Extração de cortisol de matrizes de Sturgeon Fin e Jawbone

Resumo

Neste estudo, apresentamos um protocolo de extração de cortisol da barbatana e mandíbula de espécies de esturjão. Os níveis do cortisol da aleta e do Jawbone foram examinados mais adicional comparando dois solventes de lavagem seguidos por ensaios de ELISA. Este estudo pilotou a viabilidade do cortisol do Jawbone como um indicador novo do esforço.

Resumo

Os objetivos deste estudo foram desenvolver uma técnica para a extração de cortisol a partir de barbatanas de esturjão utilizando dois solventes de lavagem (água e isopropanol) e quantificar quaisquer diferenças nos níveis de cortisol Fin entre três espécies principais de esturjão. As barbatanas foram colhidas de 19 esturjão sacrificados, incluindo sete beluga (Huso Huso), sete siberianos (Acipenser baerii), e cinco Sevruga (A. stellatus). Os esturjão foram levantados em fazendas iranianas por 2 anos (2017-2018), e a análise da extração do cortisol foi conduzida em Coreia sul (janeiro-fevereiro 2019). Os Jawbones de cinco H. Huso foram usados igualmente para a extração do cortisol. Os dados foram analisados utilizando-se o procedimento de modelo linear geral (GLM) no ambiente SAS. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foram de 14,15 e 7,70, respectivamente. Resumidamente, a técnica de extração de cortisol envolveu a lavagem das amostras (300 ± 10 mg) com 3 mL de solvente (água ultrapura e isopropanol) duas vezes, rotação a 80 rpm por 2,5 min, secagem de ar as amostras lavadas à temperatura ambiente (22-28 ° c) por 7 dias, secagem adicional as amostras usando um batedor de talão em 50 Hz para 32 min e moagem-los em pó, aplicando 1,5 mL de metanol para o pó seco (75 ± 5 mg), e rotação lenta (40 rpm) para 18 h em temperatura ambiente com mistura contínua. Após a extração, as amostras foram centrifugadas (9.500 x g por 10 min), e 1 ml de sobrenadante foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga (1,5 ml), incubados a 38 ° c para evaporar o metanol e analisados via ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) . Não foram observadas diferenças nos níveis de cortisol Fin entre as espécies ou nos níveis de cortisol de barbatana e mandíbula entre solventes de lavagem. Os resultados deste estudo demonstram que a matriz do Jawbone do esturjão é um indicador alternativo prometedor do esforço às matrizes contínuas.

Introdução

O cortisol é um indicador fiável do stress animal. Extração de cortisol fornece um quadro válido para os pesquisadores para monitorar os níveis de estresse e padrões gerais em estressores. Por exemplo, estudos prévios realizaram validação metodológica de medições de cortisol capilar utilizando vários métodos em humanos^{1,2, macacos3,4, bovinos5}, ovinos⁶e Goldfish^7,8. Em espécies de peixes, as medições de cortisol em matrizes como escalas, muco cutâneo, fezes e sangue⁹ foram mostradas para fornecer informações sobre a saúde dos peixes. Quando a amostragem de sangue é problemática ou as escalas faltam, matrizes alternativas para a extração do cortisol são necessários. Em peixes, matrizes alternativas podem incluir o osso maxilar, um tecido duro semelhante ao dente humano¹⁰.

O desenvolvimento de novas matrizes e técnicas validadas para determinar os níveis de estresse dos peixes é de particular interesse para a indústria de caviar, onde o esturjão pode experimentar exposição prolongada a fatores de estresse ambiental¹¹. O sexo do esturjão não pode ser determinado antes dos 2 anos de idade, e o esturjão não tem escalas. Porque o cortisol se acumula gradualmente em matrizes sólidas durante a fase de crescimento^2,7,12, dados de acumulação de cortisol de longo prazo de matrizes duras, tais como barbatanas e Jawbones poderia fornecer insight sobre o stress níveis em diferentes estágios de crescimento. Em contrapartida, os níveis de cortisol no sangue proporcionam um instantâneo dos níveis de estresse no momento da morte e não podem representar com precisão o estresse durante as condições de criação de longo prazo^13,14. Com o aumento da concorrência no mercado de caviar, novas abordagens para melhorar as condições de stress para a produção de ovos mais saudáveis entre as espécies de esturjão durante a criação de longo prazo (8-12 anos ou mais) são uma área cada vez mais importante de pesquisa. Devido ao alto custo do esturjão, as amostras colhidas são extremamente dispendiosas ($ 8000-15000 por peixe maduro, dependendo da espécie e do estágio de crescimento), um fator limitante para projetos de pesquisa. No entanto, o desenvolvimento de uma técnica adequada para a extração de cortisol de barbatanas de esturjão e mandíbula poderia ser aplicado de forma útil tanto para sistemas de piscicultura e em peixes selvagens para melhorar a qualidade e colheita de ovos de esturjão para consumo e Conservação.

Além de fornecer resultados confiáveis⁶, a seleção de uma técnica de extração de cortisol adequada é de importância crucial para garantir que outros compostos presentes na matriz durante a preparação da amostra não confundir a saída, o que pode levar a resultados inconsistentes. É igualmente importante determinar se os níveis de cortisol da aleta e do Jawbone são influenciados pelos níveis hormonais na água circunvizinha. Heimbürge et al.¹⁵ sugeriram que uma série de fatores pode influenciar os níveis de cortisol, incluindo idade, sexo, gravidez, estação, cor¹²e região do corpo a partir do qual o cortisol é extraído¹⁶. No entanto, pouca informação está disponível sobre os efeitos da lavagem de solventes na extração de cortisol em matrizes de corpo de peixe⁸, e nenhum sobre estes efeitos em esturjão, exceto para os ovos de esturjão¹⁷.

Embora a análise dos níveis basais de cortisol das barbatanas e mandíbula do esturjão exija que o peixe seja eutanasiado, essa abordagem não implica as técnicas invasivas necessárias para a amostragem de sangue em esturjão vivo. As amostras da aleta e do Jawbone são coletadas facilmente, e a extração destes tecidos pode ser executada ràpida. Da mesma forma, extração e análise hormonal são simples e exigem pouco equipamento especializado.

Neste estudo, apresentamos uma técnica nova e facilmente aplicada para a extração, lavagem e determinação do cortisol a partir de barbatanas de peixe e mandíbula, com o objetivo de determinar se os níveis de cortisol medidos a partir dessas matrizes podem ser utilizados de forma confiável como estresse Indicadores. As vantagens desta técnica incluem uma abordagem fácil e não invasiva⁸ , menor variação de dados e saída confiável^1,6,8,17; a técnica é aplicável a espécies de peixes sem escalas como o esturjão. A técnica requer abate do^{peixe, seleção}de solventes de lavagem apropriados^{2,4, moagem}adequada das amostras^3,5, ensaio imunoenzimático profissional (ELISA) aplicação^5,7e amplo conhecimento da incorporação de fontes de cortisol em matrizes sólidas⁶.

Aplicamos dois diferentes solventes de lavagem (água ultrapura e isopropanol) para obter níveis de cortisol basal em barbatanas de três espécies de esturjão: beluga (Huso Huso), Siberian (Acipenser baerii) e Sevruga (A. stellatus ), em condições ambientais padrão para cada espécie. Os Jawbones de H. Huso foram usados igualmente para avaliar o esforço no Sturgeon. Este é o primeiro estudo para medir os níveis de cortisol em mandíbula de esturjão. Os resultados deste estudo proporcionarão dados comparativos de cortisol para espécies de esturjão na fase inicial de crescimento (~ 1 ano) antes da determinação do sexo.

Protocolo

Os seguintes procedimentos e métodos experimentais foram aprovados pela autoridade de ética e bem-estar dos animais da Universidade Nacional de Kangwon, Chuncheon, República da Coréia.

1. coleção da aleta

1. Capture o esturjão delicadamente usando uma rede para minimizar ferimento e esforço.
2. Enxágüe o peixe cuidadosamente com água fresca e, em seguida, limpe a superfície do corpo com uma toalha absorvente antes da eutanásia.
3. Bata a cabeça do peixe usando um martelo de plástico de tal forma que o peixe é atordoado ou perde a consciência. Retire a cabeça usando uma faca.
4. Meça o peso corporal (g) e o comprimento (cm).
5. Após a eutanásia, colete amostras da aleta cortando tão perto quanto o corpo como possível usando tesouras cirúrgicas esterilizadas.
   Nota: as toalhas absorventes individuais não recicláveis devem ser utilizadas para cada peixe. As estatísticas descritivas para as espécies utilizadas neste estudo foram as seguintes: esturjão de beluga (H. Huso): idade = 18 ± 2,1 meses, peso corporal = 2.700 ± 300 g e comprimento corporal = 55 ± 5 cm; Esturjão siberiano (A. baerii): idade = 9,6 ± 2,4 meses, peso corporal = 1.750 ± 250 g e comprimento do corpo = 45 ± 5 cm; Sevruga esturjão (A. stellatus): idade = 14 ± 1,3 meses, peso corporal = 1.000 ± 100 g e comprimento do corpo = 65 ± 5 cm.

2. preparação da aleta para a extração do cortisol

1. Coloque as amostras de barbatana (uma amostra por tecido: ~ 3 g) em papel de pesagem laboratorial (107 mm × 210 mm) e seque à temperatura ambiente por alguns dias até secar.
2. Envolva amostras em folhas de folha de alumínio, coloque em sacos plásticos rotulados e transfira para o laboratório.
3. Armazene amostras em um refrigerador para o uso mais adicional, incluindo a lavagem, a extração do cortisol, a secagem, e a análise de ELISA (Figura 2).

3. análise de cortisol fin

1. Calibre a balança analítica digital (precisão: 0, 1) e pesar 300 ± 10 mg amostras com papel de pesagem na panela de escala.
2. Lave as amostras.
   1. Transfira cada amostra para um tubo de polipropileno cônico de 15 L. Adicione 3 mL de isopropanol a cada tubo utilizando uma pipeta de canal único de 5.000 μL.
   2. Gire os tubos em 80 rpm por 2,5 min para lavar o cortisol e remover qualquer potencial contaminação externa. Repita este procedimento duas vezes.
   3. Seque as amostras lavadas à temperatura ambiente (22-28 ° c) durante 7 dias.
   4. Repita o procedimento de lavagem utilizando água ultrapura como agente de lavagem.
3. Extraia o osso maxilar do tecido do corpo usando fórceps de corte ósseo. Aplique as etapas de 1,5 a 3.2.4 às amostras de osso maxilar.
4. Pese (75 ± 5 mgs) amostras secas da aleta ou do Jawbone e moer usando um batedor do grânulo em 50 hertz para 32 minutos.
   1. Entregue 1,5 mL de metanol em cada tubo contendo barbatana em pó ou mandíbula usando uma pipeta de 1000 μL. Coloc as amostras em um rotator do tubo na rotação lenta (40 rpm) para 18 h na temperatura ambiente para extrair o cortisol com mistura contínua.
5. Após a extração de cortisol, Centrifugue as amostras em 9.500 x g por 10 min à temperatura ambiente. Após a centrifugação, colete a camada orgânica superior que contem o cortisol (1 mL) de cada amostra e coloc a em um tubo separado do microcentrifugador de 1,5 mL.
   1. Seque as amostras por incubação a 38 ° c para evainar o metanol. Mantenha as amostras de cortisol extraídas uma capa de fumaça durante a noite para permitir que o metanol se dissipar.
      Nota: a camada contendo cortisol é geralmente de cor amarelada.

4. deteção do cortisol da aleta

1. Descongelar as amostras de barbatanas secas ou de mandíbula à temperatura ambiente durante 1,5 h antes de utilizar o kit ELISA.
2. Adicionar 400 μL de tampão fosfato, vortex e centrifugador a 1.500 x g durante 15 min.
3. Execute cada amostra (25 μL) em duplicado para melhorar a precisão e a fiabilidade do ensaio. Remova todos os dados fora da curva padrão como outliers.
4. Ajuste um leitor do microplate a 450 nanômetro, a seguir ajustado a μg dL^-1 e leia a densidade ótica da placa.
   1. Use o software de microplacas com um ajuste de curva de regressão não linear de quatro parâmetros. Converta os níveis de cortisol das amostras obtidas do software em PG MG^-1 usando a seguinte equação:
      F = 10, 000E (A/B) (C/D),
      onde F = o valor final do nível de cortisol Fin em (PG MG^-1), E = o volume (ml) do tampão de ensaio utilizado para reconstituir o extrato seco, a = a concentração (μg DL^-1) fornecida pela saída do ensaio, B = o peso (mg) da nadadeira submetida a extra C = volume (mL) de metanol adicionado à nadadeira em pó, e D = volume (mL) de metanol recuperado do extrato e posteriormente secado³.

5. análise estatística

1. Divida cada amostra em duas subamostras antes do procedimento de lavagem e, em seguida, corra em duplicado durante o ensaio do kit ELISA (2 × 2 = 4 observações por amostra) para melhorar a potência do teste e a confiabilidade dos resultados.
2. Compare os efeitos dos dois solventes de lavagem e suas interações aplicando o procedimento de modelo linear geral (GLM) no ambiente de software SAS aos dados de medição¹⁸.
3. Diferenças de teste entre médias utilizando o teste de Tukey a um nível de significância de p < 0, 5. Aceitar 0, 5 < p < 0,10 como evidência de uma tendência em vez de como uma diferença significativa.

Resultados

A técnica de extração de cortisol Fin apresentada foi desenvolvida e confirmada neste estudo com três espécies de esturjão. Os níveis de cortisol obtidos com água ultrapura e isopropanol como solventes de lavagem foram comparados (Figura 2). O cortisol de H. Huso Jawbones foi examinado para determinar se os Jawbones do esturjão puderam ser usados como uma matriz alternativa às nadadeiras. Os efeitos do solvente de lavagem, espécies de estu...

Discussão

O esturjão é às vezes chamado de "fóssil vivo" porque exibiu poucas adaptações ao longo dos últimos milênios. O gênero de esturjão Acipenser contém 27 espécies que produzem caviar; no entanto, três espécies (beluga, baerii e Sevruga) produzem a maior parte do suprimento global de caviar. Esturjão são vulneráveis à sobrepesca e interferência em seu habitat natural e, portanto, são mais criticamente ameaçadas do que qualquer outro grupo de espécies. O esturjão pertence ao grupo o mais velho ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117