JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем экспериментальные подходы для изучения РНК посредники протеинкиназы привязки двуцепочечной РНК РНК активированный (PKR) во время млекопитающих клеточного цикла, используя НеЬа клетки. Этот метод использует формальдегида crosslink РНК-PKR комплексов и иммунопреципитации обогатить PKR-прыгните РНК. Эти РНК могут быть далее проанализированы через высокопроизводительного секвенирования или qRT-PCR.

Аннотация

Протеинкиназа РНК активированный (PKR) является членом врожденной иммунной реакции белков и признает вторичную структуру двунитевая вирусная РНК. При привязке к вирусной двуцепочечные РНК (двуцепочечных РНК), PKR проходит димеризации и последующего autophosphorylation. Фосфорилированный PKR (pPKR) становится активной и вызывает фосфорилирование альфа-Субблок эукариотических инициации фактор 2 (eIF2α) для подавления глобальной перевод. Все больше фактов свидетельствует о том, что PKR может быть активирован при физиологических условиях такие как во время клеточного цикла или при различных условиях стресса без инфекции. Однако наше понимание РНК возбудителей PKR ограниченной из-за отсутствия стандартизированной экспериментальный метод для захвата и анализа взаимодействия PKR двуцепочечных РНК. Здесь мы представляем экспериментальный протокол конкретно обогатить и анализировать PKR связаны РНК в течение клеточного цикла с использованием клеток HeLa. Мы используем эффективный сшивки активность формальдегида исправить PKR-РНК комплексов и изолировать их через иммунопреципитации. PKR co-immunoprecipitated РНК может быть дополнительно обработаны для создания высокопроизводительного секвенирования библиотеки. Один из основных класс PKR-взаимодействующих сотовой двуцепочечных РНК является митохондриальной РНК (mtRNAs), которые могут существовать как межмолекулярных двуцепочечных РНК путем дополнительного взаимодействия между стренги тяжелых и легких нить РНК. Для изучения strandedness эти дуплекс mtRNAs, мы также представляем протокол для нити специфически qRT-PCR. Наш протокол оптимизирован для анализа PKR-прыгните РНК, но могут быть легко изменены для изучения клеточных двуцепочечных РНК или РНК посредники других двуцепочечной ДНК-связывающих белков.

Введение

Протеинкиназа РНК активированный (PKR), также известный как эукариотические инициации фактор 2-альфа киназа 2 (EIF2AK2), является хорошо изученных протеинкиназы, который передает информацию, представленную РНК. Он принадлежит к эукариотических перевод посвящения 2 субъединицы альфа (eIF2α) семейство киназы и фосфорилирует eIF2α на Серин 51 в ответ на инфекцию подавить глобальной перевод1. В этом контексте PKR активируется вирусный двуцепочечные РНК (двуцепочечных РНК), которые обеспечивают платформу для PKR димеризации и autophosphorylation2. В дополнение к eIF2α PKR можно также фосфорилировать p53, субстрат рецепторов инсулина 1, ингибитор κB и c-Jun N-терминальный киназы (JNK) регулировать деятельность многочисленных сигнала трансдукции пути3,4,5, 6.

PKR первоначально была определена как киназы, что фосфорилированных eIF2α во время инфекции полиовируса, признав полиовируса двуцепочечных РНК7,8. PKR чаще играть многогранной роли за пределами иммунного ответа, и его аномальным активации или неисправности подразумевается в многочисленных заболеваний человека. Активирован/Phosphorylated PKR (pPKR) часто наблюдается во время апоптоз и является общей характеристикой больных дегенеративных заболеваний, особенно нейродегенеративных заболеваний, таких как Хантингтона, Parkinson's и болезнь Альцгеймера9 ,10,11,12,13. Кроме того PKR активируется при различных условиях стресса как метаболический стресс и теплового шока14,,1516,17. С другой стороны ингибирование PKR приводит к увеличению пролиферации и даже злокачественной трансформации18,19. PKR функция также имеет важное значение функции нормального мозга и во время цикла клетки как уровень pPKR повышенной во время М этап20,21,22. В этом контексте pPKR подавляет глобальной перевод и предоставляет подсказки ключевых митотическая сигнальных систем, которые необходимы для надлежащего разделения клетки20. Кроме того длительной активации PKR привела к фазы G2/М, арест клеточного цикла в яичнике китайского хомячка клетки23. Следовательно PKR фосфорилирование регулируется отрицательной обратной связи для обеспечения быстрого отключения во время М/G1 перехода21.

Несмотря на широкий диапазон PKR функция наше понимание PKR активации ограничен из-за отсутствия стандартизированной высок объём экспериментальный подход для сбора и идентификации двуцепочечных РНК, которые можно активировать PKR. Предыдущие исследования показали, что PKR могут взаимодействовать с двуцепочечных РНК, образованный двумя Перевернутый Alu повторяется (IRAlus)20,24, но возможность существования дополнительных клеточных двуцепочечных РНК, которые можно активировать PKR во время цикла клетки или под условиях стресса в клетках человека был неизученными. Обычный подход при выявлении РНК посредники белок РНК (ОДП) использует УФ свет crosslink РНК-ОДП комплексы25,,2627. Недавнее исследование применяется этот подход УФ сшивки в системе мыши и определили, что малые ядрышковые РНК может регулировать PKR активации во время метаболический стресс16. Используя высокие сшивки эффективность формальдегида, мы представили альтернативный метод для определения PKR-взаимодействующих РНК в течение цикла клетки НеЬа клетки28. Аналогичный подход применялся для изучения других dsRBPs например Штауфен и Drosha29,,30-31. Мы обнаружили, что PKR могут взаимодействовать с различными типами некодирующей RNAs такие как короткие перемежаются ядерный элемент (синус), длинные перемежаются ядерный элемент (строка), эндогенного ретровируса элемент (ERV) и даже альфа спутник РНК. Кроме того мы показали, что PKR могут взаимодействовать с митохондриальных РНК (mtRNAs), который формы межмолекулярных двуцепочечных РНК путем дополнительного взаимодействия между стренги тяжелых и легких нить РНК28. Недавние публикации далее поддержали наши данные, что некоторые mtRNAs существуют в дуплексной форме и может активировать dsRNA датчиков, таких как меланома дифференциация связанный белок 5 побудить интерферонов32. Что еще более важно выражение и внутриклеточных локализации mtRNAs модулируются течение клеточного цикла и на различные раздражители, которые могут быть важными в их способность регулировать PKR активации28.

В этой статье, мы представляем подробный протокол для сшивки недавно разработанных формальдегида и иммунопреципитации (fCLIP) метод для захвата и анализа PKR-взаимодействующих РНК в течение клеточного цикла. Мы демонстрируем метод для подготовки образцов арест клеточного цикла с использованием тимидин и Нокодазол. Затем мы представляем fCLIP процесс, чтобы изолировать PKR-прыгните РНК и метод подготовки высокопроизводительного секвенирования библиотеки для идентификации этих молекул РНК. Кроме того мы определить подробные процедуры для анализа PKR-прыгните РНК с помощью qRT ПЦР. В частности мы представляем стренги конкретных обратной транскрипции процедуры для анализа strandedness mtRNAs. Описывается протокол оптимизирован для НеЬа клетки и PKR, но основные шаги, такие, как подготовка образца клеточного цикла, fCLIP и нити конкретных qRT ПЦР-анализа могут быть легко изменены для изучения клеточных двуцепочечных РНК или для определения РНК посредники других dsRBPs.

протокол

1. решения и ячейки подготовка

  1. Подготовка решения
    1. Для средних культуры клеток Подготовьте среднего для культуры клеток HeLa, добавляя 50 мл плода бычьим сывороточным (ФБС) 500 мл Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM).
      Примечание: Антибиотики могут быть добавлены в среде культуры клеток, но мы не использовать антибиотики.
    2. Для параформальдегида 0,1%, растворяют параформальдегида 4% (w/v) 1 x Phosphate-Buffered солевой (PBS) с нагревом на горячей плите и разбавленных сделать 30 мл 0,1% (v/v) параформальдегида, добавив ПБС.
      Предупреждение: Выполнить все шаги в зонта и будьте осторожны, чтобы не кипятите раствор параформальдегида. Защищать от света 0,1% раствор и хранить при 4 ° C. Используйте решение в течение одного месяца.
      Примечание: pH окончательного решения параформальдегида 0,1% (v/v) должна быть около 7.
    3. Подготовка буфера lysis fCLIP: 20 мм трис-HCl (рН 7,5), 15 NaCl, 10 мм ЭДТА, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) X-100 Тритон, лаурилсульфат натрия 0,1% (v/v) (SDS) и Дезоксихолат натрия 0,1% (w/v). Добавьте тройной дистиллированной воды (TDW) 40 мл. Хранить при 4 ° C.
    4. Подготовка fCLIP мыть буфера: 20 мм трис-HCl (рН 7,5), 150 NaCl, ЭДТА 10 мм, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) X-100 Тритон, 0,1% (v/v) SDS и 0,1% (w/v) Дезоксихолат натрия. Добавьте TDW 40 мл. Хранить при 4 ° C.
    5. Подготовка 4 x PK буфера: 400 мм трис-HCl (рН 7,5), 200 мм NaCl, ЭДТА 40 мм и 4% (v/v) SDS. Добавьте TDW 40 мл. Хранить при комнатной температуре.
    6. Подготовка fCLIP Элюирующий буфер: 20 мл 4 x PK буфер, 21 г мочевины и 8,5 мл TDW. Подготовьте свежие.
    7. Подготовить РНК Элюирующий буфер: 0.3 M NaOAc и SDS 2% (w/v). Хранить при комнатной температуре.
    8. 2 x РНК загрузки краситель подготовиться: 0,025% (w/v) бромфеноловый синий, ксилол 0,025% (w/v) cyanol, 5 мм ЭДТА, 0,05% (w/v) SDS и формамид 95% (v/v). Хранить при температуре от-20 ° C.
    9. Подготовка 1 x TBE буфера: 0,089 М трис-боратов и 0,002 М ЭДТА. Подготовка 500 мл буфера КЭ.
  2. Подготовка S или M клеток, фаза арестован
    1. Семя 750 000 ~ или ~ 1000000 НеЬа клетки S или M фаза арестован образцы, соответственно. Рост клеток при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
    2. Лечить клетки с тимидина 2 мм и проинкубируйте 18 ч при 37 ° C.
    3. Вымойте клетки два раза с PBS. Добавить свежие СМИ и проинкубируйте 9 ч при 37 ° C.
    4. Для S фазу арестован, ячейками клетки с тимидина 2 мм. Для M фаза арестован клетки лечить клетки с 100 нг/мл Нокодазол. Инкубируйте 15 ч при 37 ° C и хлебоуборка клетки.
      Примечание: Однородности выборок клеточного цикла может быть проверена с помощью СУИМ.

2. формальдегид cross-linking и иммунопреципитации

  1. Ячейка урожай
    1. Пример фазы S Соберите клетки с скребок клетки и передачи в коническую пробирку 15 мл. M фазы образец нажмите сторону клетки культуры блюдо для отсоединения M фаза арестован клетки и передачи их в коническую пробирку 15 мл.
      Примечание: Для повышения однородности M фазы арестован клеток, не использовать скребок ячейки.
    2. Центрифуга клетки на 380 x g при комнатной температуре 3 мин удалить супернатант и вновь приостановить с 1 мл холодного PBS и передачи в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    3. Центрифуга клетки на 10000 x g при 4 ° C за 30 с. удалить супернатант полностью.
  2. Сшивки формальдегида
    1. Добавьте 750 мкл параформальдегида 0.1% 10 мин при комнатной температуре, чтобы исправить клетки.
    2. Добавьте 250 мкл 1 М глицин и инкубировать еще 10 мин при комнатной температуре, чтобы утолить реакции. Центрифуга клетки на 10000 x g при 4 ° C за 30 с. удалить супернатант полностью.
    3. Вновь приостановить с 1 мл раствора PBS. Центрифуга клетки на 10000 x g при 4 ° C на 30 s и удалить супернатант.
    4. Вновь приостановить с 400 мкл буфера lysis fCLIP дополнена ингибитор протеазы 0,2% (v/v) и 2% (v/v) АБС битор РНКазы. Инкубируйте на льду за 10 мин и sonicate с помощью ultrasonicator.
    5. Добавьте 11 мкл 5 М NaCl для регулировки концентрации NaCl ~ 150 мм. Вихревой кратко и центрифуги на 21,130 x g при 4 ° C на 15 мин передать предварительно охлажденные 1,5 мл microcentrifuge супернатант.
      Примечание: Сохраните 40 мкл супернатант в новых пластиковых пробирок образца ввода. Храните образца ввода при 4 ° C.
  3. Иммунопреципитация
    1. Добавьте 20 мкл белок А бисера в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Вымойте бусины с 400 мкл буфера lysis fCLIP. Центрифуга бусы на 1000 x g при 4 ° C в течение 1 мин удалить супернатант и добавить 400 мкл буфера lysis fCLIP тщательно. Аккуратно вновь приостановить бисер, инвертирование 3 ~ 4 раза.
    3. Мыть Повторите три раза. После окончательной стирки полностью удалите супернатант.
    4. Вновь приостановите бисер в 300 мкл буфера lysis fCLIP. Добавление 8.3 мкл 5 М NaCl для регулировки концентрации NaCl ~ 150 мм. Добавить 10 мкл антител PKR и Инкубируйте 3 h на вращателе при 4 ° C.
    5. Центрифуга бусы на 1000 x g при 4 ° C в течение 1 мин удалить супернатант и добавить 400 мкл буфера мытья fCLIP. Аккуратно вновь приостановить бисер, инвертирование 3 ~ 4 раза.
    6. Повторите шаг мыть два раза. После окончательной стирки полностью удалите супернатант.
      Примечание: Никогда не использовать вихревой смеситель. Инвертируйте трубку осторожно с руки.
    7. Добавить 300 мкл lysate и Инкубируйте 3 ч при температуре 4 ° C на вращателе.
      Примечание: Длительное время инкубации может привести к увеличению фон привязки.
    8. Центрифуга бусы на 1000 x g при 4 ° C в течение 1 мин удалить супернатант и добавить 400 мкл буфера мытья fCLIP. Аккуратно вновь приостановить бисер, инвертирование 3 ~ 4 раза.
    9. Мыть Повторите три раза. После окончательной стирки полностью удалите супернатант.
    10. Добавьте 300 мкл буфера fCLIP. Инкубируйте в thermomixer 3 часа при 25 ° C до элюировать PKR из бисера.
      Примечание: Подготовьте свежие fCLIP Элюирующий буфер.
    11. Центрифуга на 1000 x g при комнатной температуре и передачи супернатант чистой силицированного трубки.
      Примечание: Пробки microcentrifuge это также нормально, но силицированного трубка предпочтителен для предотвращения испарения во время де сшивки шаг (шаг 2.3.12).
    12. Добавить 300 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и Инкубируйте на ночь на 65 ° C.
      Примечание: Используйте thermomixer с подогревом крышкой, чтобы избежать испарения.
  4. Извлечение RNA
    1. Добавьте 580 мкл хлороформ кислота фенола и вихрь 30 s. инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
    2. Вихрь 30 s и центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре за 10 мин.
    3. Перевести верхний слой в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл. Добавьте 1/10 объема 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant (например, Glycoblue), и равный объем изопропанола. Инкубируйте на ночь при-20 ° C.
    4. Осадок гранулы центрифугированием на максимальной скорости на 4 ° C на 1 час.
      Примечание: Если РНК/ДНК гранулы не наблюдалось, добавьте дополнительные 0,5 мкл coprecipitant и центрифуги для дополнительного 1 ч. продолжить этот шаг до тех пор, пока гранулы РНК/ДНК наблюдаются.
    5. Удалить супернатант и добавить 1 мл 75% этилового спирта. Центрифуга на 12000 x g при 4 ° C за 5 минут повторите шаг мыть еще один раз. Полностью удалить супернатант и сухие гранулы при комнатной температуре.
    6. Добавьте 42 мкл TDW, 5 мкл DNase буфере, 1 мкл битор РНКазы и 2 мкл DNase I. инкубации при 37 ° C в течение 1 ч.
    7. Добавьте 150 мкл TDW и 200 мкл кислота фенола хлороформ. Вихрь 30 s. центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре за 10 мин.
    8. Перевести верхний слой в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл. Добавьте 20 мкл 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant и 1 мл 100% этилового спирта. Инкубируйте на ночь на-80 ° C.
    9. Осадок окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5.
    10. Вновь приостановите в соответствующее количество TDW.

3. последовательность библиотеки подготовка

  1. Удаление рРНК
    1. Вновь приостановите РНК гранулы из шага 2.4.10 с 28 мкл TDW.
      Примечание: Максимальное количество всего РНК должно быть меньше 5 мкг.
    2. Следуйте процедурам, предусмотренным в комплект удаления рРНК справочное руководство для удаления рРНК.
    3. Очистить рРНК истощены РНК, добавив 160 мкл магнитных шариков.
      1. Смешать, закупорить ~ 15 раз и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
      2. Подсоедините трубку на магнитной полосе и удалить супернатант.
      3. Добавить 300 мкл 80% этилового спирта, в то время как бусы по-прежнему придает на магнитный бар и Инкубируйте 30 s.
      4. Замените этилового спирта на свежий раствор 300 мкл. Воздух сухой бусы на магнитный бар для 12 мин при комнатной температуре.
      5. Вновь приостановите бисер в 12 мкл TDW и микс, закупорить 15 раз.
      6. Прикрепите бусы на магнитный бар и переместить супернатант чистой ПЦР-пробирку.
    4. Разрушающим фрагментированных рибосомная РНК (теорией) после процедур, предусмотренных рРНК истощения Kit.
    5. Очистка РНК, добавив 110 мкл магнитных шариков и повторяющиеся шаги 3.1.3.1 для 3.1.3.6.
  2. РНК маркировки и адаптер лигирование
    1. На истощенных рРНК РНК добавьте 2 мкл 10 x CIAP буфера, 1 мкл битор РНКазы и 2 мкл Антарктики щелочной фосфатазы. Инкубируйте при 37 ° C для 1 h и затем при 65 ° C за 5 минут, чтобы инактивировать фосфатазы.
    2. Добавьте 3 мкл 10 x PNK буфера, 1.5 мкл битор РНКазы, 1.5 мкл фермента, 0,8 мкл r-СПС и 1.7 мкл TDW T4 ПНК. Инкубируйте при 37 ° C 50 мин.
    3. Добавить 1,5 мкл 10 мм СПС и инкубировать при 37 ° C для дополнительных 40 мин.
    4. Остановите реакции, добавив 170 мкл буфера РНК.
    5. Добавьте 200 мкл хлороформ кислота фенола и вихрь 30 s. центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре за 10 мин.
    6. Перевести верхний слой в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл. Добавьте 20 мкл 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant и 1 мл 100% этилового спирта. Инкубируйте на ночь на-80 ° C.
    7. Осадок РНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5. Вновь приостановить в 4,5 мкл TDW и добавить 9 мкл 2 x РНК загрузки красителя.
    8. Тепло образца при 95 ° C за 5 мин и нагрузки на 10% мочевина-страница гель.
    9. Побегите гель на 370 V 40 мин.
      Примечание: Предварительно запустить геля на 370 V 90 мин до загрузки образца.
    10. Вырезать гель в регионе ~ 100 – 500 нуклеотидов и разорвать геля.
    11. Добавить 700 мкл 0,3 М NaCl и инкубировать на ночь при 4 ° C на ротатора.
    12. Передача решения для столбца и центрифуги на максимальной скорости при комнатной температуре в течение 5 мин.
    13. Передача в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл элюата. Добавьте 1/10 объема 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant, и равный объем изопропанола. Инкубируйте на ночь при-20 ° C.
  3. 3' адаптер лигирование
    1. Осадок РНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5.
    2. Вновь приостановить РНК окатышей в 6,5 мкл TDW и добавить 1 мкл 10 мкм 3' адаптер.
    3. Передача решения в ПЦР-пробирку и Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин.
    4. Добавьте 1 мкл 10 x лигирование буфера, 0.5 мкл битор РНКазы и 1 мкл T4 РНК лигаза 2. Инкубируйте на 28 ° C в течение 1 ч, 25 ° C для 6 h и 22 ° C в течение 6 ч.
    5. Добавьте 12 мкл 2 x РНК загрузки красителя и тепла при 95 ° C за 5 мин.
    6. Гель для очистки 3' адаптер лигируют РНК, как описано в 3.2.9 для 3.2.13.
  4. 5' адаптер лигирование
    1. Осадок РНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5.
    2. Вновь приостановить РНК окатышей в 4.2 мкл TDW и добавить 1 мкл 5 мкм 5' адаптер.
    3. Передача решения в ПЦР-пробирку и Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин.
    4. Добавление 0,8 мкл 10 x лигаза буфера, 0.4 мкл битор РНКазы, 0,8 мкл 10 мм АТФ, 0,8 мкл T4 РНК лигаза 1. Инкубируйте на 28 ° C в течение 1 ч, 25 ° C для 6 h и 22 ° C в течение 6 ч.
  5. Обратная транскрипция и амплификации PCR
    1. На 5' адаптер перевязаны РНК, добавить 1 мкл 4 мкм грунта обратной транскрипции. Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин и Остудите до 4 ° C.
    2. Добавьте 4 мкл 5 x FS буфера, 4 мкл dNTP 2,5 мм, 1 мкл DTT 0,1 М, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы. Инкубируйте на 50 ° C для 1 h и 70 ° C на 15 мин.
    3. Подготовить амплификации PCR
      1. Смешайте 1 мкл RT продукта, 1 мкл 25 мкм ИРЦ грунтовки, 1 мкл 25 мкм RP1 грунтовки, 10 мкл 5 x ВЧ буфера, 4 мкл dNTP 2,5 мм, 32.5 мкл TDW и 0,5 мкл высокой верности полимеразы.
      2. Запустите программу ПЦР для 11 ~ 13 циклов.
        Примечание: Программа для ПЦР является: 98 ° C за 30 s для горячего старта, 98 ° C 10 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 45 s для усиления и 72 ° C за 5 мин. Шаг амплификации повторяется для 11-13 циклов.
    4. Очистите продукты PCR используя 40 мкл магнитные бусы и следующие шаги 3.1.3.1 для 3.1.3.6, но с помощью 10 мкл TDW элюировать ДНК.
    5. Добавьте 2 мкл 10 x ДНК загрузки красителя. Загрузить образец на гель акриламида 6% и запустить в 200 V за 30 мин.
    6. Пятно с золотом (0,01% (v/v) в 1 x TBE буфера) Sybr за 5 мин при комнатной температуре.
    7. Снять пятно в 1 x TBE буфер для 5 мин при комнатной температуре.
    8. Вырезать гель в регионе ~ 200 – 700 нуклеотидов и разорвать геля.
    9. Добавить 700 мкл 0,3 М NaCl и инкубировать на ночь при комнатной температуре для элюировать ДНК.
    10. Загрузите все на столбец и центрифуги на максимальной скорости при комнатной температуре в течение 5 мин.
    11. Передача в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл элюата. Добавьте 1/10 объема 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant, и равный объем изопропанола. Инкубируйте на ночь при-20 ° C.
    12. Осадок ДНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5. Вновь приостановите в 20 мкл TDW.
    13. Анализ образца с помощью программы sequencer.

4. анализ PKR-взаимодействующих РНК с помощью qRT ПЦР

  1. Метод 1: Случайные hexamer обратная транскрипция
    1. Вновь приостановить РНК гранулы из шага 2.4.10 с 8,5 мкл TDW и передать решение ПЦР-пробирку.
    2. Добавьте 0,5 мкл 100 мкм случайных hexamers и 4 мкл 2,5 мм dNTP смеси.
    3. Тепла раствор при 65 ° C за 5 минут и немедленно инкубировать на льду, по крайней мере 1 мин.
    4. Сделать смесь реакции: 4 мкл 5 x SSIV буфера, 1 мкл, 100 мм DTT, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл). Добавьте в смесь реакции решение РНК.
    5. Инкубировать смеси при 23 ° C в течение 10 мин, 50 ° C за 10 мин и 80 ° C в течение 10 мин.
    6. Анализируйте cDNA, с использованием системы PCR реального времени.
      Примечание: Программа для ПЦР в реальном времени является: 95 ° C 3 мин для горячего старта, 95 ° C за 5 s и 60 ° C для 10 s для усиления и 95 ° C за 30 s, 65 ° C для 30 s и 95 ° C за 30 s для расплава. Шаг амплификации повторяется для 40 циклов.
  2. Метод 2: Strand конкретных обратная транскрипция
    1. Подготовка мастер смесь обратного грунты: смесь равных количеств праймеров конкретных обратной транскрипции гена, содержащие ЦМВ промоутер последовательности следуют ~ 20 нуклеотиды гена специфических последовательностей.
      Примечание: Комбинированные концентрация всех генов конкретных RT грунты-4 мкм.
    2. Вновь приостановить РНК гранулы из шага 2.4.10 с 8,5 мкл TDW и передать решение ПЦР-пробирку.
    3. Добавьте 0,5 мкл 4 мкм мастер смесь праймеров обратной транскрипции и 4 мкл 2,5 мм dNTP смеси.
    4. Тепла раствор при 65 ° C за 5 минут и немедленно инкубировать на льду, по крайней мере 1 мин.
    5. Приготовляют раствор реакции путем смешивания 4 мкл 5 x SSIV буфера, 1 мкл, 100 мм DTT, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл). Добавьте решение реакции в структуре РНК праймер.
    6. Инкубируйте решение при 50 ° C за 10 мин и 80 ° C в течение 10 мин.
    7. Анализируйте cDNA, с использованием системы PCR реального времени.
      Примечание: Программа для ПЦР в реальном времени аналогично описанному в методе 1.

Результаты

Схема для ареста НеЬа клетки в S или M фазы клеточного цикла процесса показан на рисунке 1. M фазы арестован пример мы можем четко визуализировать круглой формы клетки под микроскопом (рис. 2A). Для изучения эффективности арест клеточного цикла, ядерных с...

Обсуждение

В процессе для подготовки S или M фаза арестован образцы иллюстрируется на рисунке 1. Арестовать клеток в S фазе, мы использовали метод двойной блок тимидина где мы относились клетки с тимидина два раза с 9 h выпуска между ними, чтобы обеспечить арест высокой эффективности (...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана основные программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется корейским правительством министерства науки и ИКТ (СР 2016R1C1B2009886).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 LightForward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 LightForward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 HeavyForward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 LightForward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamerThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
Sodium dedecyl sulfateBiosesangS1010
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18080093Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18090010Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stainThermo Fisher ScientificS11494
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sepharose beadsThermo Fisher Scientific22810Protein A beads
UltrasonicatorBioruptor
UreaBio-basicUB0148
Vortex mixerDAIHAN ScientificVM-10
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)PerkinElmerBLU502A100UC

Ссылки

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145qRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены