann wurden Micromolds hergestellt von Photolithographie oder Bearbeitungsvorgang in der HGC, eine Tasche mit einer beliebigen Form in einem ECM zu produzieren gelegt. Hoher Dichte Zellen nach Zentrifugation wurden anschließend in die Tasche zu steuern, die erste Zellform der Cluster in der HGC injiziert. Die präzise gesteuerte Zelle Cluster könnte aus vielen Richtungen wegen der HGC abgebildet werden. Normalen menschlichen Bronchien (NHBE) Epithelzellen wurden verwendet, um die Kontrolle über die ursprünglichen Cluster Zellform und Bildgebung der Zweige aus mehreren Richtungen zur Verbesserung der Bildqualität zu demonstrieren.

Protokoll

1. Herstellung von Gel Cube Hybridgerät

1. Bereiten Sie einem Polycarbonat (PC) kubischen Rahmen entweder mithilfe einer Bearbeitung oder einem 3D-Drucker. Die Größe des Rahmens PC hängt die Größe der Stichprobe. In dieser Studie verwendet wir einen Rahmen von 5 mm auf jeder Seite, so dass die Zweige genügend Raum hatten, um während der Kultivierung zu verlängern.
2. Legen Sie die PC-Rahmen auf eine vorgekühlte Glas-Folie oder einer anderen glatten Oberfläche in eine Eisbox (< 0 ° C) (Abbildung 1A).
3. Der Bodenfläche mit einer Pipette 12 µL vorgewärmten 1,5 % Agarose (w/V) aus der oberen Fläche der kubischen Rahmen hinzufügen. Streicheln Sie die Pipette, so dass die Agarose breitet sich um eine flache Oberfläche (Abb. 1 b) zu erstellen.
4. Innerhalb von Minuten wird die Agarose geheilt werden. Heben Sie die PC-Rahmen schieben sie an den Rand der Objektträger mit einer Pinzette. Beachten Sie, dass vertikal Abholung des Rahmens aus der Glas-Folie lösen der Agarose aus dem kubischen Rahmen durch die Haftkraft zwischen der Agarose und Objektträger (Abbildung 1) führen kann.
5. Drehen Sie den kubischen Rahmen um das offene Gesicht nach unten, und legen Sie dann auf den Objektträger wieder (Abbildung 1).
6. Wiederholen Sie die Schritte 1,3 – 1,5 bis drei Oberflächen mit Agarose (Abbildung 1E) gefüllt sind.
7. Eine Agarose-Wand auf den vierten und fünften Flächen bilden, lassen fallen Sie die Agarose in aus einer offenen Fläche (Abb. 1F). Sobald eine Agarose-Wand auf dem fünften Gesicht gebildet wird, ist die Vorbereitung der HGC abgeschlossen.

(2) Herstellung von Micromolds durch Photolithographie oder einer Bearbeitung

1. Herstellung von Photolithographie
   1. Saubere destilliert ein Siliziumwafer (Si) per Ultraschall-Reinigung mit Aceton, Isopropylalkohol (IPA), dann (DI) Wasser für 5 Minuten. Nach Stickstoff bläst des Si-Wafers mit Stickstoff Entwässern Sie in einem Ofen bei 140 ° C für 20 min (Abbildung 2A(i)).
   2. Spin-Mantel eine Opferschicht wie LOR und Az auf dem Si-Wafer widersteht (2.000 u/min, 30 s) mit einem Spin Coater unter Gelblicht. Sofort nach dem Spin-Coating erhitzen Sie die Wafer auf einer heißen Platte bei 90 ° C für 3 min (Abbildung 2A(Ii)). Die gewünschte Dicke der Opferschicht ist mehr als 1 µm, so dass das Abheben der Prozess leicht durchgeführt werden kann, aber eine genaue Dicke nicht notwendig ist.
   3. Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte bei 70 ° C und dann Laminat ein dicker negativer Photoresist Blatt mit der gewünschten Stärke auf die Opferschicht mit einem Handroller (Abbildung 2A(Iii))
   4. Legen Sie fünf Minuten nach dem Laminieren, die Wafer auf eine Mask Aligner für UV-Exposition. Festlegen einer Fotomaske mit dem gewünschten Muster auf das Blatt zu widerstehen und für eine angemessene Zeitdauer mit UV-Licht aussetzen. Die Belichtungszeit wird durch die Stärke des Photoresist und die Intensität des UV-Lichts bestimmt. Anschließend legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte für eine Post-Exposition Backen bei 60 ° C für 5 min, gefolgt von Backen bei 90 ° C für 10 min. (Abbildung 2A(iv))
   5. Entwickeln Sie ein negativer Photoresist durch Eintauchen des Wafers in Propylenglykol Monomethyl Äther Acetat (PGMEA), bis die unbelichtete Bereich (ca. 20 min) vollständig gelöst ist (Abbildung 2A(V)).
   6. Lösen Sie die Opferschicht mithilfe von IPA für Ultraschall-Reinigung der Mikrostruktur abheben. Sobald die Mikrostruktur aus dem Wafer abgeschält ist, spülen Sie mit VE-Wasser durch Ultraschallreinigung für 10 min (Abbildung 2A(vi)).
   7. Tauchen Sie den Schimmel in 30 µL des MPC Polymers für 30 min bei Raumtemperatur (ca. 20 ° C) vollständig es trocknen. Abbildung 2 b zeigt die fabrizierten Prisma Form.
2. Herstellung von Zylinder-Schimmel
   1. Eine Stahl-Zylinder Form mit der gewünschten Größe durch einen Bearbeitungsprozess zu fabrizieren. Alternativ können Sie im Handel erhältlichen Edelstahl. (In dieser Studie wird ein Zylinder φ 600 µm verwendet.)
   2. Tauchen Sie den Zylinder Stahl 30 µL des MPC Polymers für 30 min bei Raumtemperatur (ca. 20 ° C) vollständig es trocknen.
   3. Bereiten Sie flüssige Polydimethylsiloxan (PDMS) durch Mischen Basis Harz und seine Katalysator (siehe Tabelle der Materialien) im Verhältnis 10:1 gefolgt von Entgasung mit einem Vakuum-Entgasung System für 20 Minuten. Dann gießen Sie die PDMS in einem 12-Well-Platte.
   4. Die Stahlflasche senkrecht auf die Bezugsfläche und festen zu einer linearen Z-Stufe so eingerichtet dass es senkrecht in die ausgehärtete PDMS Oberfläche in einer 12-Brunnen-Platte platziert auf dieselbe Bezugsfläche durch Verschieben der Z-Phase eingesetzt werden kann. Inkubieren Sie die PDMS mit dem Zylinder Stahl in einem Ofen für 20 min bei 90 ° C für die Heilung. Schneiden Sie die PDMS um eine Flankenoberfläche zu bilden, so dass das Pipettieren im folgenden Prozess (Abbildung 2) eingefügt werden kann.

3. Kontrolle der erste Zellform Cluster in einem hydrogel

1. Injizieren Sie eine entsprechende ECM für die gewünschte Zellkultur wie Kollagen und künstliche Basalmembran in der HGC Kultur Raum (Abbildung 3A) füllen.
2. Legen Sie fabrizierten Micromold auf die HGC direkt oder indirekt mit einem geeigneten Halter, wie in Abbildung 3 bdargestellt. Anschließend legen Sie die HGC in eine CO₂ Inkubator für 25 min bei 37 ° C für die Heilung von es.
3. Sorgfältig herausheben der Micromold, so dass das ECM nicht (Abbildung 3 verschlechtert). Die Tasche wird als die gewünschte Form in das ECM hergestellt werden.
4. Zellen aus der kultivierten Schale von Trypsin-EDTA oder eines gleichwertigen Dokuments, je nach der Zelltypen zu ernten. Anschließend Zentrifugieren der Zellen um hochkonzentrierte Zellen zu erhalten (für NHBE Kultur gelten 0,25 % Trypsin-EDTA und Zellen für 3 min inkubieren, dann neutralisieren mit FBS-haltigen Medium und Zentrifugieren bei 300 X g für 4 min).
5. Entfernen Sie nach Zentrifugieren das überstehende Medium, um die Zellen zu verdichten und injizieren Sie hochkonzentrierte Zellen (3,0 × 10⁴ Zellen/µL für NHBE Zellen) in der Tasche in die ECM (Abbildung 3D).
6. Inkubieren Sie HGC mit Zellen in einem CO-₂ -Inkubator für 20 min bei 37 ° C, so dass die Zellen in die ECM-Tasche fallen füllen den Raum durch die Micromolds erstellt. Wenn übermäßige Mittel "oder" Zellen auf der Oberfläche vorhanden sind, entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette.
7. Die HGC auf einer 24-Well-Platte geben Sie und 100 µL in anderer geeigneter Form (Abbildung 3E). Verwenden Sie für NHBE Zellen eine 1:1 Mischung aus handelsüblichen spezialisierte Medium für NHBE und Endothelzellen (siehe Tabelle der Materialien).
8. Injizieren Sie zusätzliche ECM zum Schließen der Tasche in die ECM, und dann bei 37 ° C für 25 min inkubieren.
9. Vorgeheizten 1,5 % Agarose auf Raumtemperatur (ca. 20 ° C) abkühlen. Fallen Sie ca. 10 µL der Agarose auf der oberen Fläche des HGC in der Nähe der Oberfläche zu verhindern, dass das ECM ein Herausfallen der HGC während der Kultivierung und imaging (Abbildung 3F). Dann, brüten Sie die HGC für weitere 20 Minuten bei 37 ° C um die Agarose zu heilen.
10. Fügen Sie Medium, um die gesamte HGC zu decken, so dass der osmotische Druck helfen kann bei der Bereitstellung von Nahrung auf die Zellen im Inneren der HGC hinzu.

4. Multi-direktionalen Bildgebung

1. Nicht-invasive 3D-Form Anerkennung durch Multi-direktionalen Beobachtung
   1. Platzieren Sie die Kulturschale oder well-Platte mit der HGC am Mikroskop und orientieren Sie der HGC um den Bildausschnitt zu. Dann verschaffen Sie ein Beispielbild von hellen Feld oder Phase Kontrast.
   2. Abholen und den HGC um Platz auf eine andere Oberfläche nach unten drehen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 bis Bilder von allen sechs Seiten abgerufen werden.
2. Immuno-fluoreszierende Bildgebung durch Multi-direktionalen Beobachtung
   1. Gelten Sie für Fixierung 4 % Paraformaldehyd zum Beispiel über die HGC bei Raumtemperatur (ca. 20 ° C) für 20 min, gefolgt von zwei Spülungen der PBS für 10 min.
   2. Permeabilize der HGC mit PBS mit 0,5 % Triton x-100 für 10 min bei 4 ° C, dann 3 X 10 min. mit PBS waschen.
   3. Inkubieren Sie die HGC mit 10 % Ziegenserum in IF-Puffer (0,2 % Triton x-100, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween 20 in PBS) für 60 min bei Raumtemperatur für eine primäre Blockierungsschritt.
   4. Verwenden Sie für die Färbung eines bestimmten Moleküls, die entsprechenden Antikörper. Um die kollektive Zellengeometrie zu beobachten, kann Alexa Fluor 488 Phalloidin, Aktin zu beflecken verwendet werden.
   5. Die HGC auf einer Glasschale unten unter dem Mikroskop Laser- oder Leuchtstofflampen und Scannen von sechs Seiten, das gesamte Sample Bild zu erhalten.

Ergebnisse

Normalen menschlichen Bronchien (NHBE) Epithelzellen dienten demonstrieren die illustrierte Methodik und steuern die erste kollektive Zellengeometrie um eine Zylinderform und Prisma geformt, bzw. in einem ECM-Umfeld zu erreichen. Die Multi-direktionalen bildgebenden Ergebnisse durch Phasenkontrast sowie Phalloidin Färbung, der Form eines Zylinders (Abbildung 4AB) und die Prisma-Form (Abbildung 4D

Diskussion

In diesem Whitepaper vorgestellte Methode ist einfach und kann ohne High-Tech-Ausrüstung durchgeführt werden. Gleichzeitig erhalten Sie eine präzise Zelle Cluster Form Kontrollergebnis im 3D-Raum Hydrogel. Nach der ersten Kontrolle können die Zellen in der HGC wachsen, wie sie auf einem Teller kultiviert sind. Die Multi-direktionale Bildgebung erfolgt durch Drehen der Probenmaterials mit der HGC mit jedem Mikroskopie-System, und es verbessert erheblich die Bildqualität. Die Wahl der Materialien für die HGC Rahmen u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well-plate	Corning  Inc.	3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM bullet kit	Lonza	CC-3170	Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-3162	Specialized medium for endothelial cells
Lipidure	NOF co.		MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix	Corning  Inc.	354230
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Normal human bronchial epithelial cells	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416