Estrazione di Cortisol da Sturgeon Fin e Matrici Jawbone

Riepilogo

In questo studio, presentiamo un protocollo per l'estrazione del cortisolo dalla pinna e mascella delle specie di storione. I livelli di cortisolo di pinna e mascella sono stati ulteriormente esaminati confrontando due solventi per il lavaggio seguiti dai saggi ELISA. Questo studio ha sperimentato la fattibilità del cortisolo mascellare come un nuovo indicatore di stress.

Abstract

Gli obiettivi di questo studio erano di sviluppare una tecnica per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione utilizzando due solventi di lavaggio (acqua e isopropanolo) e quantificare eventuali differenze nei livelli di cortisolo tra tre specie di storione principali. Le pinne sono state raccolte da 19 storioni sacrificati tra cui sette beluga (Huso huso), sette siberiani (Acipenser baerii), e cinque sevruga (A. stellatus). Gli storioni sono stati raccolti nelle aziende agricole iraniane per 2 anni (2017-2018), e l'analisi dell'estrazione del cortisolo è stata condotta in Corea del Sud (gennaio-febbraio 2019). Le ossa della Mascella di cinque H. huso furono usate anche per l'estrazione del cortisolo. I dati sono stati analizzati utilizzando la procedura glM (General Linear Model) nell'ambiente SAS. I coefficienti di variazione intra-e inter-saggio sono stati rispettivamente di 14,15 e 7,70. In breve, la tecnica di estrazione del cortisolo prevedeva il lavaggio dei campioni (300 x 10 mg) con 3 mL di solvente (acqua ultrapura e isopropanolo) due volte, rotazione a 80 giri/ per 2,5 min, asciugatura d'aria dei campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni, ulteriore i campioni che utilizzano un battitore di perline a 50 Hz per 32 min e li macinano in polvere, applicando 1,5 mL di metanolo alla polvere essiccata (75 x 5 mg) e una rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente con miscelazione continua. Dopo l'estrazione, i campioni sono stati centrifugati (9.500 x g per 10 min), e 1 supernatante mL è stato trasferito in un nuovo tubo di microcentrifuga (1,5 mL), incubato a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo e analizzato tramite l'analisi immunosorante legata agli enzimi (ELISA) . Non sono state osservate differenze nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie o nei livelli di cortisolo a pinna e mascella tra i solventi di lavaggio. I risultati di questo studio dimostrano che la matrice della mascella dello storione è un indicatore di sollecitazione alternativa promettente alle matrici solide.

Introduzione

Cortisolo è un indicatore affidabile dello stress animale. L'estrazione del cortisolo fornisce un quadro valido per i ricercatori per monitorare i livelli di stress e modelli generali nei fattori di stress. Ad esempio, studi precedenti hanno condotto la convalida metodologica delle misurazioni del cortisolo dei capelli utilizzando vari metodi in esseri umani^1,2, scimmie^3,4, bovini⁵, pecore⁶, e pesce rosso^7,8. Nelle specie ittiche, le misurazioni del cortisolo in matrici come squame, muco cutaneo, feci e sangue⁹ hanno dimostrato di fornire informazioni sulla salute dei pesci. Quando il campionamento del sangue è problematico o mancano le scale, sono necessarie matrici alternative per l'estrazione del cortisolo. Nei pesci, matrici alternative possono includere la mascella, un tessuto duro simile al dente umano¹⁰.

Lo sviluppo di nuove matrici e tecniche convalidate per determinare i livelli di stress del pesce è di particolare interesse per l'industria del caviale, dove lo storione può sperimentare un'esposizione prolungata a fattori di stress ambientale¹¹. Il sesso di storione non può essere determinato prima dei 2 anni di età, e lo storione non ha squame. Poiché il cortisolo si accumula gradualmente in matrici solide durante la fase di crescita^2,7,12, i dati di accumulo di cortisolo a lungo termine da matrici dure come pinne e mascelle potrebbero fornire informazioni sullo stress diverse fasi di crescita. Al contrario, i livelli di cortisolo nel sangue forniscono un'istantanea dei livelli di stress al momento della morte e non possono rappresentare con precisione lo stress durante le condizioni di allevamento a lungo termine^13,14. Con l'aumento della concorrenza nel mercato dei caviale, nuovi approcci per migliorare le condizioni di stress per la produzione di ovuli più sani tra le specie di storione durante l'allevamento a lungo termine (8-12 anni o più) sono un'area di ricerca sempre più importante. A causa dell'elevato costo dello storione, i campioni raccolti sono estremamente costosi (8.000-15.000 dollari per pesce maturo a seconda delle specie e della fase di crescita), un fattore limitante per i progetti di ricerca. Tuttavia, lo sviluppo di una tecnica appropriata per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione e dalle mascelle potrebbe essere utilmente applicato sia ai sistemi di allevamento ittico che ai pesci selvatici per migliorare la qualità e la raccolta delle uova di storione sia per il consumo che per conservazione.

Oltre a fornire risultati affidabili⁶, la selezione di un'adeguata tecnica di estrazione del cortisolo è di fondamentale importanza per garantire che altri composti presenti nella matrice durante la preparazione del campione non confondano l'output, il che potrebbe portare a risultati incoerenti. È altrettanto importante determinare se i livelli di cortisolo pinna e mascella sono influenzati dai livelli di ormone nell'acqua circostante. L'Heimbàrge et al.¹⁵ ha suggerito che una serie di fattori possono influenzare i livelli di cortisolo tra cui età, sesso, gravidanza, stagione, colore¹²e regione del corpo da cui il cortisolo viene estratto¹⁶. Tuttavia, sono disponibili poche informazioni sugli effetti dei solventi per il lavaggio sull'estrazione del cortisolo nelle matrici del corpo dei pesci⁸e nessuna su questi effetti nello storione, fatta eccezione per le uova di storione¹⁷.

Anche se l'analisi dei livelli di cortisolo di base dalle pinne e dalle ossa mascellari dello storione richiede che il pesce sia eutanasia, questo approccio non comporta le tecniche invasive necessarie per il campionamento del sangue nello storione vivo. I campioni di pinne e mascelle sono facilmente raccolti e l'estrazione da questi tessuti può essere eseguita rapidamente. Allo stesso modo, l'estrazione e l'analisi degli ormoni sono semplici e richiedono poche attrezzature specializzate.

In questo studio, presentiamo una nuova tecnica e facilmente applicata per l'estrazione, il lavaggio e la determinazione del cortisolo dalle pinne di pesce e dalle mascelle, con l'obiettivo di determinare se i livelli di cortisolo misurati da queste matrici possono essere utilizzati in modo affidabile come stress Indicatori. I vantaggi di questa tecnica includono un approccio⁸ facile e non invasivo, meno variazioni di dati e uscita affidabile^1,6,8,17; la tecnica è applicabile alle specie ittiche senza squame come lo storione. La tecnica richiede la macellazione del pesce, la selezione di adeguati solventi di lavaggio^2,4, corretta macinazione dei campioni^3,5, saggio immunosorbente enzimatico professionale (ELISA) applicazione^5,7, e una vasta conoscenza dell'incorporazione di fonti di cortisolo in matrici solide⁶.

Abbiamo applicato due diversi solventi per il lavaggio (acqua ultrapura e isopropanolo) per ottenere livelli di cortisolo basale nelle pinne da tre specie di storione: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii), e sevruga (A. stellatussa ), in condizioni ambientali standard per ciascuna specie. Le ossa di H. huso furono usate anche per valutare lo stress nello storione. Questo è il primo studio per misurare i livelli di cortisolo nelle ossa mascellari di storione. I risultati di questo studio forniranno dati comparativi di cortisolo per le specie di storione nella fase di crescita precoce (1 anno) prima della determinazione del sesso.

Protocollo

Le seguenti procedure e metodi sperimentali sono stati approvati dall'Autorità per il benessere e l'etica degli animali della Kangwon National University, Chuncheon, Repubblica di Corea.

1. Collezione Fin

1. Catturare delicatamente lo storione usando una rete per ridurre al minimo le lesioni e lo stress.
2. Sciacquare il pesce con attenzione con acqua dolce e quindi pulire la superficie del corpo con un asciugamano assorbente prima dell'eutanasia.
3. Colpisci la testa del pesce usando un martello di plastica in modo che il pesce sia stordito o perda conoscenza. Rimuovere la testa con un coltello.
4. Misurare il peso corporeo (g) e la lunghezza (cm).
5. Dopo l'eutanasia, raccogliere i campioni di pinna tagliando il più vicino possibile al corpo utilizzando forbici chirurgiche sterilizzate.
   NOTA: per ogni pesce devono essere utilizzati asciugamani assorbenti singoli e non riciclati. Le statistiche descrittive per le specie utilizzate in questo studio sono state le seguenti: storione beluga (H. huso): età : 18 2,1 mesi, peso corporeo , 2.700 x 300 g, e lunghezza del corpo 55 , 5 cm; Storione siberiano(A. baerii): età: 9,6 x 2,4 mesi, peso corporeo , 1.750 x 250 g, e lunghezza del corpo: 45 x 5 cm; Storione di sevruga(A. stellatus): età : 14 x 1,3 mesi, peso corporeo 1.000 x 100 g, e lunghezza del corpo 65 x 5 cm.

2. Preparazione fin per l'estrazione del cortisolo

1. Collocare i campioni di pinne (un campione per tessuto: 3 g) su carta da pesatura di laboratorio (107 mm e 210 mm) e asciugarli a temperatura ambiente per alcuni giorni fino all'asciutto.
2. Avvolgere i campioni in fogli di foglio di alluminio, mettere in sacchetti di plastica etichettati, e trasferire al laboratorio.
3. Conservare i campioni in frigorifero per un ulteriore utilizzo, tra cui lavaggio, estrazione del cortisolo, essiccazione e analisi ELISA (Figura 2).

3. Fin cortisolo analisi

1. Calibrare la bilancia analitica digitale (precisione: 0.0001) e pesare campioni da 300 x 10 mg con carta di pesatura sulla teglia della bilancia.
2. Lavare i campioni.
   1. Trasferire ogni campione in un tubo di polipropilene conico da 15 L. Aggiungere 3 mL di isopropanolo ad ogni tubo utilizzando una pipetta a canale singolo da 5.000 l.
   2. Ruotare i tubi a 80 giri per 2,5 min per lavare il cortisolo e rimuovere qualsiasi potenziale contaminazione esterna. Ripetere questa procedura due volte.
   3. Asciugare all'aria i campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni.
   4. Ripetere la procedura di lavaggio utilizzando acqua ultrapura come agente di lavaggio.
3. Estrarre l'osso mascellare dal tessuto corporeo utilizzando pinze di taglio osseo. Applicare i passaggi da 1.5 a 3.2.4 ai campioni della mandibola.
4. Pesare i campioni di pinna o mascella essiccati (75 x 5 mg) e macinare con un battitore di perline a 50 Hz per 32 min.
   1. Fornire 1,5 mL di metanolo in ogni tubo contenente pinna o mascella in polvere utilizzando una pipetta da 1000 L. Posizionare i campioni su un rotatore tubo a rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente per estrarre il cortisolo con miscelazione continua.
5. Dopo l'estrazione del cortisolo, centrifugare i campioni a 9.500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato organico superiore contenente cortisolo (1 mL) da ogni campione e collocarlo in un tubo di microcentrifuga separato da 1,5 mL.
   1. Asciugare i campioni per incubazione a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo. Tenere i campioni di cortisolo estratti sotto una cappa di fumi durante la notte per consentire al metanolo di dissiparsi.
      NOTA: Lo strato contenente cortisolo è di solito di colore giallastro.

4. Rilevamento cortisolo fin

1. Scongelare i campioni di pinna secca o mascella a temperatura ambiente per 1,5 h prima di utilizzare il kit ELISA.
2. Aggiungere 400 l di tampone di fosfato, vortice e centrifugaa a 1.500 x g per 15 min.
3. Eseguire ogni campione (25 l) in duplicato per migliorare la precisione e l'affidabilità del saggio. Rimuovere tutti i dati al di fuori della curva standard come outlier.
4. Impostare un lettore di micropla a 450 nm, quindi impostare su .g dL^-1 e leggere la densità ottica della piastra.
   1. Utilizzare il software microplacca con una curva di regressione non lineare a quattro parametri. Convertire i livelli di cortisolo dei campioni ottenuti dal software in pg mg^-1 utilizzando la seguente equazione:
      F - 10.000E (A/B) (C/D),
      dove F - il valore finale del livello di cortisolo pinna in (pg mg^-1), E - il volume (mL) del buffer di prova utilizzato per ricostituire l'estratto essiccato, A - la concentrazione (g dL^-1) fornita dall'uscita del saggio, B - il peso (mg) della pinna sottoposta a extra Ction, C - il volume (mL) del metanolo aggiunto alla pinna in polvere, e D - il volume (mL) del metanolo recuperato dall'estratto e successivamente essiccato³.

5.Analisi statistica

1. Dividere ogni campione in due sottocampioni prima della procedura di lavaggio e quindi eseguire in duplicato durante il test del kit ELISA (2 x 2 x 4 osservazioni per campione) per migliorare la potenza del test e l'affidabilità dei risultati.
2. Confrontare gli effetti dei due solventi di lavaggio e le loro interazioni applicando la procedura del modello lineare generale (GLM) nell'ambiente software SAS ai dati di misurazione¹⁸.
3. Verificare le differenze tra i mezzi utilizzando il test di Tukey a un livello di significatività di p < 0.05. Accettare 0,05 < p < 0,10 come prova di una tendenza anziché come differenza significativa.

Risultati

La tecnica di estrazione del cortisolo pinna presentata è stata sviluppata e confermata in questo studio utilizzando tre specie di storione. I livelli di cortisolo ottenuti utilizzando acqua ultrapura e isopropanolo come solventi per il lavaggio sono stati confrontati (Figura 2). Cortisolo da H. huso mascella ossa è stato esaminato per determinare se gli storioni possono essere utilizzati come matrice alternativa alle pinne. Gli effetti del solvent...

Discussione

Sturgeon è talvolta chiamato un "fossile vivente" perché ha mostrato pochi adattamenti nel corso dei millenni passati. Il genere storione Acipenser contiene 27 specie che producono caviale; tuttavia, tre specie (beluga, baerii e sevruga) producono la maggior parte dell'approvvigionamento di caviale globale. Gli storioni sono vulnerabili alla pesca eccessiva e alle interferenze nel loro habitat naturale e sono quindi più a rischio di estinzione di qualsiasi altro gruppo di specie. Sturgeon appartiene al più a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117