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Résumé

Nous présentons des approches expérimentales pour étudier RNA-Interactiens de bicaténaire RNA binding protéine kinase activée par RNA (PKR) durant le cycle cellulaire chez les mammifères, à l’aide de cellules HeLa. Cette méthode utilise le formaldéhyde pour crosslink RNA-PKR complexes et immunoprécipitation pour enrichir PKR lié aux ARN. Ces ARN peut être davantage analysé par séquençage haut-débit ou qRT-PCR.

Résumé

Protéine kinase activée par RNA (PKR) est membre des réponse immunitaire innée de protéines et reconnaît la double-brin structure secondaire de l’ARN viral. Lorsqu’elle est liée à l’ARN double brin (dsRNA) viral, PKR subit une dimérisation et autophosphorylation ultérieure. PKR phosphorylée (pPKR) devenue active et induit la phosphorylation de la sous-unité alpha du facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2α) pour supprimer la traduction globale. Augmentant la preuve suggère que la PKR peut être activé dans des conditions physiologiques tels que durant le cycle cellulaire ou dans diverses conditions de stress sans infection. Cependant, nos connaissances sur les activateurs de RNA de PKR est limitée en raison de l’absence d’une méthode expérimentale normalisée pour capturer et analyser PKR-interaction ARN doubles brins. Nous présentons ici un expérimental protocole d’enrichir et de les analyser PKR spécifiquement lié RNAs durant le cycle cellulaire en utilisant des cellules HeLa. Nous utilisons l’activité efficace de réticulation du formaldéhyde pour fixer les complexes ARN-PKR et isoler par immunoprécipitation. PKR co-immunoprécipitée ARN peut ensuite être transformés pour générer une bibliothèque de séquençage haut-débit. Une classe importante de PKR-interaction cellulaire ARN doubles brins est ARN mitochondrial (mtRNAs), qui peut prendre la forme intermoléculaire ARN doubles brins par interaction complémentaire entre le lourds-strand et la lumière-brin ARN. Afin d’étudier la présence de ces mtRNAs duplex, nous présentons également un protocole pour le volet spécifique qRT-PCR. Notre protocole est optimisé pour l’analyse de PKR lié aux ARN, mais il peut facilement être modifié afin d’étudier l’Arndb cellulaire ou RNA-Interactiens d’autres protéines de liaison des Arndb.

Introduction

Protéine kinase activée par RNA (PKR), kinase d’également connu sous le nom eucaryotes initiation factor 2-alpha 2 (EIF2AK2), est une kinase bien caractérisés qui transmet les informations fournies par les ARN. Il appartient à l’alpha de sous-unité d’initiation 2 traduction eucaryote (eIF2α) famille kinase et phosphoryle eIF2α à sérine 51 en réponse à l’infection pour supprimer la traduction globale1. Dans ce contexte, PKR est activé par l’ARN bicaténaire viral (ARN doubles brins), qui fournissent une plate-forme pour PKR dimérisation et autophosphorylation2. En plus d’eIF2α, PKR peut également phosphoryler p53, substrat de récepteur de l’insuline 1, inhibiteur κB et c-Jun N-terminal kinase (JNK) pour réguler l’activité de nombreux signal transduction pathways3,4,5, 6.

PKR a été initialement identifiée comme une kinase qui phosphorylé eIF2α au cours de l’infection par le poliovirus en reconnaissant ARN doubles brins7,8 des poliovirus. PKR se trouve de plus en plus à jouer un rôle aux multiples facettes au-delà de réponse immunitaire, et son activation aberrante ou le mauvais fonctionnement est impliqué dans nombreuses maladies humaines. Activé/Phosphorylated PKR (pPKR) est fréquemment observée au cours de l’apoptose et est une caractéristique commune des patients atteints de maladies dégénératives, en particulier les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington, maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer9 ,10,11,12,13. En outre, PKR est activé dans diverses conditions de stress tels que le stress métabolique et chaleur choc14,15,16,17. En revanche, l’inhibition de la PKR entraîne la prolifération cellulaire accrue et une transformation maligne même18,19. Fonction PKR est également importante dans le fonctionnement normal du cerveau et durant le cycle cellulaire comme le niveau de pPKR est élevée au cours de la phase de M20,21,22. Dans ce contexte, pPKR supprime la traduction globale et fournit des repères pour des systèmes de signalisation mitotiques clés qui sont nécessaires à la division cellulaire appropriée20. En outre, l’activation prolongée de PKR a entraîné en phase G2/M, arrêt du cycle cellulaire dans les ovaires de hamster chinois cellules23. Par conséquent, la phosphorylation de PKR est réglementée par la boucle de rétroaction négative afin d’assurer une désactivation rapide pendant M/G1 transition21.

Malgré la fonction du large éventail de PKR, notre compréhension de l’activation de PKR est limitée en raison de l’absence d’une approche expérimentale normalisée de haut-débit pour capturer et identifier les ARN doubles brins qui peut activer la PKR. Des études antérieures ont montré que la PKR peut interagir avec ARN doubles brins formé par deux inversée Alu répétitions (IRAlus)20,24, mais la possibilité de l’existence d’autres ARN doubles brins cellulaire qui peut activer la PKR durant le cycle cellulaire ou sous conditions de stress dans les cellules humaines était encore inexplorés. L’approche classique en identifiant RNA-Interactiens d’une protéine de liaison du RNA (RBP) utilise la lumière UV pour crosslink RNA-RBP complexes25,26,27. Une récente étude a appliqué cette approche de réticulation UV dans un système de souris et identifié que les petits ARN nucléolaires peut réguler activation de PKR lors de stress métabolique16. En utilisant la réticulation haute efficacité de formaldéhyde, nous avons présenté une méthode alternative pour identifier PKR-interacting RNAs durant le cycle cellulaire de cellules HeLa28. Une approche similaire a été appliquée à l’étude des autres dsRBPs telles que Staufen et Drosha29,30,31. Nous avons trouvé que PKR peut interagir avec différents types d’ARN non codants tels que court interspersed nuclear élément (sinus), long intercalés nucléaire élément (ligne), élément de rétrovirus endogènes (ERV) et même alpha-satellite RNAs. En outre, nous avons montré que la PKR peut interagir avec ARN mitochondrial (mtRNAs), qui forme intermoléculaire ARN doubles brins par interaction complémentaire entre les brins lourds et la lumière chapelet RNAs28. Une publication récente a aussi appuyé nos données que certains mtRNAs existent sous une forme recto verso et peut activer les capteurs de dsRNA comme protéine associée à la différenciation par mélanome 5 pour induire des interférons32. Plus important encore, l’expression et la localisation subcellulaire des mtRNAs sont modulés au cours du cycle cellulaire et de différents facteurs de stress, qui peut être important dans leur capacité à réguler la PKR activation28.

Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé pour une réticulation formaldéhyde récemment mis au point et l’immunoprécipitation (fCLIP) méthode pour capturer et analyser PKR-interacting RNAs durant le cycle cellulaire. Nous démontrons la méthode pour préparer les échantillons d’arrestation cycle cellulaire à l’aide de la thymidine et la nocodazole. Puis, nous présentons le processus fCLIP pour isoler PKR lié aux ARN et une méthode pour préparer la bibliothèque de séquençage haut débit afin d’identifier ces ARN. En outre, nous définissent des procédures détaillées pour analyser PKR lié aux ARN par qRT-PCR. Plus précisément, nous présentons une procédure de transcription inverse brin spécifique pour analyser la présence de mtRNAs. Le protocole décrit est optimisé pour les cellules HeLa et PKR, mais des étapes clés tels que la préparation de l’échantillon du cycle cellulaire, fCLIP et analyse volet spécifique qRT-PCR peuvent être facilement modifiées pour étudier l’Arndb cellulaire ou d’identifier des Interactiens de RNA d’autres dsRBPs.

Protocole

1. solution et cellule de préparation

  1. Préparation de la solution
    1. Pour le milieu de culture cellulaire, préparer milieu de culture cellulaire HeLa en ajoutant 50 mL de sérum fœtal (SVF) dans 500 mL du moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM).
      Remarque : Les antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu de culture cellulaire, mais nous n’utilisons pas d’antibiotiques.
    2. Pour le 0,1 % de paraformaldéhyde, dissoudre paraformaldéhyde à 4 % (p/v) dans 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) avec chauffage sur une plaque chauffante et diluer à faire 30 mL de paraformaldéhyde à 0,1 % (v/v) en ajoutant 1 x PBS.
      Attention : Effectuez toutes les opérations sous une hotte et veillez à ne pas faire bouillir la solution de paraformaldéhyde. Protéger la solution à 0,1 % de la lumière et conserver à 4 ° C. Utiliser la solution dans le mois.
      Nota : Le pH de la solution finale de paraformaldéhyde 0,1 % (v/v) devrait être autour de 7.
    3. Préparer le tampon de lyse fCLIP : 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5 % (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1 % (v/v) X-100 Triton, 0,1 % (v/v) dodécylsulfate de sodium (SDS) et le désoxycholate de sodium 0,1 % (p/v). Ajouter l’eau distillée triple (TDW) à 40 mL. Conserver à 4 ° C.
    4. Préparer le tampon de lavage fCLIP : 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 % (v/v) NP-40, 0,1 % (v/v) X-100 Triton, 0,1 % (v/v) SDS et 0,1 % (p/v) désoxycholate de sodium. Ajouter TDW à 40 mL. Conserver à 4 ° C.
    5. Préparer 4 x tampon PK : 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, EDTA de 40 mM et le SDS de 4 % (v/v). Ajouter TDW à 40 mL. Conserver à température ambiante.
    6. Préparer fCLIP tampon d’élution : 20 mL 4 x tampon PK 21 g d’urée et 8,5 mL de TDW. Préparer les frais.
    7. Préparer le tampon d’élution RNA : 0,3 M NaOAc et SDS de 2 % (p/v). Conserver à température ambiante.
    8. Préparer 2 x teinture chargement RNA : bleu de bromophénol 0.025 % (p/v), 0.025 % (p/v) de xylène cyanol, 5 mM EDTA, SDS de 0,05 % (p/v) et 95 % (v/v) formamide. Conserver à-20 ° C.
    9. Préparer 1 x TBE tampon : 0,089 M Tris-Borate et 0,002 M EDTA. Préparer 500 mL de tampon TBE.
  2. Préparation de cellules de phase-arrêté S ou M
    1. Semence ~ 750 000 ou ~ 1 000 000 HeLa cellules pour les échantillons arrêté à la phase S ou M, respectivement. La croissance de cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
    2. Traiter les cellules avec la thymidine 2 mM et incuber pendant 18 heures à 37 ° C.
    3. Laver les cellules deux fois avec du PBS. Ajouter des supports neufs et incuber pendant 9 h à 37 ° C.
    4. Pour les cellules de phase-arrêté S, traiter des cellules avec de la thymidine 2 mM. Pour les cellules de phase-arrêté M, traiter les cellules avec 100 ng/mL nocodazole. Incuber pendant 15 h à 37 ° C et récolte des cellules.
      Remarque : L’homogénéité des échantillons cycle cellulaire peut être vérifiée à l’aide de FACS.

2. formaldéhyde réticulation et immunoprécipitation

  1. Récolte de cellules
    1. Pour un échantillon de phase S, prélever des cellules avec un grattoir de cellules et les transférer dans un tube conique de 15 mL. Pour un échantillon de phase M, appuyez sur le côté de la boîte de Petri de cellule pour détacher des cellules de phase-arrêté de M et les transférer dans un tube conique de 15 mL.
      Remarque : Pour augmenter l’homogénéité des cellules M phase-arrêté, ne pas utiliser un grattoir de cellules.
    2. Centrifuger les cellules à 380 g à température ambiante pendant 3 min. retirer le surnageant et remettre en suspension avec 1 mL de PBS froid et le transfert dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    3. Centrifuger les cellules à 10 000 x g à 4 ° C pendant 30 s. enlever le surnageant complètement.
  2. Réticulation de formaldéhyde
    1. Ajouter 750 μL de paraformaldéhyde 0,1 % pendant 10 min à température ambiante pour fixer les cellules.
    2. Ajouter 250 μL de glycine de 1 M et incuber une supplémentaire de 10 min à température ambiante pour étancher la réaction. Centrifuger les cellules à 10 000 x g à 4 ° C pendant 30 s. enlever le surnageant complètement.
    3. Remettre en suspension avec 1 mL de PBS. Centrifuger les cellules à 10 000 x g à 4 ° C pendant 30 s et enlever le surnageant.
    4. Remettre en suspension avec 400 μl de tampon de lyse fCLIP additionné de 2 % (v/v) inhibiteur de RNase et de 0,2 % (v/v) inhibiteur de la protéase. Incuber sur glace pendant 10 min et laisser agir à l’aide d’un ultrasonicator.
    5. Ajouter 11 μL de 5 M de NaCl pour ajuster la concentration de NaCl à ~ 150 mM. Vortex brièvement et centrifuger à x 21 130 g à 4 ° C pendant 15 min. transférer le liquide surnageant dans un tube de microcentrifuge préalablement réfrigérées 1,5 mL.
      NOTE : Conserver 40 μL de surnageant dans un tube à centrifuger de nouveau que l’échantillon d’entrée. Conserver l’échantillon d’entrée à 4 ° C.
  3. Immunoprécipitation
    1. Ajouter 20 μL de billes de protéine A dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    2. Laver les billes avec 400 μl de tampon de lyse fCLIP. Centrifuger les perles à 1 000 x g à 4 ° C pendant 1 min. retirer le surnageant et ajouter 400 μL de tampon de lyse fCLIP soigneusement. Doucement remettre en suspension les perles en les retournant 3 ~ 4 fois.
    3. Répétez l’étape de lavage trois fois. Après le lavage final, retirez complètement le surnageant.
    4. Remettre en suspension les perles dans 300 μL de tampon de lyse fCLIP. Ajouter 8,3 μL de 5 M de NaCl pour ajuster la concentration de NaCl à ~ 150 mM. Ajouter 10 μL d’anticorps PKR et incuber pendant 3 h sur un rotateur à 4 ° C.
    5. Centrifuger les perles à 1 000 x g à 4 ° C pendant 1 min. retirer le surnageant et ajouter 400 μL de tampon de lavage fCLIP. Doucement remettre en suspension les perles en les retournant 3 ~ 4 fois.
    6. Répétez l’étape de lavage deux fois. Après le lavage final, retirez complètement le surnageant.
      Remarque : N’utilisez jamais un vortex. Il faut inverser le tube doucement avec les mains.
    7. Ajouter 300 μl de lysat et incuber pendant 3 h à 4 ° C sur un agitateur.
      NOTE : Les temps d’incubation plus long peuvent entraîner liaison fond accrue.
    8. Centrifuger les perles à 1 000 x g à 4 ° C pendant 1 min. retirer le surnageant et ajouter 400 μL de tampon de lavage fCLIP. Doucement remettre en suspension les perles en les retournant 3 ~ 4 fois.
    9. Répétez l’étape de lavage trois fois. Après le lavage final, retirez complètement le surnageant.
    10. Ajouter 300 μl de tampon d’élution fCLIP. Incuber dans un thermomixer pendant 3 h à 25 ° C pour éluer PKR depuis les perles.
      NOTE : Préparez le frais de tampon d’élution fCLIP.
    11. Centrifuger à 1 000 g à la température ambiante et transférer le surnageant dans un tube de mastic propre.
      NOTE : Un tube de microcentrifuge est OK aussi, mais le tube de mastic est préférable pour éviter l’évaporation au cours de l’étape de-réticulation (étape 2.3.12).
    12. Ajouter 300 μl de protéinase K (20 mg/mL) et incuber une nuit à 65 ° C.
      Remarque : Utiliser un thermomixer avec couverture chauffée pour éviter l’évaporation.
  4. Extraction de l’ARN
    1. Ajoutez 580 μL d’acide-phénol chloroforme et vortex pendant 30 s. incuber à 37 ° C pendant 1 h.
    2. Vortexer pendant 30 s et centrifuger à 12 000 x g à température ambiante pendant 10 min.
    3. Transférer la couche supérieure dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 1/10 volume de 3M NaOAc, 0,5 μL de coprecipitant (p. ex., Glycoblue) et un volume égal d’isopropanol. Incuber une nuit à-20 ° C.
    4. Précipiter les granulés par centrifugation à la vitesse maximale à 4 ° C pendant 1 h.
      Remarque : Si granulés ARN/ADN n’ont pas été observés, ajouter un μL 0.5 supplémentaire de coprecipitant et centrifuger pendant une 1 h supplémentaire. continuer cette étape jusqu'à ce que les boulettes de l’ARN/ADN sont observées.
    5. Retirez le surnageant et ajouter 1 mL d’alcool éthylique de 75 %. Centrifuger à 12 000 x g à 4 ° C pendant 5 min. Répétez l’étape de lavage une fois de plus. Retirez le surnageant complètement et sécher le culot à la température ambiante.
    6. Ajouter 42 μL de TDW, 5 μL de DNase I mettre en mémoire tampon, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 2 μL de DNase I. incuber à 37 ° C pendant 1 h.
    7. Ajouter 150 μl de TDW et 200 μL d’acide-phénol chloroforme. Vortex pour 30 à s. centrifuger à 12 000 x g à température ambiante pendant 10 min.
    8. Transférer la couche supérieure dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 20 μL de 3 M Acona, 0,5 μL de coprecipitant et 1 mL d’alcool éthylique à 100 %. Incuber une nuit à-80 ° C.
    9. Précipiter les boulettes et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5.
    10. Remettre en suspension dans la quantité appropriée de TDW.

3. séquençage bibliothèque préparation

  1. suppression de l’ARNr
    1. Remettre en suspension les pellets de RNA de l’étape 2.4.10 avec 28 μL de TDW.
      Remarque : Le montant maximal de l’ARN total doit être inférieur à 5 μg.
    2. Suivre les procédures prévues par le guide de référence du kit de suppression de l’ARNr pour enlever les ARNr.
    3. Nettoyer les ARNr appauvri RNAs en ajoutant 160 μL de billes magnétiques.
      1. Mélanger en pipettant également, environ 15 fois et incuber à température ambiante pendant 15 min.
      2. Fixer le tube sur un barreau magnétique et éliminer le surnageant.
      3. Ajouter 300 μL de 80 % d’alcool éthylique, tandis que les perles soient encore attachées sur la barre aimantée et incuber pendant 30 s.
      4. Remplacer l’alcool éthylique avec une solution fraîche de 300 μL. Sécher à l’air les perles sur le Barreau magnétique pendant 12 min à température ambiante.
      5. Remettre en suspension les perles dans 12 μL de TDW et mélanger en pipettant également 15 fois.
      6. Fixer les perles sur la barre aimantée et déplacer le surnageant dans un tube PCR propre.
    4. Appauvrissent la fragmenté RNAs ribosomal (ARNr) suivant les procédures fournies par ARNr appauvrissement Kit.
    5. Nettoyer l’ARN en ajoutant 110 μL de billes magnétiques et étapes répétant 3.1.3.1 à 3.1.3.6.
  2. Ligature d’étiquetage et de l’adaptateur de RNA
    1. Sur appauvri ARNr ARN, ajouter 2 μL de tampon de x CIAP 10, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 2 μL de la phosphatase alcaline Antarctique. Incuber à 37 ° C pendant 1 h, puis à 65 ° C pendant 5 min inactiver la phosphatase.
    2. Ajouter 3 μL de tampon de x PNK 10, 1,5 μL d’inhibiteur de RNase, 1,5 μL d’enzyme T4 PNK, 0,8 μL de r-ATP et 1,7 μL de TDW. Incuber à 37 ° C pendant 50 min.
    3. Ajouter 1,5 μL d’ATP 10 mM et incuber à 37 ° C pendant plu 40 min.
    4. Arrêter la réaction en ajoutant 170 μL de tampon d’élution de la RNA.
    5. Ajouter 200 μL d’acide-phénol chloroforme et vortex pour 30 à s. centrifuger à 12 000 x g à température ambiante pendant 10 min.
    6. Transférer la couche supérieure dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 20 μL de 3 M Acona, 0,5 μL de coprecipitant et 1 mL d’alcool éthylique à 100 %. Incuber une nuit à-80 ° C.
    7. Précipiter les pastilles de RNA et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5. Remettre en suspension dans le 4,5 μL de TDW et ajouter 9 μL de 2 x colorant de chargement de RNA.
    8. Chauffer l’échantillon à 95 ° C pendant 5 min et charge sur un gel d’urée-PAGE 10 %.
    9. Exécutez le gel à 370 V pendant 40 min.
      Remarque : Exécutez avant le gel à 370 V pendant 90 min avant le chargement de l’échantillon.
    10. Coupez le gel à la région de nucléotides ~ 100 – 500, briser le gel.
    11. Ajouter 700 μL de 0,3 M de NaCl et incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
    12. Transvaser la solution dans une colonne et une centrifugeuse à vitesse maximum à température ambiante pendant 5 min.
    13. Transférer l’éluat dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 1/10 volume de 3M NaOAc, 0,5 μL de coprecipitant et un volume égal d’isopropanol. Incuber une nuit à-20 ° C.
  3. 3' la ligature adaptateur
    1. Précipiter les pastilles de RNA et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5.
    2. Remettre en suspension les pellets RNA dans 6,5 μL de TDW et ajouter 1 μL de 10 μM 3' adaptateur.
    3. Transvaser la solution dans un tube PCR et incuber à 70 ° C pendant 2 min.
    4. Ajouter 1 μL de tampon de ligature 10 x 0,5 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de ligase d’ARN T4 2. Incuber à 28 ° C pendant 1 h, 25 ° C pendant 6 h et 22 ° C pendant 6 h.
    5. Ajouter 12 μL de 2 x colorant de chargement de RNA et de chaleur à 95 ° C pendant 5 min.
    6. Gel de purifier la 3' adaptateur ligaturé RNAs comme décrit dans 3.2.9 à 3.2.13.
  4. 5' la ligature adaptateur
    1. Précipiter les pastilles de RNA et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5.
    2. Remettre en suspension les pellets RNA dans 4,2 μL de TDW et ajouter 1 μL de 5 μM 5' adaptateur.
    3. Transvaser la solution dans un tube PCR et incuber à 70 ° C pendant 2 min.
    4. Ajouter 0,8 μL de tampon de ligase 10 x, 0,4 μL d’inhibiteur de RNase, 0,8 μL d’ATP, 0,8 μL de ligase d’ARN T4 1 10 mM. Incuber à 28 ° C pendant 1 h, 25 ° C pendant 6 h et 22 ° C pendant 6 h.
  5. La transcription inverse et amplification par PCR
    1. Sur 5' adaptateur ligaturés RNAs, ajouter 1 μL d’apprêt de transcription inverse 4 μM. Incuber à 70 ° C pendant 2 minutes et les refroidir immédiatement à 4 ° C.
    2. Ajouter 4 μL de tampon de FS x 5, 4 μL de 2,5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M TNT, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de la transcriptase inverse. Incuber à 50 ° C pendant 1 h et 70 ° C pendant 15 min.
    3. Préparer l’amplification par PCR
      1. Mélanger 1 μL de produit de RT, 1 μL d’apprêt RPI 25 μM, 1 μL d’apprêt de RP1 25 μM, 10 μL de 5 x tampon HF, 4 μL de 2,5 mM dNTP, 32,5 μL de TDW et 0,5 μL de polymérase de haute fidélité.
      2. Exécutez le programme PCR pour 11 ~ 13 cycles.
        NOTE : Le programme pour l’ACP est : 98 ° C pendant 30 s pour un démarrage à chaud, 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 45 s pour amplification et 72 ° C pendant 5 min. L’étape d’amplification est répétée pour les cycles de 11-13.
    4. Nettoyer les produits PCR utilisant 40 μL des billes magnétiques et étapes suivantes 3.1.3.1 à 3.1.3.6 mais 10 μL de TDW pour éluer l’ADN.
    5. Ajouter 2 μl de colorant de chargement 10 x ADN. Charger l’échantillon sur un gel de 6 % d’acrylamide et exécuter à 200 V pendant 30 min.
    6. Tache avec Sybr gold (0,01 % (v/v) dans 1 x TBE tampon) pendant 5 min à température ambiante.
    7. Se détachant dans 1 x TBE tampon pendant 5 min à température ambiante.
    8. Couper le gel à la région de nucléotides ~ 200-700 et briser le gel.
    9. Ajouter 700 μL de 0,3 M de NaCl et incuber une nuit à température ambiante pour éluer l’ADN.
    10. Charger le tout sur une colonne et une centrifugeuse à vitesse maximum à température ambiante pendant 5 min.
    11. Transférer l’éluat dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 1/10 volume de 3M NaOAc, 0,5 μL de coprecipitant et un volume égal d’isopropanol. Incuber une nuit à-20 ° C.
    12. Précipiter l’ADN granulés et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5. Remettre en suspension dans 20 μL de TDW.
    13. Analyser l’échantillon à l’aide d’un séquenceur.

4. analyse de PKR-interacting RNAs par qRT-PCR

  1. Méthode 1 : Hexamère aléatoire transcription inverse
    1. Remettre en suspension pastilles RNA de l’étape 2.4.10 avec 8,5 μl de TDW et transvaser la solution dans un tube de PCR.
    2. Ajouter 0,5 μL d’hexamères aléatoire de 100 μM et 4 μL de mélange dNTP 2,5 mM.
    3. Chaleur la solution à 65 ° C pendant 5 min et immédiatement incuber sur glace pendant au moins 1 minute.
    4. Faites la réaction de mélange : 4 μL de tampon de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM TNT, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de la transcriptase inverse (200 U/μl). Ajouter le mélange de la réaction à la solution RNA.
    5. Incuber le mélange à 23 ° C pendant 10 min, 50 ° C pendant 10 min et 80 ° C pendant 10 min.
    6. Analyser le cDNA utilisant un système PCR en temps réel.
      NOTE : Le programme pour la PCR en temps réel est : 95 ° C pendant 3 min pour le démarrage à chaud, 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 10 s pour amplification et 95 ° C pendant 30 s, 65 ° C pendant 30 s et 95 ° C pendant 30 s pour faire fondre. L’étape d’amplification est répétée pendant 40 cycles.
  2. Méthode 2 : Volet spécifique transcription inverse
    1. Préparer un mélange maître d’amorces inverses : mélange de quantités égales d’amorces spécifiques de la transcription inverse de gène contenant la séquence promotrice CMV suivies de ~ 20 nucléotides des séquences spécifiques de gènes.
      Remarque : La concentration et combinée de toutes les amorces spécifiques à gène RT est de 4 μM.
    2. Remettre en suspension pastilles RNA de l’étape 2.4.10 avec 8,5 μl de TDW et transvaser la solution dans un tube de PCR.
    3. Ajouter 0,5 μL de mélange principal de 4 μM d’amorces de transcription inverse et 4 μL de mélange dNTP 2,5 mM.
    4. Chaleur la solution à 65 ° C pendant 5 min et immédiatement incuber sur glace pendant au moins 1 minute.
    5. Préparer la solution de réaction en mélangeant 4 μL de tampon de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM TNT, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de la transcriptase inverse (200 U/μl). Ajouter la solution de réaction à la préparation d’amorce d’ARN.
    6. Incuber la solution à 50 ° C pendant 10 min et 80 ° C pendant 10 min.
    7. Analyser le cDNA utilisant le système PCR en temps réel.
      NOTE : Le programme pour la PCR en temps réel est la même que celle décrite dans la méthode 1.

Résultats

Un schéma pour le procédé à l’arrestation de cellules HeLa lors de la phase S ou M du cycle cellulaire est illustré à la Figure 1. Pour un échantillon de phase-arrêté M, nous pouvons visualiser clairement les ronds en forme cellules au microscope (Figure 2 a). Afin d’examiner l’efficacité de l’arrêt du cycle cellulaire, le contenu de la cellule en nucléaire peut être analysé à l’aide de FACS (Figure 2 b). ...

Discussion

Le processus de préparation d’échantillons de phase-arrêté S ou M est illustré à la Figure 1. Pour arrêter les cellules en phase S, nous avons utilisé une méthode de double bloc de thymidine où nous avons traité des cellules avec de la thymidine deux fois avec une sortie de 9 h entre les deux pour assurer l’arrestation haute efficacité (Figure 1 a). Arrestation de phase M, nous avons traité les cellules une fois avec de la thymidine suivie d’u...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la base Science Research Program grâce à la fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen, ministère de la Science et de la TIC (fro-2016R1C1B2009886).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 LightForward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 LightForward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 HeavyForward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 LightForward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamerThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
Sodium dedecyl sulfateBiosesangS1010
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18080093Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18090010Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stainThermo Fisher ScientificS11494
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sepharose beadsThermo Fisher Scientific22810Protein A beads
UltrasonicatorBioruptor
UreaBio-basicUB0148
Vortex mixerDAIHAN ScientificVM-10
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)PerkinElmerBLU502A100UC

Références

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