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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Vi presentiamo approcci sperimentali per studi interattori di RNA double-stranded RNA binding della chinasi di proteina RNA-attivato (PKR) durante il ciclo cellulare dei mammiferi utilizzando cellule HeLa. Questo metodo utilizza la formaldeide a crosslink RNA-PKR complessi e immunoprecipitazione per arricchire associato a PKR RNAs. Questi RNA possono essere ulteriormente analizzati mediante sequenziamento ad alte prestazioni o qRT-PCR.

Abstract

Protein chinasi attivata da RNA (PKR) è un membro della risposta immunitaria innata di proteine e riconosce la struttura secondaria del doppio filamento di RNA virale. Quando associato a virale RNA double-stranded (dsRNA), PKR subisce la dimerizzazione e successive autophosphorylation. PKR fosforilato (pPKR) diventa attivo e induce la fosforilazione della subunità alfa di fattore di iniziazione eucariotica 2 (eIF2α) per sopprimere traduzione globale. La prova aumentante suggerisce che PKR può essere attivato in condizioni fisiologiche, come durante il ciclo cellulare o in varie condizioni di stress senza infezione. Tuttavia, la nostra comprensione degli attivatori RNA di PKR è limitata a causa della mancanza di un metodo sperimentale standardizzata per acquisire e analizzare RNAds PKR-interazione. Qui, presentiamo un sperimentale protocollo specificamente arricchire e analizzare PKR associato RNAs durante il ciclo cellulare utilizzando cellule HeLa. Utilizziamo l'attività di reticolazione efficiente di formaldeide per risolvere complessi PKR-RNA e isolarli tramite immunoprecipitazione. PKR co-immunoprecipitate RNAs poi possono essere ulteriormente elaborati per generare una libreria di sequenziamento ad alte prestazioni. Una classe importante di PKR-interazione cellulare RNAds è RNA mitocondriale (mtRNAs), che può esistere come intermolecolari RNAds attraverso l'interazione complementare tra il pesante-strand e il RNAs luce-strand. Per studiare la strandedness di questi mtRNAs duplex, presentiamo anche un protocollo per la qRT-PCR strand-specific. Il nostro protocollo è ottimizzato per l'analisi di RNA associati a PKR, ma può essere facilmente modificato per studiare cellulare RNAds o RNA-interattori delle altre proteine che legano il dsRNA.

Introduzione

Protein chinasi attivata da RNA (PKR), chinasi di iniziazione eucariotica noto anche come fattore 2-alfa 2 (EIF2AK2), è una chinasi di proteina ben caratterizzati che trasmette informazioni fornite da RNA. Appartiene all'alfa subunità iniziazione 2 traduzione negli eucarioti (eIF2α) famiglia delle chinasi fosforila eIF2α a serina 51 in risposta all'infezione di sopprimere traduzione globale1. In questo contesto, PKR è attivato da virale RNA double-stranded (dsRNA), che fornisce una piattaforma per PKR dimerizzazione e autophosphorylation2. Oltre a eIF2α, PKR anche può fosforilare p53, insulina recettore substrato 1, inibitore κB e c-Jun N-terminal kinase (JNK) di regolare l'attività di numerosi segnale trasduzione vie3,4,5, 6.

PKR è stata originariamente identificata come una chinasi che fosforilata eIF2α durante l'infezione del virus polio attraverso il riconoscimento RNAds7,8 dei virus polio. PKR è sempre trovato a giocare ruoli poliedrico oltre la risposta immunitaria, e la sua attivazione aberrante o malfunzionamento è implicato in numerose malattie umane. Attivato/Phosphorylated PKR (pPKR) è osservata frequentemente durante l'apoptosi ed è una caratteristica comune dei pazienti con di malattie degenerative, in particolare malattie neurodegenerative come il morbo di Huntington, morbo di Parkinson ed il morbo di Alzheimer di9 ,10,11,12,13. Inoltre, PKR è attivato in varie condizioni di stress come stress metabolico e calore shock14,15,16,17. D'altra parte, l'inibizione di PKR provoca aumento della proliferazione cellulare e trasformazione maligna anche18,19. Funzione PKR è importante anche nella funzione normale del cervello e durante il ciclo cellulare come il livello di pPKR è elevato durante la fase di M20,21,22. In questo contesto, pPKR sopprime traduzione globale e fornisce spunti per sistemi di segnalazione mitotic chiave necessari per la corretta divisione cellulare20. Inoltre, attivazione prolungata di PKR provocato dalla fase G2/M23celle di arresto del ciclo cellulare in ovaia cinese del criceto. Di conseguenza, la fosforilazione di PKR è regolata dal ciclo di feedback negativo per garantire la rapida disattivazione durante la transizione di G1/M21.

Nonostante la funzione di vasta gamma di PKR, la nostra comprensione dell'attivazione di PKR è limitata a causa della mancanza di un approccio sperimentale ad alta produttività standardizzato per catturare e identificare dsRNA che può attivare PKR. Precedenti studi hanno mostrato che PKR può interagire con RNAds formata da due invertito Alu ripetizioni (IRAlus)20,24, ma la possibilità dell'esistenza di ulteriori RNAds cellulare che può attivare PKR durante il ciclo cellulare o sotto condizioni di stress nelle cellule umane è stato esplorato. L'approccio convenzionale nell'identificare RNA-Interactiani di una proteina obbligatoria del RNA (RBP) utilizza la luce UV a crosslink RNA-RBP complessi25,26,27. Uno studio recente ha applicato questo approccio di reticolazione UV in un sistema di mouse e identificato che small nucleolar RNA può regolare l'attivazione di PKR durante lo sforzo metabolico16. Utilizzando la reticolazione ad alta efficienza di formaldeide, abbiamo presentato un metodo alternativo per identificare PKR-interacting RNA durante il ciclo cellulare di cellule HeLa28. Un approccio simile è stato applicato per studiare altri dsRBPs come Staufen e Drosha29,30,31. Abbiamo trovato che PKR può interagire con vari tipi di RNA non codificanti come breve elemento nucleare sparpagliato (SINE), lunga sparpagliato elemento nucleare (linea), elemento di retrovirus endogeno (ERV) e anche alfa-satellite RNAs. Inoltre, abbiamo mostrato che PKR può interagire con il RNA mitocondriale (mtRNAs), quale forma intermolecolari RNAds attraverso l'interazione complementare tra la luce e il pesante-strand filo RNAs28. Una recente pubblicazione supportata ulteriormente i nostri dati che alcuni mtRNAs esistere in una forma duplex e può attivare sensori di dsRNA come proteina di differenziazione-collegata del melanoma 5 per indurre gli interferoni32. Ancora più importante, l'espressione e la localizzazione subcellulare di mtRNAs sono modulati durante il ciclo cellulare e di vari fattori di stress, che può essere importante nella loro capacità di regolare l'attivazione di PKR28.

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per una reticolazione formaldeide sviluppata di recente e immunoprecipitazione (fCLIP) metodo per acquisire e analizzare PKR-interacting RNA durante il ciclo cellulare. Dimostriamo il metodo per preparare campioni di arresto del ciclo cellulare usando timidina e nocodazole. Presentiamo quindi il processo di fCLIP per isolare associato a PKR RNAs e un metodo per preparare la biblioteca di sequenziamento ad alte prestazioni per identificare questi RNA. Inoltre, abbiamo delineare le procedure dettagliate per analizzare associato a PKR RNA mediante qRT-PCR. In particolare, presentiamo una procedura di trascrizione inversa strand-specifico per analizzare la strandedness di mtRNAs. Il protocollo descritto è ottimizzato per le cellule HeLa e PKR, ma passaggi chiave quali la preparazione del campione di ciclo cellulare, fCLIP e analisi specifiche del filo qRT-PCR possono essere facilmente modificati per studiare cellulare RNAds o per identificare gli interattori di RNA di altri dsRBPs.

Protocollo

1. soluzione e cella preparazione

  1. Preparazione della soluzione
    1. Per il mezzo di coltura cellulare, preparare il supporto per la coltura delle cellule HeLa aggiungendo 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di Medium per volta dell'Aquila di Dulbecco (DMEM).
      Nota: Gli antibiotici possono essere aggiunti al terreno di coltura delle cellule, ma non usiamo gli antibiotici.
    2. Per il 0,1% di paraformaldeide, sciogliere paraformaldeide al 4% (p/v) in 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) con riscaldamento su un piatto caldo e diluire a fare 30 mL di 0,1% (v/v) paraformaldeide aggiungendo 1X PBS.
      Attenzione: Eseguire tutti i passaggi in una cappa aspirante e fare attenzione a non far bollire la soluzione di paraformaldeide. Proteggere la soluzione 0,1% dalla luce e conservare a 4 ° C. Utilizzare la soluzione entro un mese.
      Nota: Il pH della soluzione di paraformaldeide 0.1% (v/v) finale dovrebbe essere circa 7.
    3. Preparare il tampone di lisi di fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0.1% (v/v) X-100 Triton, 0.1% (v/v) sodio dodecil solfato (SDS) e 0,1% (p/v) sodio desossicolato. Aggiungere acqua distillata tripla (TDW) a 40 mL. Conservare a 4 ° C.
    4. Preparare il tampone di lavaggio di fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% (v/v) NP-40, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (v/v) SDS e 0,1% (p/v) sodio desossicolato. Aggiungere TDW a 40 mL. Conservare a 4 ° C.
    5. Preparare 4 x buffer di PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA e SDS 4% (v/v). Aggiungere TDW a 40 mL. Conservare a temperatura ambiente.
    6. Preparare il tampone di eluizione di fCLIP: 20 mL di buffer di PK, 21 g di urea e 8,5 mL di TDW: 4x. Preparare fresco.
    7. Preparare il tampone di eluizione di RNA: 0,3 M NaOAc e SDS 2% (p/v). Conservare a temperatura ambiente.
    8. Preparare 2 x tintura di caricamento del RNA: 0.025% (p/v) azzurro del bromofenolo, 0.025% (p/v) xilene cianolo, 5 mM di EDTA, 0,05% (p/v) SDS e formammide 95% (v/v). Conservare a-20 ° C.
    9. Preparare 1 x TBE tampone: 0.089 M Tris-borato e 0,002 M EDTA. Preparare 500 mL di tampone TBE.
  2. Preparazione delle cellule di fase-arrestato S o M
    1. Seme ~ 750.000 o ~ 1.000.000 cellule di HeLa per campioni arrestato in fase S o M, rispettivamente. Crescere le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h.
    2. Trattare le cellule con timidina 2mm e incubare per 18 h a 37 ° C.
    3. Lavare le cellule due volte con PBS. Aggiungi media fresco e incubare per 9 h a 37 ° C.
    4. Per cellule di fase-arrestato S, trattare le cellule con timidina 2 mM. Per cellule di fase-arrestato M, trattare le cellule con 100 ng/mL nocodazole. Incubare per 15 h a 37 ° C e raccolto le cellule.
      Nota: L'omogeneità dei campioni ciclo cellulare può essere controllato usando FACS.

2. formaldeide cross-linking e immunoprecipitazione

  1. Colture di cellule
    1. Per un esempio di fase S, raccogliere le cellule con un raschietto di cella e il trasferimento in una provetta conica da 15 mL. Per un esempio di fase M, tocca il lato della piastra di coltura cellulare per staccare le cellule di fase-arrestato M e trasferirli in una provetta conica da 15 mL.
      Nota: Per aumentare l'omogeneità delle cellule M fase-arrestato, non usare un raschietto di cella.
    2. Centrifugare le cellule a 380 x g a temperatura ambiente per 3 minuti rimuovere il surnatante e risospendere con 1 mL di PBS freddo e il trasferimento in una microcentrifuga da 1,5 mL.
    3. Centrifugare le cellule a 10.000 x g a 4 ° C per 30 s. rimuovere il surnatante completamente.
  2. Reticolazione di formaldeide
    1. Aggiungere 750 μL di 0,1% paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente per fissare le cellule.
    2. Aggiungere 250 µ l di 1 M glicina e incubare per altri 10 min a temperatura ambiente per placare la reazione. Centrifugare le cellule a 10.000 x g a 4 ° C per 30 s. rimuovere il surnatante completamente.
    3. Risospendere con 1 mL di PBS. Centrifugare le cellule a 10.000 x g a 4 ° C per 30 s e rimuovere il surnatante.
    4. Risospendere con 400 μL di tampone di lisi fCLIP completati con inibitore di proteasi di 0,2% (v/v) e del 2% (v/v) inibitore della RNAsi. Incubare in ghiaccio per 10 min e sottoporre ad ultrasuoni utilizzando un ultrasonicatore.
    5. Aggiungere 11 μL di 5 M di NaCl per regolare la concentrazione di NaCl a ~ 150 mM. Vortex brevemente e centrifugare a 21.130 x g a 4 ° C per 15 min. trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL pre-refrigerati.
      Nota: Conservare 40 μL del surnatante in una nuova provetta da centrifuga come l'esempio di input. Conservare il campione di ingresso a 4 ° C.
  3. Immunoprecipitazione
    1. Aggiungere 20 μL di perle di proteina A in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Lavare le perle con 400 μL di tampone di lisi di fCLIP. Centrifugare le perline a 1.000 x g a 4 ° C per 1 min. rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL di tampone di lisi fCLIP attentamente. Risospendere delicatamente le perline capovolgendo 3 ~ 4 volte.
    3. Ripetere il passaggio di lavare tre volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante completamente.
    4. Risospendere le sfere in 300 μL di tampone di lisi di fCLIP. Aggiungere 8.3 μL di 5 M di NaCl per regolare la concentrazione di NaCl a ~ 150 mM. Aggiungere 10 μL di anticorpo PKR e incubare per 3 ore su un rotore a 4 ° C.
    5. Centrifugare le perline a 1.000 x g a 4 ° C per 1 min. rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL di tampone di lavaggio di fCLIP. Risospendere delicatamente le perline capovolgendo 3 ~ 4 volte.
    6. Ripetere il passaggio di lavaggio due volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante completamente.
      Nota: Non utilizzare mai un Vortex. Capovolgere la provetta delicatamente con le mani.
    7. Aggiungere 300 μL di lisato e incubare per 3 ore a 4 ° C in un rotatore.
      Nota: Tempo di incubazione più lungo può provocare aumento rilegatura.
    8. Centrifugare le perline a 1.000 x g a 4 ° C per 1 min. rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL di tampone di lavaggio di fCLIP. Risospendere delicatamente le perline capovolgendo 3 ~ 4 volte.
    9. Ripetere il passaggio di lavare tre volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante completamente.
    10. Aggiungere 300 μL di tampone di eluizione di fCLIP. Incubare in un thermomixer per 3 h a 25 ° C per eluire PKR dalle perle.
      Nota: Preparare il fresco di tampone di eluizione fCLIP.
    11. Centrifugare a 1.000 x g a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in una provetta pulita siliconata.
      Nota: Un tubo del microcentrifuge anche è ok, ma tubo siliconato è preferito per evitare l'evaporazione durante il passaggio di de-reticolazione (passaggio 2.3.12).
    12. Aggiungere 300 μL di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare per una notte a 65 ° C.
      Nota: Utilizzare un thermomixer con coperchio riscaldato per evitare l'evaporazione.
  4. Estrazione del RNA
    1. Aggiungere 580 μL di acido-fenolo cloroformio e vortex per 30 s. Incubare a 37 ° C per 1 h.
    2. Vortexare per 30 s e centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente per 10 min.
    3. Trasferire lo strato superiore in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 1/10 di volume di 3M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant (ad esempio, Glycoblue) e un uguale volume di isopropanolo. Incubare per una notte a-20 ° C.
    4. Precipitare pellet mediante centrifugazione a velocità massima a 4 ° C per 1 h.
      Nota: Se non sono stati osservati il pellet di RNA/DNA, aggiungere un ulteriore 0,5 μL di coprecipitant e centrifugare per un ulteriore 1 h. continua questo passaggio fino a pellet di RNA/DNA sono osservati.
    5. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di alcool etilico al 75%. Centrifugare a 12.000 x g a 4 ° C per 5 min, ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. Rimuovere il surnatante completamente ed asciugare il pellet a temperatura ambiente.
    6. Aggiungere 42 μL di TDW, 5 μL di dnasi buffer, 1 μL di RNAsi inibitore e 2 μL della dnasi I. Incubare a 37 ° C per 1 h.
    7. Aggiungere 150 μL di TDW e 200 μL di acido-fenolo cloroformio. Vortexare per 30 s. Centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente per 10 min.
    8. Trasferire lo strato superiore in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 20 μL di 3 M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e 1 mL di alcool etilico al 100%. Incubare per una notte a-80 ° C.
    9. Precipitare il pellet e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5.
    10. Risospendere in quantità adeguata di TDW.

3. sequenziamento libreria preparazione

  1. rimozione di rRNA
    1. Risospendere il pellet di RNA dal passaggio 2.4.10 con 28 μL di TDW.
      Nota: La quantità massima di RNA totale dovrebbe essere meno di 5 μg.
    2. Seguire le procedure previste dalla Guida di riferimento del kit rRNA rimozione rimuovere rRNA.
    3. Ripulire il rRNA impoverito RNAs aggiungendo 160 μL di biglie magnetiche.
      1. Mescolare pipettando ~ 15 volte e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
      2. Fissare il tubo su una barra magnetica e rimuovere il surnatante.
      3. Aggiungere 300 μL di alcol etilico 80% mentre le perle sono ancora attaccate sulla barra magnetica ed incubare per 30 s.
      4. Sostituire l'alcool etilico con un fresco 300 μL di soluzione. Asciugare all'aria le perle sulla barra magnetica per 12 min a temperatura ambiente.
      5. Risospendere le sfere in 12 μL di TDW e mescolare pipettando 15 volte.
      6. Fissare le perline sulla barra magnetica e spostare il surnatante in una provetta pulita di PCR.
    4. Riducono i frammentato RNA ribosomiale (rRNA) seguendo le procedure fornite da rRNA svuotamento Kit.
    5. Ripulire il RNAs aggiungendo 110 µ l di biglie magnetiche e ripetuti passaggi 3.1.3.1 a 3.1.3.6.
  2. Legatura di etichettatura e adattatore di RNA
    1. Il rRNA-vuotati RNAs, aggiungere 2 μL di tampone di x CIAP 10, 1 μL di inibitore di RNAsi e 2 μL di fosfatasi alcalina Antartico. Incubare a 37 ° C per 1 h e quindi a 65 ° C per 5 min inattivare la fosfatasi.
    2. Aggiungere 3 μL di tampone di x PNK 10, 1.5 μL di inibitore di RNasi, 1.5 μL di enzima T4 PNK, 0,8 μL di r-ATP e 1,7 μL di TDW. Incubare a 37 ° C per 50 min.
    3. Aggiungere 1,5 μL di 10 mM ATP e incubare a 37 ° C per altri 40 min.
    4. Fermare la reazione aggiungendo 170 μL di tampone di eluizione di RNA.
    5. Aggiungere 200 μL di acido-fenolo cloroformio e vortex per 30 s. Centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente per 10 min.
    6. Trasferire lo strato superiore in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 20 μL di 3 M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e 1 mL di alcool etilico al 100%. Incubare per una notte a-80 ° C.
    7. Precipitare il pellet di RNA e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5. Risospendere in 4,5 μL di TDW e aggiungere 9 μL di 2 x tintura di caricamento del RNA.
    8. Riscaldare il campione a 95 ° C per 5 min e carico su un gel di Urea-pagina 10%.
    9. Esegua il gel a 370 V per 40 min.
      Nota: pre-Eseguire gel a 370 V per 90 min prima di caricare il campione.
    10. Tagliare il gel alla regione del nucleotide ~ 100 – 500 e rompere il gel.
    11. Aggiungere 700 μL di 0,3 M di NaCl e incubare per una notte a 4 ° C in un rotatore.
    12. Trasferire la soluzione in una colonna e centrifugare a massima velocità a temperatura ambiente per 5 min.
    13. Trasferire l'eluato in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 1/10 di volume di 3M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e un uguale volume di isopropanolo. Incubare per una notte a-20 ° C.
  3. 3' la legatura adattatore
    1. Precipitare il pellet di RNA e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5.
    2. Risospendere il pellet di RNA in 6,5 μL di TDW e aggiungere 1 μL di 10 3' adattatore di μM.
    3. Trasferire la soluzione in una provetta PCR e incubare a 70 ° C per 2 min.
    4. Aggiungere 1 μL di tampone di legatura 10 x 0,5 μL di inibitore di RNAsi e 1 μL di ligasi T4 RNA 2. Incubare a 28 ° C per 1 h, 25 ° C per 6 h e 22 ° C per 6 h.
    5. Aggiungere 12 μL di 2 x RNA loading dye e calore a 95 ° C per 5 min.
    6. Gel di purificare il 3' adattatore legato RNAs come descritto in 3.2.9 per 3.2.13.
  4. 5' la legatura adattatore
    1. Precipitare il pellet di RNA e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5.
    2. Risospendere il pellet di RNA in 4,2 μL di TDW e aggiungere 1 μL di adattatore 5' μM 5.
    3. Trasferire la soluzione in una provetta PCR e incubare a 70 ° C per 2 min.
    4. Aggiungere 0,8 μL di tampone di 10 x ligasi, 0,4 μL di inibitore di RNasi, 0,8 μL di 10 mM ATP, 0,8 μL della ligasi T4 RNA 1. Incubare a 28 ° C per 1 h, 25 ° C per 6 h e 22 ° C per 6 h.
  5. Trascrizione d'inversione e l'amplificazione di PCR
    1. Il 5' adattatore legati RNAs, aggiunga 1 μL di primer di trascrizione inversa 4 μM. Incubare a 70 ° C per 2 min e immediatamente raffreddare a 4 ° C.
    2. Aggiungere 4 μL di buffer di 5 x FS, 4 μL di 2,5 mM dNTP, 1 μL di DTT 0.1 M, 1 μL di inibitore di RNAsi e 1 μL della trascrittasi inversa. Incubare a 50 ° C per 1 h e 70 ° C per 15 min.
    3. Preparare l'amplificazione di PCR
      1. Mescolare 1 μL di prodotto di RT, 1 μL di primer RPI 25 μM, 1 μL di primer di RP1 25 μM, 10 μL di 5 x HF buffer, 4 μL di 2,5 mM dNTP, 32,5 μL di TDW e 0,5 μL della polimerasi ad alta fedeltà.
      2. Eseguire il programma PCR per 11 ~ 13 cicli.
        Nota: Il programma per la PCR è: 98 ° C per 30 s per un avvio a caldo, 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 45 s per l'amplificazione e 72 ° C per 5 min. Il passo di amplificazione viene ripetuto per 11-13 cicli.
    4. Ripulire i prodotti di PCR con 40 μL dei branelli magnetici e passaggi seguenti 3.1.3.1 a 3.1.3.6 ma utilizzando 10 μL di TDW per eluire il DNA.
    5. Aggiungere 2 μL di 10 della tintura di caricamento del DNA di x. Caricare il campione su un gel di acrilammide 6% ed eseguire a 200 V per 30 min.
    6. Macchia con Sybr gold (0,01% (v/v), 1 x TBE buffer) per 5 min a temperatura ambiente.
    7. De-macchia in 1 x TBE tampone per 5 min a temperatura ambiente.
    8. Tagliare il gel alla regione del nucleotide ~ 200 – 700 e rompere il gel.
    9. Aggiungere 700 μL di 0,3 M di NaCl e incubare per una notte a temperatura ambiente per eluire il DNA.
    10. Tutto il carico su una colonna e centrifugare a massima velocità a temperatura ambiente per 5 min.
    11. Trasferire l'eluato in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 1/10 di volume di 3M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e un uguale volume di isopropanolo. Incubare per una notte a-20 ° C.
    12. Precipitare DNA pellet e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5. Risospendere in 20 μL di TDW.
    13. Analizzare il campione con un sequencer.

4. analisi di PKR-interacting RNA mediante qRT-PCR

  1. Metodo 1: Random hexamer trascrizione inversa
    1. Risospendere il pellet di RNA dal passaggio 2.4.10 con 8,5 μL di TDW e trasferire la soluzione in una provetta PCR.
    2. Aggiungere 0,5 μL di 100 μM random esameri e 4 μL di miscela del dNTP 2,5 mM.
    3. Calore la soluzione a 65 ° C per 5 min e immediatamente Incubare in ghiaccio per almeno 1 min.
    4. Fare la reazione della miscela: 4 μL di tampone di x SSIV 5, 1 μL di 100 mM DTT, 1 μL di RNAsi inibitore e 1 μL della trascrittasi inversa (200 U/μL). Aggiungere il mix di reazione per la soluzione di RNA.
    5. Incubare la miscela a 23 ° C per 10 min, 50 ° C per 10 min e 80 ° C per 10 min.
    6. Analisi del cDNA usando un sistema PCR in tempo reale.
      Nota: Il programma per la PCR in tempo reale è: 95 ° C per 3 min per avviamento a caldo, 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 10 s per amplificazione e 95 ° C per 30 s, 65 ° C per 30 s e 95 ° C per 30 s per fusione. Il passo di amplificazione viene ripetuto per 40 cicli.
  2. Metodo 2: Strand-specifiche trascrizione inversa
    1. Preparare un mix master di iniettori d'inversione: Mix uguali quantità di primer specifici d'inversione della trascrizione genica contenente la sequenza del promotore CMV seguita da ~ 20 nucleotidi di specifiche sequenze geniche.
      Nota: La concentrazione combinata di tutti i primer specifici di RT gene è 4 μM.
    2. Risospendere il pellet di RNA dal passaggio 2.4.10 con 8,5 μL di TDW e trasferire la soluzione in una provetta PCR.
    3. Aggiungere 0,5 μL di mix master di 4 μM di primers di trascrizione inversa e 4 μL di miscela del dNTP 2,5 mM.
    4. Calore la soluzione a 65 ° C per 5 min e immediatamente Incubare in ghiaccio per almeno 1 min.
    5. Preparare la soluzione di reazione con 4 μL di tampone di x SSIV 5, 1 μL di 100 mM DTT, 1 μL di RNAsi inibitore e 1 μL della trascrittasi inversa (200 U/μL). Aggiungere la soluzione di reazione per il mix di primer di RNA.
    6. Incubare la soluzione a 50 ° C per 10 min e 80 ° C per 10 min.
    7. Analisi del cDNA usando il sistema PCR in tempo reale.
      Nota: Il programma per la PCR in tempo reale è uguale a quella descritta nel metodo 1.

Risultati

Uno schema per il processo di arrestare le cellule HeLa nella fase S o M del ciclo cellulare è illustrato nella Figura 1. Per un esempio di fase-arrestato M, possiamo visualizzare chiaramente cellule rotonde a forma sotto il microscopio (Figura 2A). Per esaminare l'efficienza dell'arresto del ciclo cellulare, il contenuto nucleare della cellula possa essere analizzato usando FACS (Figura 2B). La figura 3 Mostra dati rapp...

Discussione

Il processo per preparare campioni di fase-arrestato S o M è illustrato nella Figura 1. Per arrestare le cellule in fase S, abbiamo usato un metodo di blocco doppio timidina dove abbiamo trattato le cellule con timidina due volte con un rilascio di 9 h in mezzo per garantire arresto ad alta efficienza (Figura 1A). Per arresto di fase M, abbiamo trattato le cellule una volta con timidina seguita da un rilascio di 9 h e poi applicato nocodazole alle cellule di bl...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dal programma di base scienza ricerca attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal governo coreano Ministero delle scienze e TIC (NRF-2016R1C1B2009886).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 LightForward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 LightForward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 HeavyForward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 LightForward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamerThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
Sodium dedecyl sulfateBiosesangS1010
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18080093Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher Scientific18090010Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stainThermo Fisher ScientificS11494
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sepharose beadsThermo Fisher Scientific22810Protein A beads
UltrasonicatorBioruptor
UreaBio-basicUB0148
Vortex mixerDAIHAN ScientificVM-10
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM)PerkinElmerBLU502A100UC

Riferimenti

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