Extraction de cortisol à partir de matrices de nageoires d'esturgeon et de mâchoires

Résumé

Dans cette étude, nous présentons un protocole pour l'extraction de cortisol de la nageoire et de la mâchoire des espèces d'esturgeons. Les niveaux de cortisol de fin et de mâchoire ont été plus loin examinés en comparant deux solvants de lavage suivis des essais d'ELISA. Cette étude a mis à l'essai la faisabilité du cortisol de mâchoire comme indicateur de stress nouveau.

Résumé

Les objectifs de cette étude étaient de développer une technique pour l'extraction du cortisol à partir d'ailerons d'esturgeon à l'aide de deux solvants de lavage (eau et isopropanol) et de quantifier les différences dans les niveaux de cortisol des nageoires parmi trois principales espèces d'esturgeons. Les nageoires ont été récoltées à partir de 19 esturgeons sacrifiés, dont sept bélugas (Huso huso), sept Sibériens (Acipenser baerii), et cinq sevruga (A. stellatus). Les esturgeons ont été élevés dans des fermes iraniennes pendant deux ans (2017-2018), et l'analyse de l'extraction du cortisol a été menée en Corée du Sud (janvier-février 2019). Des mâchoires de cinq H. huso ont également été employées pour l'extraction de cortisol. Les données ont été analysées à l'aide de la procédure générale de modèle linéaire (GLM) dans l'environnement SAS. Les coefficients de variation intra- et inter-assay étaient respectivement de 14,15 et 7,70. En bref, la technique d'extraction du cortisol consistait à laver les échantillons (300 à 10 mg) avec 3 ml de solvant (eau ultrapure et isopropanol) deux fois, rotation à 80 tr/min pendant 2,5 min, séchage à l'air des échantillons lavés à température ambiante (22-28 oC) pendant 7 jours, séchage supplémentaire les échantillons à l'aide d'un batteur de perles à 50 Hz pendant 32 min et les broyant en poudre, en appliquant 1,5 ml de méthanol à la poudre séchée (75 à 5 mg), et la rotation lente (40 tr/min) pendant 18 h à température ambiante avec mélange continu. Après extraction, les échantillons ont été centrifuges (9 500 x g pour 10 min), et 1 mL de supernatant a été transféré dans un nouveau tube de microcentrifuge (1,5 mL), incubé à 38 oC pour évaporer le méthanol, et analysé par l'intermédiaire d'un essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) . Aucune différence n'a été observée dans les niveaux de cortisol des nageoires chez les espèces ou dans les niveaux de cortisol des nageoires et des mâchoires entre les solvants de lavage. Les résultats de cette étude démontrent que la matrice de mâchoire d'esturgeon est un indicateur alternatif prometteur d'effort aux matrices pleines.

Introduction

Le cortisol est un indicateur fiable du stress animal. L'extraction de cortisol fournit un cadre valide pour les chercheurs pour surveiller les niveaux de stress et les modèles généraux dans les facteurs de stress. Par exemple, des études antérieures ont mené la validation méthodologique des mesures de cortisol de cheveux utilisant diverses méthodes chez l'homme^1,2, singes^3,4, bovins⁵, moutons⁶, et poisson rouge^7,8. Chez les espèces de poissons, il a été démontré que les mesures du cortisol dans des matrices telles que les écailles, le mucus cutané, les excréments et le sang⁹ fournissent des informations sur la santé des poissons. Lorsque l'échantillonnage sanguin est problématique ou que les écailles font défaut, d'autres matrices pour l'extraction du cortisol sont nécessaires. Chez les poissons, les matrices alternatives peuvent inclure la mâchoire, un tissu dur similaire à la dent humaine¹⁰.

Le développement de nouvelles matrices et de techniques validées pour déterminer les niveaux de stress des poissons est particulièrement intéressant pour l'industrie du caviar, où l'esturgeon peut être exposé de façon prolongée aux facteurs de stress environnemental¹¹. Le sexe de l'esturgeon ne peut pas être déterminé avant l'âge de 2 ans, et l'esturgeon n'a pas d'écailles. Parce que le cortisol s'accumule progressivement en matrices solides au cours du stade de croissance^2,7,12, les données d'accumulation de cortisol à long terme à partir de matrices dures telles que les nageoires et les mâchoires pourraient fournir un aperçu du stress à différents stades de croissance. En revanche, les niveaux de cortisol sanguin fournissent un instantané des niveaux de stress au moment du décès et ne peuvent pas représenter avec précision le stress pendant les conditions d'élevage à long terme^13,14. Avec la concurrence croissante sur le marché du caviar, de nouvelles approches visant à améliorer les conditions de stress pour la production d'œufs plus sains chez les espèces d'esturgeons pendant l'élevage à long terme (8-12 ans ou plus) sont un domaine de recherche de plus en plus important. En raison du coût élevé de l'esturgeon, les échantillons récoltés sont extrêmement coûteux (8 000 $ à 15 000 $ par poisson mature selon l'espèce et le stade de croissance), un facteur limitant pour les projets de recherche. Cependant, le développement d'une technique appropriée pour l'extraction du cortisol à partir des nageoires et des mâchoires d'esturgeon pourrait être utilement appliqué à la fois aux systèmes de pisciculture et aux poissons sauvages afin d'améliorer la qualité et la récolte des œufs d'esturgeon pour la consommation et préservation.

En plus de fournir des résultats fiables⁶, la sélection d'une technique appropriée d'extraction de cortisol est d'une importance cruciale pour s'assurer que d'autres composés présents dans la matrice pendant la préparation de l'échantillon ne confondent pas la sortie, ce qui pourrait conduire à résultats incohérents. Il est également important de déterminer si les niveaux de cortisol des nageoires et de la mâchoire sont influencés par les niveaux d'hormones dans l'eau environnante. Heimbârge et coll.¹⁵ ont suggéré qu'un certain nombre de facteurs peuvent influencer les niveaux de cortisol, y compris l'âge, le sexe, la grossesse, la saison, la couleur¹², et la région du corps à partir de laquelle le cortisol est extrait¹⁶. Cependant, peu d'informations sont disponibles sur les effets du lavage des solvants sur l'extraction de cortisol dans les matrices de corps de poisson⁸, et aucun sur ces effets chez l'esturgeon, à l'exception des œufs d'esturgeon¹⁷.

Bien que l'analyse des niveaux de cortisol de base des nageoires et des mâchoires de l'esturgeon exige que le poisson soit euthanasié, cette approche n'implique pas les techniques invasives requises pour l'échantillonnage sanguin chez les esturgeons vivants. Les échantillons de nageoires et d'os de mâchoire sont facilement prélevés, et l'extraction de ces tissus peut être effectuée rapidement. De même, l'extraction et l'analyse hormonales sont simples et nécessitent peu d'équipement spécialisé.

Dans cette étude, nous présentons une technique nouvelle et facilement appliquée pour l'extraction, le lavage et la détermination du cortisol à partir des nageoires et des mâchoires de poisson, dans le but de déterminer si les niveaux de cortisol mesurés à partir de ces matrices peuvent être utilisés de façon fiable comme stress Indicateurs. Les avantages de cette technique comprennent une approche facile et non invasive^8, moins de variation des données, et une production fiable^1,6,8,17; la technique s'applique aux espèces de poissons sans écailles telles que l'esturgeon. La technique nécessite l'abattage du poisson, la sélection des solvants de lavage appropriés^2,4, broyage approprié des échantillons^3,5, essai immunosorbent enzymatique professionnel (ELISA) application^5,7, et une connaissance approfondie de l'incorporation des sources de cortisol en matrices solides⁶.

Nous avons appliqué deux solvants de lavage différents (eau ultrapure et isopropanol) pour obtenir des niveaux baso-bas de cortisol dans les nageoires de trois espèces d'esturgeons : le béluga (Huso huso),sibérien (Acipenser baerii),et le sevruga (A. stellatus ), dans des conditions environnementales standard pour chaque espèce. Des mâchoires de H. huso ont également été employées pour évaluer le stress dans l'esturgeon. Il s'agit de la première étude à mesurer les niveaux de cortisol dans les mâchoires d'esturgeon. Les résultats de cette étude fourniront des données comparatives sur le cortisol pour les espèces d'esturgeons au stade de croissance précoce (1 an) avant la détermination du sexe.

Protocole

Les procédures et méthodes expérimentales suivantes ont été approuvées par l'Autorité de bien-être et d'éthique des animaux de l'Université nationale de Kangwon, à Chuncheon, en République de Corée.

1. Collection Fin

1. Capturez l'esturgeon doucement à l'aide d'un filet pour minimiser les blessures et le stress.
2. Rincer soigneusement le poisson avec de l'eau douce, puis essuyer la surface du corps avec une serviette absorbante avant l'euthanasie.
3. Frapper la tête du poisson à l'aide d'un marteau en plastique de telle sorte que le poisson est étourdi ou perd conscience. Retirer la tête à l'aide d'un couteau.
4. Mesurer le poids corporel (g) et la longueur (cm).
5. Après l'euthanasie, prélever des échantillons d'ailerons en coupant le plus près possible du corps à l'aide de ciseaux chirurgicaux stérilisés.
   REMARQUE : Des serviettes absorbantes individuelles non recyclées doivent être utilisées pour chaque poisson. Les statistiques descriptives pour les espèces utilisées dans cette étude étaient les suivantes : esturgeon béluga (H. huso) : âge de 18 à 2,1 mois, poids corporel de 2 700 à 300 g, et longueur du corps de 55 à 5 cm; Esturgeon sibérien(A. baerii): âge de 9,6 à 2,4 mois, poids corporel de 1 750 à 250 g, et longueur du corps de 45 à 5 cm; esturgeon sévruga(A. stellatus): âge de 14 à 1,3 mois, poids corporel de 1 000 à 100 g, et longueur du corps de 65 à 5 cm.

2. Préparation de fin pour l'extraction de cortisol

1. Placer les échantillons d'ailerons (un échantillon par tissu : 3 g) sur du papier de pesage de laboratoire (107 mm et 210 mm) et sécher à température ambiante pendant quelques jours jusqu'à ce qu'il soit sec.
2. Enveloppez les échantillons dans des feuilles de papier d'aluminium, placez-les dans des sacs en plastique étiquetés et transférez-les au laboratoire.
3. Conserver les échantillons dans un réfrigérateur pour une utilisation ultérieure, y compris le lavage, l'extraction du cortisol, le séchage et l'analyse ELISA(figure 2).

3. Analyse de cortisol de fin

1. Calibrer l'échelle analytique numérique (précision : 0,0001) et peser 300 à 10 mg d'échantillons avec du papier de pesage sur la plaque à échelle.
2. Laver les échantillons.
   1. Transférer chaque échantillon dans un tube de polypropylène conique de 15 L. Ajouter 3 ml d'isopropanol à chaque tube à l'aide d'une pipette monocanal de 5 000 l L.
   2. Faites pivoter les tubes à 80 tr/min pendant 2,5 min pour éliminer le cortisol et éliminer toute contamination externe potentielle. Répétez cette procédure deux fois.
   3. Sécher à l'air les échantillons lavés à température ambiante (22-28 oC) pendant 7 jours.
   4. Répétez la procédure de lavage à l'aide d'eau ultrapure comme agent de lavage.
3. Extraire la mâchoire du tissu du corps à l'aide de forceps de coupe d'os. Appliquer les étapes 1.5-3.2.4 sur les échantillons de mâchoire.
4. Peser (75 à 5 mg) d'échantillons de nageoires ou d'os de mâchoire séchés et moudre à l'aide d'un batteur de perles à 50 Hz pendant 32 min.
   1. Fournir 1,5 ml de méthanol dans chaque tube contenant une nageoire ou une mâchoire en poudre à l'aide d'une pipette de 1 000 l. Placer les échantillons sur un rotateur de tube à rotation lente (40 tr/min) pendant 18 h à température ambiante pour extraire le cortisol avec un mélange continu.
5. Après l'extraction du cortisol, centrifuger les échantillons à 9 500 x g pendant 10 min à température ambiante. Après centrifugation, recueillir la couche organique supérieure contenant du cortisol (1 ml) de chaque échantillon et le placer dans un tube microcentrifuge séparé de 1,5 ml.
   1. Séchez les échantillons par incubation à 38 oC pour évaporer le méthanol. Gardez les échantillons de cortisol extraits sous une hotte de fumée pendant la nuit pour permettre au méthanol de se dissiper.
      REMARQUE : La couche contenant du cortisol est généralement de couleur jaunâtre.

4. Détection de cortisol de fin

1. Décongelez les échantillons de nageoires séchées ou d'os de mâchoire à température ambiante pendant 1,5 h avant d'utiliser le kit ELISA.
2. Ajouter 400 ll de tampon de phosphate, de vortex et de centrifugeuse à 1 500 x g pendant 15 min.
3. Exécuter chaque échantillon (25 L) en double pour améliorer la précision et la fiabilité des tests. Supprimez toutes les données en dehors de la courbe standard en tant que valeurs aberrantes.
4. Définir un lecteur de microplaque à 450 nm, puis définir à 'g dL^-1 et lire la densité optique de la plaque.
   1. Utilisez le logiciel de microplaque avec un ajustement de courbe de régression non linéaire à quatre paramètres. Convertissez les niveaux de cortisol des échantillons obtenus à partir du logiciel en pg mg^-1 en utilisant l'équation suivante :
      F 10 000E (A/B) (C/D),
      où F - la valeur finale du niveau de cortisol de la nageoire dans (pg mg^-1), E - le volume (mL) du tampon d'analyse utilisé pour reconstituer l'extrait séché, A - la concentration (g dL^-1) fournie par la sortie d'analyse, B - le poids (mg) de la nageoire soumise à des extra ction, C - le volume (mL) de méthanol ajouté à la nageoire en poudre, et D - le volume (mL) de méthanol récupéré de l'extrait et ensuite séché³.

5.Analyse statistique

1. Divisez chaque échantillon en deux sous-échantillons avant la procédure de lavage, puis exécutez en double pendant l'essai du kit ELISA (2 à 2 à 4 observations par échantillon) afin d'améliorer la puissance du test et la fiabilité des résultats.
2. Comparez les effets des deux solvants de lavage et leurs interactions en appliquant la procédure générale de modèle linéaire (GLM) dans l'environnement logiciel SAS aux données de mesure¹⁸.
3. Testez les différences entre les moyens utilisant le test de Tukey à un niveau significatif de p 'lt; 0.05. Accepter 0,05 lt; p 'lt; 0.10 comme preuve d'une tendance plutôt que comme une différence significative.

Résultats

La technique présentée d'extraction de cortisol de nageoire a été développée et confirmée dans cette étude utilisant trois espèces d'esturgeon. Les niveaux de cortisol obtenus à l'aide d'eau ultrapure et d'isopropanol comme solvants de lavage ont été comparés (figure 2). Le cortisol des mâchoires de H. huso a été examiné pour déterminer si les mâchoires d'esturgeon pourraient être employées comme matrice alternative aux nageoires...

Discussion

L'esturgeon est parfois appelé un « fossile vivant » parce qu'il a exposé peu d'adaptations au cours des derniers millénaires. Le genre esturgeon Acipenser contient 27 espèces qui produisent du caviar; cependant, trois espèces (beluga, baerii et sevruga) produisent la majeure partie de l'approvisionnement mondial en caviar. Les esturgeons sont vulnérables à la surpêche et à l'interférence dans leur habitat naturel et sont donc plus en danger critique d'extinction que tout autre groupe d'espèces. L'e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117