Induire la parodontite apicale chez les souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour induire localement la parodontite apical chez les souris. Nous montrons comment percer un trou dans la dent de la souris et exposer sa pulpe, afin de provoquer une inflammation locale. Des méthodes d'analyse pour étudier la nature de cette inflammation, telles que le micro-CT et l'histologie, sont également démontrées.

Résumé

Les mécanismes impliqués dans l'inflammation induite locale peuvent être étudiés utilisant plusieurs modèles animaux disponibles. L'un d'eux est l'induction de la parodontite apicale (AP). La parodontite apicale est une pathologie commune d'une nature inflammatoire dans les tissus parodontaux entourant la racine de la dent. Afin de mieux comprendre la nature et le mécanisme de cette pathologie, il est avantageux d'effectuer la procédure chez la souris. L'induction de cette inflammation odontogénique est réalisée en perçant dans la dent de la souris jusqu'à ce que la pulpe dentaire soit exposée. Ensuite, la pulpe dentaire reste exposée à être contaminée par la flore buccale naturelle au fil du temps, causant une parodontite apaïque. Après cette période, l'animal est sacrifié, et la dent et l'os de la mâchoire peuvent être analysés de diverses façons. Les analyses typiques incluent la formation image de micro-CT (pour évaluer la résorption d'os), la coloration histologique, l'immunohistochimie, et l'expression d'ARN. Ce protocole est utile pour la recherche dans le domaine de la biologie orale pour mieux comprendre ce processus inflammatoire dans un cadre expérimental in vivo avec des conditions uniformes. La procédure nécessite une manipulation soigneuse des souris et de la mâchoire isolée, et une démonstration visuelle de la technique est utile. Tous les aspects techniques des procédures conduisant à la parodontite apaïque induite et sa caractérisation dans un modèle de souris sont démontrés.

Introduction

Le but de cette méthode est d'induire la parodontite apicale chez une souris en contaminant l'apex avec la microflore naturelle, et d'étudier ensuite diverses caractéristiques de ce processus pathologique.

La parodontite apicale (AP) est une pathologie commune d'une nature inflammatoire dans les tissus parodontaux entourant la racine de la dent. Cette maladie dentaire peut causer de fortes douleurs et doit être traitée par un dentiste. Les options de traitement incluent le traitement de canal radiculaire (primaire ou secondaire), la chirurgie endodontique, l'extraction de dent, ou le suivi selon les résultats cliniques et radiographiques, et l'opinion du clinicien. Le mécanisme de ce processus inflammatoire, bien qu'étudié depuis plusieurs décennies^1,2,3, n'est toujours pas compris de manière exhaustive. Compte tenu de la gravité de cette pathologie, il est donc clairement nécessaire de faire des recherches sur sa nature fondamentale. Ainsi, les systèmes où l'étude de l'AP est possible sont d'un grand intérêt scientifique.

Puisque l'AP est un processus pathologique complexe impliquant les tissus locaux et le système immunitaire, les études in vitro sont insuffisantes pour une compréhension complète des processus. L'étude des échantillons cliniques de cette maladie sont également problématiques en raison des limitations éthiques et de la variabilité significative entre différentes personnes et différents stades cliniques^4,5, et donc la nécessité de modèles in vivo. Ces modèles sont basés sur le concept d'exposer la pulpe dentaire à la contamination et d'observer la réaction inflammatoire du corps à ce stimulus dans les tissus périatiques^6,7. Les modèles in vivo communs incluent des rongeurs ou de plus grands animaux tels que des chiens. Malgré le défi clinique dans le traitement des souris, qui sont de très petits animaux avec des dents miniatures, les avantages du modèle de souris sont importants: pratiquement, travailler avec des souris est techniquement simple en termes d'installations et est le plus rentable, et scientifiquement, la souris est un modèle animal bien étudié avec des outils génétiques et moléculaires facilement disponibles et un génome bien étudié. En effet, des études antérieures ont utilisé un modèle de souris pour étudier les signaux inflammatoires et de résorption osseuse et les cellules impliquées dans la parodontite apaïque^8,9,10,11. Par conséquent, un protocole clair sur la façon d'utiliser un modèle de souris pour l'étude de l'AP est nécessaire. Ici, nous décrivons un tel protocole.

Le protocole décrit ici est a le grand avantage d'être approprié pour étudier knock-out (KO) souris et d'apprendre comment l'absence d'un gène spécifique affecte l'inflammation dentaire^7,12. D'autres applications utiles de ce protocole incluent l'étude des effets des médicaments et des conditions systémiques sur le développement de la parodontite apicale^13,l'effet de la parodontite apicale sur le développement de l'ostéonécrose des mâchoires^{14 , 15} et thérapie de cellules souches pour la régénération osseuse¹⁶.

Ce protocole peut également être généralisé comme modèle pour étudier l'inflammation locale. Pour étudier le processus inflammatoire, plusieurs modèles de souris ont été développés, qui incluent par exemple la colite induite ou l'arthrite^17,18. Ces modèles ont des effets systémiques et n'ont aucun contrôle intégré chez le même animal. Les modèles pour la parodontite apicale induite, qui incluent un contrôle contralatéral sans inflammation, ont l'avantage de surmonter ces limitations^14,19.

Le protocole décrit ci-dessous est donc utile pour les chercheurs qui s'intéressent aux processus inflammatoires locaux. La nature contrôlée de cette inflammation, son confinement à un endroit spécifique, et la dent de contrôle contralatérale, tous font de ce protocole précieux pour étudier les mécanismes impliqués dans ce processus. En outre, le protocole est utile pour les chercheurs intéressés par les aspects cliniques de l'inflammation périapique. Le modèle de souris est idéal pour étudier différentes variables de la maladie, en plus de l'avantage d'être en mesure d'effectuer facilement des manipulations génétiques dans le modèle de souris, d'étudier l'activité de gènes spécifiques dans l'inflammation périatique.

Techniquement, la procédure clinique est difficile à effectuer en raison des petites dimensions des dents des souris. Il sera utile de visualiser cette procédure afin d'en apprendre davantage sur le positionnement, l'équipement nécessaire et les performances.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université hébraïque (Éthique no. MD-17-15093-5).

1. Anesthésie et positionnement des animaux

1. Préparer des solutions stériles comme décrit ci-dessous.
   1. Préparer 5 ml de 7 mg/mL de kétamine et 0,09 mg/mL de médetomidine diluée dans la solution tampon de phosphate (PBS)/Saline.
   2. Préparer une solution stérile d'Atipamezole (0,4 mg/mL) diluée en PBS/Saline (recommandée pour préparer une quantité de 5 ml).
   3. Préparer une solution stérile de Mepivacaine (7,5 mg/mL) diluée en PBS/Saline pour l'anesthésie locale (une fiole fournie de Mepivacaine est suffisante pour un stock de 7,2 ml).
2. Utilisez des souris C57BL/6 femelles de 6 à 8 semaines pour l'expérience. Gardez les animaux dans une unité animale spécifique exempte d'agents pathogènes (FPS), avec de l'eau et de la nourriture standard fournies par l'établissement et l'alimentation animale ad libitum.
3. Peser les souris et injecter intraperitoneally (IP) un volume de 10 L pour chaque gramme du poids. Par exemple, pour une souris qui pèse 20 grammes,
   injecter 200 L de solution kétamine/Médetomidine. Cela donnera une concentration finale de (70 mg/kg) de kétamine et de (0,9 mg/kg) de médétomidine
   pour chaque animal.
4. Afin de prévenir l'ulcération oculaire due à la sécheresse pendant la procédure, appliquer l'onimite oculaire contenant du chloramphenicol (5%) sur les yeux des animaux pendant qu'ils sont sous anesthésie. Gardez les animaux au chaud avec une lampe pendant qu'ils sont anesthésiés. Vérifier la profondeur de l'anesthésie en vérifiant le réflexe de la pédale (l'exécution de pincement des orteils fermes).
5. Une fois la souris anesthésiée, placez la souris allongée sur le côté droit (pour un chercheur droitier) sur une surface en mousse de polystyrène extrudée à cellules fermées et attachez les pieds à la surface à l'aide de ruban adhésif.
6. Ouvrez la bouche en utilisant de petits élastiques autour des incisifs (1 pour les incisifs supérieurs et 1 pour les incisifs inférieurs) maintenus en place par de longues aiguilles épinglées dans la surface en mousse de polystyrène extrudée à cellules fermées.
7. Retirez la joue droite à l'aide de forceps collés à la surface. Utilisez des forceps qui sont fermés à l'état stable.
8. Placez la surface avec la souris dans une position de travail confortable permettant l'accès aux molaires mandibulaires, en utilisant un grossissement approprié (un microscope binoculaire ou un microscope clinique) et la lumière.
9. Retirez la langue à l'aide de forceps ou de spatule dentaire et injectez une anesthésie locale avec une aiguille de 27 jauges dans le pli mucobuccal adjacent à la première molaire mandibulaire. 25-50 L est suffisant. L'enflure du tissu autour du site d'injection doit être visualisée.

2. Exposition aux pâtes

1. Utilisez une bavure dentaire ronde d'un demi-tour ou une bavure de diamant de même taille (une longue tige est recommandée) à une vitesse de 800 tours par minute (rpm), attachée à n'importe quel moteur dentaire approprié (par exemple un moteur de réduction automatique du couple (ATR).
2. Percer sur la partie occlusale de la première molaire mandibulaire droite jusqu'à ce que les cornes de pulpe soient visibles à travers la dentine. utiliser de courtes rafales du moteur pour éviter la surchauffe de la zone.
3. Utilisez un fichier K ou un fichier H #8 ou #10 pour percer la pulpe et insérer le fichier dans les cornes de pulpe (mesial et distal) en cassant la dentine qui les recouvre. Les fichiers sont stérilisés par autoclave.
4. Continuer à travailler avec les fichiers à l'intérieur de la pulpe aussi profondément que possible, tout en élargissant les ouvertures avec les fichiers. Habituellement, il y aura des saignements visibles de la pulpe.
5. Assurez-vous d'arrondir les bords pointus de la dent avec la bavure et retirer la dent de l'occlusion, afin de réduire la douleur pendant l'expérience. Nettoyer les débris pendant l'intervention à l'aide d'une microbrosse.
6. Laisser la dent contralatérale (à gauche première molaire mandibulaire) comme un contrôle.

3. Fin de la procédure clinique

1. Libérez la souris de l'état de fixation et injectez de l'atipamezole IP (10 l pour chaque gramme de poids corporel. Cela donnera une dose finale de (4 mg/kg) Atipamezole.
2. Injecter de la buprénorphine diluée dans la piédeur PBS/saline (0,05 mg/kg) (recommandée pour préparer une quantité de 3 ml le jour de l'intervention). Voir Discussion pour expliquer pourquoi le soulagement de la douleur est nécessaire.
3. Assurez-vous que les animaux se remettent de l'anesthésie avant de les quitter. Donnez-leur des aliments mous parce qu'ils peuvent être incapables de manger des aliments durs en raison de douleurs dentaires.

4. Suivi de la procédure postérieure (42 jours)

1. Pendant les 3 premiers jours après l'intervention, peser les animaux et injecter de la buprénorphine (0,1 mg/kg) IP une fois par jour (recommandé pour préparer une quantité de 6mL).
2. Pendant le temps de l'expérience (42 jours quand l'inflammation s'accumule) surveiller les animaux par le poids et l'évaluation comportementale générale 2-3 fois par semaine.
3. Livrer des aliments mous aux animaux au cours de la période de suivi. Mouillez la nourriture avec de l'eau et mettez-la dans un pétri-plat sur le sol de la cage.

5. Expérimentation de terminaison et d'analyse

1. Lorsque 42 jours¹¹ de suivi ont été achevés, anesthésique des animaux IP avec de la kétamine / xylazine à une concentration de 106,25 mg/kg de kétamine, et 75 mg/kg Xylazine (Une solution de stock de 42,5 mg/mL de kétamine, et 1,5 mg/mL Xylazine dans un volume total de 2 mL est est recommandé) et préforme la dislocation cervicale.
   REMARQUE: Il existe différentes options pour les analyses possibles afin d'évaluer l'inflammation^20,21. Ici, l'analyse du tissu par micro-CT et coloration histologique sera décrite.
2. Après l'euthanasie, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour découper une partie de la mâchoire, y compris les 3 molaires (séparément pour chaque contrôle latéral traité et non traité). En utilisant des forceps décoller autant que le tissu mou que possible, laissant principalement l'os et les dents sur l'échantillon.
3. Rincer brièvement le tissu dans le PBS, puis le mettre dans le paraformaldéhyde (PFA) 4% (dilué en PBS) pendant 24-48 heures pour la fixation.
   CAUTION : Utilisez pfA dans une hotte chimique et selon ses directives sur la fiche de données sur la sécurité des matériaux (MSDS).
4. Après 24-48 heures, rincer avec PBS 3x afin de laver le PFA.
5. Micro-CT
   1. Pour l'analyse micro-CT, porter les tissus récoltés (une partie de la mandibule comprenant 3 molaires, dans des dimensions d'environ 4 mm x 5 mmx 1 mm) à un scanner micro-CT, les placer dans un tube de 12 mm de diamètre rempli de 1,5 ml de PBS orienté de sorte que les surfaces buccales ou linguales de la dent et de la racine sont pondre parallèlement au fond du tube. Séparer entre les échantillons avec une éponge, et couvrir le dessus du tube avec du film flexible.
   2. Ouvrez le panneau de numérisation et choisissez le numéro de mesure. Choisissez le fichier de contrôle avec les paramètres suivants : énergie de 70 kV, intensité de 114 A, et résolution de 6 m³ voxel.
   3. Cliquez sur la vue scoute, et lorsque l'image apparaît, cliquez sur la ligne de référence et marquer la zone des échantillons pour la numérisation. Après chaque clic d'échantillon ajouter scan. Lorsque vous avez terminé le marquage des échantillons, allez à la liste des tâches et choisissez commencer à interagir tâches.
      REMARQUE : Les mêmes échantillons peuvent ensuite être utilisés pour l'histologie. Il est important qu'ils ne se dessèchent pas pendant le ToModensime.
6. Utilisez un programme informatique approprié pour l'alignement et l'analyse micro-CT.
   1. Ouvrez l'échantillon sur le plan XY dans l'évaluation micro-CT. Choisissez trois points sur chaque échantillon pour l'alignement :
      La constriction mésiale apical - définit l'origine du système de coordonnées.
      La partie coronale du canal mésial - définit un point sur l'axe Z.
      La constriction apical distale - définit un point sur le plan XZ.
   2. Utilisez l'outil de mesure sur le panneau de gauche et tracez une ligne atteignant chaque point. Définissez chacun des trois points par une valeur X, Y et Z, telle qu'elle apparaît dans le panneau droit.
   3. Définissez la zone d'intérêt dans l'échantillon en choisissant la tâche dans le cadre de l'évaluation cT,et cliquez sur l'évaluation 3D. Un rectangle et une fenêtre avec les dimensions par axe apparaîtront à l'écran. Faites correspondre les dimensions du rectangle pour s'adapter à la zone d'intérêt sur l'axe XY en cliquant dans les coins avec le bouton du milieu de la souris. Choisissez les dimensions dans l'axe Z en insérant le premier nombre d'intérêt dans le carré Z sous VOI Start, et le nombre de tranches de la première jusqu'au dernier nombre de tranche d'intérêt dans le carré Z sous Dim.
   4. Cliquez sur les applications sous le gestionnaire de session, et choisissez DECterm. Attendez quelques secondes pour qu'une fenêtre s'ouvre, puis tapez les cinq étapes du script incliné décrit ci-dessous selon les instructions suivantes (entre les lignes cliquez sur entrez :
      Ipl
      isq-to-aim
      objectif1
   5. Copiez le nom isq (fichier d'intérêt) : choisissez des vues sous le gestionnaire de session et cliquez sur microCTdata. Trouvez le fichier en cours de travail, et cliquez au milieu sur le fichier. Puis cliquez sur le milieu dans la fenêtre du DECterm.
   6. Entrez les valeurs X, Y et Z (avec un espace entre elles) qui ont été déterminées sous VOI lors du choix de la région d'intérêt.
   7. Entrez les valeurs X, Y et Z (avec un espace entre elles) qui ont été déterminées sous faible lors du choix de la région d'intérêt.
   8. Attendez de recevoir un message: isq à viser terminé.
      (étape II- alignement) :
      aligner z
      objectif1
      objectif2
   9. Entrez les valeurs X, Y et Z (avec un espace entre elles) qui ont été déterminées pour l'origine du système de coordonnées.
   10. Entrez les valeurs X, Y et Z (avec un espace entre eux) qui ont été déterminées pour le point sur l'axe Z.
   11. Entrez les valeurs X, Y et Z (avec un espace entre eux) qui ont été déterminées pour le point sur le plan XZ.
   12. Attendre jusqu'à recevoir un message: "alignZ terminé"
       (étape III- en-tête):
       tête
       objectif2
       0 0 0
       0 0 0
   13. Cliquez sur entrez.
       (étape IV- conversion du fichier de retour de but à isq):
       toisq (toisq)
       objectif2
   14. Copiez le nom isq (fichier d'intérêt) : choisissez des vues sous le gestionnaire de session et cliquez sur les données microCT. Trouvez le fichier sur lequel vous travaillez, et cliquez au milieu sur le fichier. Puis cliquez sur le milieu dans la fenêtre du DECterm. Effacer (en utilisant "backspace") le ". ISQ" à la fin du fichier, et écrire: "Nouveau. ISQ" pour reconnaître le fichier aligné.
   15. Cliquez sur entrez l'entrée entrez.
   16. Attendre jusqu'à recevoir un message: "toisq-from-aim terminé"
       (étape V-flip):
       Isq
       un
   17. Copiez le nouveau nom isq (fichier d'intérêt) : choisissez des vues sous le gestionnaire de session et cliquez sur les données microCT. Trouvez le fichier en cours de travail, et cliquez au milieu sur le fichier. Puis cliquez sur le milieu dans la fenêtre du DECterm.
   18. Cliquez sur entrez l'entrée entrez. Attendre de recevoir un message: "isq-to-aim terminé"
       retourner
       un
       Aa
       Zx
       attendre de recevoir un message: "flip-aim terminé"
       De
       Aa
   19. Copiez le nouveau nom isq : choisissez des vues sous le gestionnaire de session et cliquez sur les données microCT. Trouvez le fichier en cours de travail, et cliquez au milieu sur le fichier. Puis cliquez sur le milieu dans la fenêtre du DECterm. Effacer (en utilisant "backspace") le ". ISQ" à la fin du fichier, et d'écrire: "Flip. ISQ" pour reconnaître le fichier aligné.
   20. Attendre jusqu'à ce que vous recevons un message : « de l'objectif à l'isq terminé »
7. Contournage
   1. Choisissez la tranche qui représente approximativement le milieu de la dent, dans laquelle la pulpe coronale, pulpe radiculaire des deux canaux, et les deux foramens apical sont présentés.
   2. Marquez manuellement le contour de l'intérêt sur la tranche du milieu en cliquant sur le panneau supérieur du contour gauche, à partir du point distal de l'apex racine distale marquent la bordure apale coronale à la zone apical radiopaque, à travers la frontière mésiale de l'apex racine mésiale suivant la frontière distale de la racine mésiale et la frontière mésial de la racine distale à travers la région de furcation (voir figure 3 II,IV).
   3. Copiez ce contour (Ctrl-C, Ctrl-V) et ajustez-le en conséquence à 5 tranches positionnés de chaque côté de la tranche du milieu.
   4. Pour calculer le volume tissulaire du contour marqué pour chaque échantillon, choisissez la tâche dans le cadre de l'évaluation cT, et cliquez sur l'évaluation 3D. Dans la fenêtre de l'évaluation 3D cliquez sur sélectionner près de la tâche et choisir un filtre pour calculer le volume de tissu (TV).
8. Histologie
   1. Après l'enlèvement des tissus du scanner micro-CT, décalcififier les tissus en mettant chaque échantillon dans un tube microcentrifuge avec 1 mL d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) 0,5 M pH 8.0 pendant 10 jours. Modifier la solution EDTA tous les 3 jours.
   2. Déshydratation : Mettez des échantillons dans des cassettes histologiques et en concentrations croissantes d'éthanol, une heure chacune, comme suit : 70 % d'éthanol (à ce stade, le processus peut être arrêté pendant plusieurs semaines, tant que les échantillons sont conservés dans l'éthanol), 90 % d'éthanol 2x, 100 % éthanol 2x, xylène 2x (attention : utiliser du xylène dans une hotte chimique, et selon ses directives sur les SMDS).
      1. Transférer les cassettes dans la paraffine liquide (60 oC) et laisser dans le capot chimique pendant la nuit pour que le xylène s'évapore.
   3. Blocage : Utilisez une machine de blocage histologique pour intégrer les échantillons dans la paraffine. Veillez à les intégrer dans une position correcte (c.-à-d., la couronne et les racines doivent être orientées parallèlement à la partie inférieure du moule, d'une manière que la dent est «couchée») afin d'obtenir des sections sagittales. Les échantillons sont maintenant prêts à être coupés avec un microtome.
   4. Couper les sections : Commencez par couper des tranches épaisses de 20 m jusqu'à ce qu'elles atteignent la partie pertinente du tissu. Une fois que la reconnaissance d'une partie de la dent (couronne ou racines) le changement en sections de 6 'm, et changer l'angle de coupe en fonction de la section précédente.
      1. Par exemple, si la section précédente comprenait la couronne, mais pas les racines, changer l'angle du bloc dans le microtome de sorte que les racines se rapprochent du couteau, et la couronne remonte (les parties de la dent peuvent être reconnues à l'œil nu sur le bloc lui-même).
      2. Continuer à ajuster l'angle jusqu'à obtenir des sections sagittales, y compris la pulpe coronale et radiculaire, et le foramen apical. Couper dans cette orientation autant de tranches que possible, jusqu'à ce que le tissu pertinent soit coupé.
   5. Pour les protocoles de coloration (p. ex. la coloration de l'hémotoxylinet et de l'éosine (H et E), la coloration Brown et Brenn, la coloration de la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP), voir^20,21.

Résultats

Un diagramme de flux des étapes expérimentales est présenté à la figure 1. Comme mentionné dans le protocole, les souris sont anesthésiés, et leur première molaire mandibulaire d'un côté est forée jusqu'à l'exposition à la pulpe, tandis que la dent contralatérale est laissée comme un contrôle. Ensuite, les dents sont laissées pour être contaminées par la flore buccale pendant 42 jours, au cours desquels elles sont surveillées et reçoiven...

Discussion

Une méthode est introduite ici pour l'induction de la parodontite apaïque chez la souris. Le but de la méthode est d'exploiter la condition apicale parodontite pour étudier les mécanismes et les conséquences de ce processus inflammatoire. La parodontite apical a été induite dans les souris de 6-8 semaines, un âge dans lequel les racines sont entièrement développées^24. Afin de causer la parodontite apical dans ce modèle, la pulpe de dent des molaires mandibulaires de souri...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
blocking machine	Leica	EG1150H
buprenorphine	vetmarket	163451
clinical microscope/binocular	Olympus	Sz61
dental bur	Komet dental	ZR8801L 315 008
dental spatula	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
entelan	mercury	1.07961
Eosin Y solution, alcoholic	SIGMA	HT110116
hematoxylin solution, Mayer's	SIGMA	MHS 16
Ketamine hydrochloride	Vetoquinol	CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor)	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3%	Teva	CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators	PARKELL	S379
micro-ct scanner	scanco	uCT 40
parafin	Leica	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
Chloramphenicol eye ointment (5%)	Rekah pharmaceutical	CAS 56-75-7
tweezers	WAM	Ref-CT
xylazine	Eurovet Animal Health	CAS 7361-61-7
xylene	Gadot	CAS 1330-20-7