마우스에 있는 정점 치주염 유도

요약

여기서, 우리는 마우스에서 국소치성 치주염을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 마우스의 치아에 구멍을 뚫고 국소 염증을 유발하기 위해 펄프를 노출시키는 방법을 보여줍니다. 마이크로 CT 및 조직학과 같은 이 염증의 본질을 조사하는 분석 방법도 입증됩니다.

초록

국소 유도 염증에 관여하는 메커니즘은 여러 가지 사용 가능한 동물 모델을 사용하여 연구 될 수있다. 이들 중 하나는 정점 치주염 (AP)의 유도입니다. 정점 치주염은 치아 뿌리를 둘러싼 치주 조직에서 염증성 성질의 일반적인 병리학입니다. 이 병리학의 특성과 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 마우스에서 절차를 수행하는 것이 유리합니다. 이 치과 펄프가 노출 될 때까지 이 치과 성 염증의 유도는 마우스 치아로 드릴링하여 달성됩니다. 다음으로, 치아 펄프는 시간이 지남에 따라 자연 구강 세균총에 의해 오염되어 정점 치주염을 유발하여 노출됩니다. 이 기간 이후에는 동물을 희생시키고 치아와 턱뼈를 다양한 방법으로 분석할 수 있습니다. 일반적인 분석은 마이크로 CT 화상 진찰 (뼈 재흡수를 평가하기 위하여), 조직학적 염색, 면역 조직 화학 및 RNA 발현을 포함합니다. 이 프로토콜은 균일 한 조건으로 생체 내 실험 환경에서이 염증 과정을 더 잘 이해하기 위해 경구 생물학 분야의 연구에 유용합니다. 절차는 마우스와 고립 된 턱의주의 깊은 취급을 필요로하며, 기술의 시각적 데모가 유용합니다. 유도 된 치주염으로 이어지는 절차의 모든 기술적 측면과 마우스 모델의 특성화가 입증됩니다.

서문

이 방법의 목적은 자연 미생물로 정점을 오염시킴으로써 마우스에서 정점 치주염을 유도한 다음이 병리학 적 과정의 다양한 특성을 연구하는 것입니다.

정점 치주염 (AP)은 치아 뿌리를 둘러싼 치주 조직에서 염증성 성질의 일반적인 병리학입니다. 이 치과 질환은 심한 통증을 유발할 수 있으며 치과 의사가 치료해야합니다. 치료 옵션은 근관 치료 (기본 또는 보조), endodontic 수술, 치아 추출, 또는 임상 및 방사선 연구 결과에 따라 후속, 임상의의 의견. 이 염증 과정의 메커니즘은 수십 년동안 연구되었지만 1,^2,3은아직 포괄적으로 이해되지 않습니다. 이 병리학의 심각성을 고려할 때, 따라서 근본적인 본질을 다루는 연구에 대한 명확한 필요성이 있습니다. 따라서 AP 의 연구가 가능한 시스템은 과학적으로 큰 관심사입니다.

AP는 국부 조직과 면역 체계를 수반하는 복잡한 병리학 적 과정이기 때문에 시험관 내 연구는 프로세스의 완전한 이해를 위해 충분하지 않습니다. 이 질병의 임상 샘플의 연구는 또한 윤리적 한계와 다른 사람들과 다른 임상 단계사이의 상당한 가변성으로 인해 문제가 4,^5,따라서 생체 내 모델의 필요성. 이들 모델은 치과 펄프를 오염에 노출시키고 신체의 염증 반응을 관찰하여 근문 조직에서 이러한 자극을 관찰하는 개념을 기반으로^6,7. 일반적인 생체 내 모델은 설치류 또는 개와 같은 더 큰 동물을 포함합니다. 소형 치아를 가진 아주 작은 동물인 마우스 를 치료하는 임상 적 과제에도 불구하고 마우스 모델의 장점은 중요합니다 : 실질적으로 마우스와 함께 일하는 것은 기술적으로 간단하며 가장 비용 효율적입니다. 과학적으로, 마우스는 쉽게 사용할 수있는 유전 및 분자 도구와 잘 연구 된 게놈과 잘 연구 된 동물 모델입니다. 실제로, 이전 연구는 정점 치주염^8,9,^10,11에관여하는 염증성 및 뼈 흡수 신호 및 세포를 연구하기 위한 마우스 모델을 사용했다. 따라서 AP 연구에 마우스 모델을 사용하는 방법에 대한 명확한 프로토콜이 필요합니다. 여기서는 이러한 프로토콜을 설명합니다.

여기서 설명된 프로토콜은 녹아웃(KO) 마우스를 연구하고 특정 유전자의 부족이 치과 염증에 어떻게영향을 미치는지 배우기에 적합하다는 큰 장점을 갖는다 7,^12. 이 프로토콜의 다른 유용한 응용 프로그램은 정점 치주염의 개발에 약물 및 전신 조건의 연구의 연구를 포함^13,턱의 골괴사 개발에 정점 치주염의 효과^{14 , 도 15} 및 골재생을 위한 줄기세포 치료제^16.

이 프로토콜은 또한 국소 염증을 연구하는 모델로 일반화 될 수있다. 염증 과정을 연구하기 위해, 여러 마우스 모델이 개발되었으며, 이는 예를 들어 유도된 대장염 또는 관절염^17,18을포함한다. 이 모델은 전신 효과가 있으며 동일한 동물에 내장 된 제어가 없습니다. 염증없이 반대측 조절을 포함하는 유도 된 치주염에 대한 모델은 이러한 한계를 극복하는 장점이 있습니다^14,19.

아래에 설명된 프로토콜은 따라서 국부적인 염증 과정에 관심이 있는 연구자를 위해 유용합니다. 이 염증의 통제 된 특성, 특정 위치에 대한 감금 및 반대쪽 제어 치아는 모두이 과정에 관련된 메커니즘을 연구하는 데 이 프로토콜을 가치있게 만듭니다. 더욱이, 프로토콜은 근문 염증의 임상적 측면에 관심이 있는 연구자들에게 유용하다. 마우스 모델은 마우스 모델에서 유전자 조작을 용이하게 수행할 수 있다는 장점 외에도, 질병의 다양한 변수를 연구하고, 근문 염증에서 특정 유전자의 활성을 조사하는 데 이상적입니다.

기술적으로, 임상 절차는 마우스 치아의 작은 크기로 인해 수행하기가 어렵습니다. 위치 지정, 필요한 장비 및 성능에 대해 알아보려면 이 절차를 시각화하는 것이 좋습니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 히브리 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (윤리 없음. MD-17-15093-5).

1. 동물 마취 및 위치

1. 아래에 설명된 대로 멸균 솔루션을 준비합니다.
   1. 5 mL의 케타민 7 mg/mL과 인산염 완충액(PBS)/식염수로 희석된 0.09 mg/mL 의 메데토미딘을 준비합니다.
   2. PBS/식염수로 희석된 아티파메졸(0.4 mg/mL)의 멸균 용액을 준비하십시오(5 mL의 양을 준비하는 것이 좋습니다).
   3. 국소 마취를 위해 PBS/식염수로 희석된 메피바카인(7.5 mg/mL)의 멸균 용액을 준비하십시오(메피바카인 의 공급된 유리병 1개만으로도 7.2 mL의 재고에 충분합니다).
2. 실험을 위해 6-8주 된 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하십시오. 시설과 동물 먹이 광고 리비텀에서 제공하는 표준 물과 음식과 함께 특정 병원균 (SPF) 동물 단위에 동물을 유지합니다.
3. 마우스를 계량하고 무게의 각 그램에 대해 10 μL의 부피를 복강 내 (IP)를 주입합니다. 예를 들어, 무게가 20그램인 마우스의 경우,
   케타민/메데토미딘 용액 200 μL을 주입합니다. 이것은 (70 mg/kg) 케타민과 (0.9 mg/kg) 메데토미딘의 최종 농도를 줄 것이다
   각 동물에 대해.
4. 시술 중 건조로 인한 눈 궤양을 방지하기 위해 클로람페니콜을 함유한 눈 연고(5%)를 바르십시오. 마취 하에 있는 동안 동물의 눈에. 동물을 마취하는 동안 램프로 따뜻하게 유지하십시오. 페달 반사 (회사 발가락 핀치를 수행)를 확인하여 마취의 깊이를 확인합니다.
5. 마우스가 마취된 후, 마우스를 오른쪽(오른손잡이 연구원의 경우)에 놓고 닫힌 셀 압출 폴리스티렌 폼 표면에 놓고 테이프를 사용하여 발을 표면에 부착합니다.
6. 앞니 주위에 작은 고무 밴드를 사용하여 입을 엽니 다 (상부 절개 에 대한 1, 하부 절치에 대한 1) 폐쇄 셀 압출 폴리스티렌 폼 표면에 고정 긴 바늘에 의해 장소에 개최.
7. 표면에 테이핑 된 집게를 사용하여 오른쪽 뺨을 철회하십시오. 정상 상태에서 닫힌 집게를 사용합니다.
8. 적절한 배율 (쌍안경 현미경 또는 임상 현미경)과 빛을 사용하여 하악 대구치에 액세스 할 수 있도록 편안한 작업 위치에 마우스로 표면을 배치합니다.
9. 집게 또는 치과 주걱을 사용하여 혀를 철회하고 첫 번째 하악 골치에 인접한 점막 접힌에 27 게이지 바늘로 국소 마취를 주입합니다. 25-50 μL로 충분합니다. 주사 부위 주변의 조직의 붓기가 시각화되어야합니다.

2. 펄프 노출

1. 적절한 치과 모터(예: 자동 토크 감소(ATR) 모터에 부착된 분당 800라운드(rpm)의 속도로 1/4 라운드 치과 용 버 또는 동일한 크기의 다이아몬드 버(긴 생크가 권장됨)를 사용하십시오.
2. 펄프 뿔이 상아질을 통해 볼 때까지 첫 번째 오른쪽 하악 대구치의 교합 부분에 드릴. 모터의 짧은 버스트를 사용하여 과열을 방지합니다.
3. K-파일 또는 H 파일 #8 또는 #10 사용하여 펄프를 관통하고 그들을 덮는 상아를 파괴하여 펄프 혼 (mesial 및 distal)에 파일을 삽입합니다. 파일은 오토 클레이브에 의해 살균됩니다.
4. 파일의 개구부를 넓히는 동안 펄프 내부의 파일을 가능한 한 깊게 작업하십시오. 일반적으로 펄프에서 볼 수있는 출혈이있을 것입니다.
5. 실험 중 통증을 줄이기 위해 버로 치아의 날카로운 가장자리를 둥글게 하고 치아를 폐색에서 제거하십시오. 마이크로 브러시로 시술 중에 이물질을 청소하십시오.
6. 대조군 치아 (왼쪽 첫 번째 하악 어금니)를 대조군으로 둡니다.

3. 임상 절차 종료

1. 고정 상태에서 마우스를 방출하고 Atipamezole IP (체중의 각 그램당 10 μL)를 주입하십시오. 이것은 (4 mg / kg) 아티파메졸의 최종 복용량을 줄 것이다.
2. PBS/식염수(0.05 mg/kg) IP로 희석된 부프레노르핀을 주입하십시오(시술 당일 3 mL의 양을 준비하는 것이 좋습니다). 통증 완화가 필요한 이유에 대한 설명은 토론을 참조하십시오.
3. 동물들이 마취에서 회복되는지 확인한 후 떠나십시오. 그들은 치아 통증으로 인해 하드 음식을 먹을 수 없기 때문에 그들에게 부드러운 음식을 제공합니다.

4. 사후 절차 후속 조치(42일)

1. 절차 후 처음 3 일 동안, 동물의 무게와 부프레 노르 핀을 주입 (0.1 mg/kg) 하루에 한 번 IP (6mL의 양을 준비하는 것이 좋습니다).
2. 실험 시간 동안(염증이 쌓이는 42일) 체중및 일반 행동평가로 동물을 일주일에 2-3회 모니터링한다.
3. 후속 기간 동안 동물에게 부드러운 음식을 전달하십시오. 음식을 물로 적시고 케이지 바닥에 페트리 접시에 넣습니다.

5. 실험 종료 및 분석

1. 후속 조치가 42일^{동안 11일} 완료되면 케타민/자일라진으로 동물 IP를 106.25 mg/kg의 케타민 농도로 마취하고, 75 mg/kg의 자일라진(42.5 mg/mL 케타민의 재고 용액, 총 부피 의 1.5 mg/mL 자일라진은 총 부피의 1.5 mg/mL 자일라진입니다. 자궁 경부 탈구를 프리폼합니다.
   참고 : 염증^20,21을평가하기 위해 가능한 분석에 대한 다양한 옵션이 있습니다. 여기서 마이크로 CT 및 조직학적 염색에 의한 조직의 분석이 설명될 것이다.
2. 안락사 후, 외과 용 가위와 집게를 사용하여 3 개의 대구치 (각 측면 처리 및 비 처리 된 대조군에 대해 별도로)를 포함하여 턱의 일부를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 가능한 한 연조직을 벗겨 내고 대부분 뼈와 치아를 시료에 남깁니다.
3. PBS에서 조직을 간략하게 헹구고, 포름알데히드(PFA)에 4% (PBS에서 희석) 24-48시간 동안 고정을 위해 넣습니다.
   주의: 화학 적 후드에 PFA를 사용하고 재료 안전 데이터 시트 (MSDS) 지침에 따라.
4. 24-48시간 후에, PFA를 씻어내기 위하여 PBS 3x로 헹구는다.
5. 마이크로 CT
   1. 마이크로 CT 분석의 경우, 수확된 조직(약 4mm x 5mmx 1mm 크기의 대구치 3개 포함 하악골의 일부)을 마이크로 CT 스캐너에 놓고 1.5 mL의 PBS 로 채워진 직경 튜브에 놓아 볼 또는 언어 표면이 되도록 합니다. 치아와 뿌리의 튜브의 바닥에 평행하게 누워있다. 스폰지로 샘플을 분리하고 유연한 필름으로 튜브의 상단을 덮습니다.
   2. 스캐닝 패널을 열고 측정 번호를 선택합니다. 70kV의 에너지, 114 μA의 강도 및 6 μm³ 복셀 크기의 해상도와 같은 매개 변수로 제어 파일을 선택합니다.
   3. 스카우트 보기를클릭하고 이미지가 나타나면 참조선을 클릭하고 스캔을 위해 샘플 영역을 표시합니다. 각 샘플 후 클릭스캔을 추가합니다. 샘플 표시가 완료되면 작업 목록으로 이동하여 상호 작용 작업을선택합니다.
      참고 : 동일한 샘플을 나중에 역학에 사용할 수 있습니다. CT 스캔 중에 건조하지 않는 것이 중요합니다.
6. 마이크로 CT 정렬 및 분석을 위해 적절한 컴퓨터 프로그램을 사용하십시오.
   1. 마이크로 CT 평가에서 XY 평면에서 샘플을 엽니다. 정렬을 위해 각 샘플에서 세 점을 선택합니다.
      메사얼 상체 수축 -은 좌표계의 원점을 정의합니다.
      메사운하의 관상 부 - Z 축에 대한 점을 정의합니다.
      단위 정점 수축 -은 XZ 평면의 점을 정의합니다.
   2. 왼쪽 패널의 측정 도구를 사용하고 각 점에 도달하는 선을 그립니다. 오른쪽 패널에 나타나는 X, Y 및 Z 값으로 세 점 각각을 정의합니다.
   3. μCT평가에서 작업을 선택하여 샘플의 관심 영역을 정의하고 3D 평가를클릭합니다. 사각형과 축당 치수가 있는 창이 화면에 나타납니다. 마우스의 가운데 버튼으로 모서리를 클릭하여 XY 축의 관심 영역에 맞게 사각형의 크기를 일치시면 됩니다. VOI Start아래의 Z 사각형에 관심있는 첫 번째 슬라이스 수를 삽입하고 첫 번째 조각부터 Dim아래의 Z 사각형에 대한 마지막 슬라이스 수까지의 슬라이스 수를 삽입하여 Z 축의 치수를 선택합니다.
   4. 세션관리자에서 응용 프로그램을 클릭하고 DECterm을선택합니다. 창이 열릴 때까지 몇 초 간 기다린 다음 다음 지침에 따라 아래에 설명된 기울어진 스크립트의 다섯 단계를 입력합니다(줄 클릭 사이 enter):
      Ipl
      isq_to_aim
      aim1
   5. isq (관심 파일) 이름을 복사 : 세션 관리자에서 보기를 선택하고 microCTdata를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다.
   6. 관심 영역을 선택할 때 VOI로 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이의 공백 포함)을 입력합니다.
   7. 관심 영역을 선택할 때 희미한 상태에서 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이의 공백 포함)을 입력합니다.
   8. 메시지가 수신될 때까지 기다립니다.
      (단계 II- 정렬):
      z 정렬
      aim1
      목표2
   9. 좌표계의 원점으로 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이에 공백포함)을 입력합니다.
   10. z축의 점에 대해 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이에 공백포함)을 입력합니다.
   11. XZ 평면의 점에 대해 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이에 공백포함)을 입력합니다.
   12. 메시지가 수신될 때까지 기다립니다: "align_Z 완료됨"
       (단계 III- 헤더):
       헤더
       목표2
       0 0 0
       0 0 0
   13. 을 클릭합니다.
       (단계IV- 목표에서 isq로다시 파일을 변환):
       토이스크 (토스크)
       목표2
   14. isq (관심 파일) 이름을 복사 : 세션 관리자에서 보기를 선택하고 microCT 데이터를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다. 지우기 ("백스페이스"를 사용 하 여) ". 파일 끝에 ISQ"를 쓰고 쓰기:"_new. 정렬된 파일을 인식하는 ISQ"입니다.
   15. 입력을 클릭합니다 . 입력합니다.
   16. 메시지가 수신될 때까지 기다립니다.
       (단계 V- 플립):
       이스크 (것)
       a.
   17. 새 isq(관심 파일) 이름 복사: 세션 관리자 에서 보기를 선택하고 microCT 데이터를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다.
   18. 입력을 클릭합니다 . 입력합니다. 메시지를 받을 때까지 기다립니다: "isq_to_aim 완료"
       플립
       a.
       Aa
       Zx
       "플립_aim 완료"
       보낸 사람
       Aa
   19. 새 isq 이름 복사: 세션 관리자에서 보기를 선택하고 microCT 데이터를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다. 지우기 ("백스페이스"를 사용 하 여) ". 파일 끝에 ISQ"를 쓰고 "_flip. 정렬된 파일을 인식하는 ISQ"입니다.
   20. 메시지가 수신될 때까지 기다립니다.
7. 컨투어링
   1. 관상 동맥 펄프, 두 운하의 방사펄프, 그리고 두 정점 포어멘이 제시되는 치아의 대략 중간을 나타내는 슬라이스를 선택하십시오.
   2. 수동으로 왼쪽 상단 윤곽 패널을 클릭하여 중간 슬라이스에 관심의 윤곽을 표시 - 말단 루트 정점의 말단 점에서 시작하여 정점 테두리를 관상적으로 방사성 정점 영역으로 표시, mesial 루트 정점의 mesial 테두리를 통해 모독 뿌리의 말단 테두리와 분노 영역을 통해 말단 뿌리의 mesial 테두리를 따라 (그림 3 II, IV 참조).
   3. 이 윤곽선(Ctrl+C, Ctrl+V)을 복사하고 중간 슬라이스의 양쪽에 배치된 5개의 슬라이스로 조정합니다.
   4. 각 샘플에 대해 표시된 윤곽의 조직 부피를 계산하려면 μCT평가에서 작업을 선택하고 3D 평가를클릭합니다. 3D 평가의 창에서 작업 근처를 선택하고 조직 볼륨 (TV)를 계산하는 필터를 선택클릭합니다.
8. 조직학
   1. 마이크로 CT 스캐너에서 조직을 제거한 후, 10일 동안 1 mL의 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 0.5M pH 8.0을 가진 마이크로원심지 튜브에 각 샘플을 넣어 조직을 탈문한다. 3일마다 EDTA 솔루션을 변경합니다.
   2. 탈수: 조직학적 카세트에 샘플을 넣고, 다음과 같이 각각 1시간씩 에탄올 농도를 증가시다: 70% 에탄올 (이 시점에서 샘플이 에탄올에 보관되는 한 몇 주 동안 중지될 수 있음), 90% 에탄올 2x, 100% 에탄올 2x, 자일렌 2x (주의 : 화학 후드에 자일렌을 사용하고 MSDS 지침에 따라).
      1. 카세트를 액체 파라핀(60°C)으로 옮기고 자일렌이 증발할 수 있도록 밤새 화학 후드에 둡니다.
   3. 차단: 조직학적 차단 기계를 사용하여 샘플을 파라핀에 포함시킵니다. 시상 절편을 얻으려면 올바른 위치에 포함해야합니다 (즉, 크라운과 뿌리는 치아가 "누워있는"방식으로 금형의 바닥 부분에 평행하게 지향되어야합니다). 샘플은 이제 마이크로토메로 절단할 준비가 되었습니다.
   4. 절개: 조직의 관련 부분에 도달할 때까지 ~ 20 μm의 두꺼운 조각을 자르는 것으로 시작하십시오. 일단 치아(크라운 또는 뿌리)의 임의의 부분을 인식하면 6 μm의 단면으로 변화하고, 이전 섹션에 따라 절단 각도를 변경한다.
      1. 예를 들어, 이전 섹션에 크라운이 포함되지만 뿌리가 없는 경우, 뿌리가 칼에 가까워지도록 마이크로톤에서 블록의 각도를 변경하고 크라운이 돌아갑니다 (치아의 부분은 블록 자체에 육안으로 인식 할 수 있음).
      2. 관상 동맥 및 방사 펄프, 정점 포어맨을 포함한 시상 단면을 얻을 때까지 각도를 계속 조정합니다. 관련 조직이 모두 절단 될 때까지 가능한 한 많은 슬라이스로 이 방향으로 자른다.
   5. 염색 프로토콜(예를 들어, 해모톡실린 및 이오신 염색(H&E), 브라운 & 브렌 염색, 타르타르산 내성 산 인산 인산염(TRAP) 염색, 면역히스토화학,^20,21을참조하십시오.

결과

실험 단계의 흐름도는 그림1에 표시됩니다. 프로토콜에서 언급 한 바와 같이, 마우스는 마취되고, 한쪽에 그들의 첫 번째 하악 대구치 펄프 노출까지 드릴, 반대 측 치아는 대조군으로 남아있는 동안. 다음으로, 치아는 42 일 동안 구강 식물에 의해 오염되어 모니터링되고 진통제를 받습니다. 42 일 후에 마우스는 안락사되고 치아와 인접한 턱은 분석?...

토론

방법은 마우스에 있는 정점 치주염의 유도를 위해 여기에서 소개됩니다. 이 방법의 목표는이 염증 과정의 메커니즘과 결과를 연구하기위한 정점 치주염 상태를 이용하는 것입니다. 정점 치주염은 뿌리가 완전히 발달되는 나이인 6-8주령생에서^24세로유도되었다. 이 모델에서 치주염을 일으키기 위해 마우스 하악골의 치아 펄프는 치과 용 버를 사용하여 노출됩니다. 쥐?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
blocking machine	Leica	EG1150H
buprenorphine	vetmarket	163451
clinical microscope/binocular	Olympus	Sz61
dental bur	Komet dental	ZR8801L 315 008
dental spatula	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
entelan	mercury	1.07961
Eosin Y solution, alcoholic	SIGMA	HT110116
hematoxylin solution, Mayer's	SIGMA	MHS 16
Ketamine hydrochloride	Vetoquinol	CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor)	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3%	Teva	CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators	PARKELL	S379
micro-ct scanner	scanco	uCT 40
parafin	Leica	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
Chloramphenicol eye ointment (5%)	Rekah pharmaceutical	CAS 56-75-7
tweezers	WAM	Ref-CT
xylazine	Eurovet Animal Health	CAS 7361-61-7
xylene	Gadot	CAS 1330-20-7