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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles détaillés de traitement pour l'imagerie des échantillons de tissus délicats à l'aide de la microscopie électronique à balayage (SEM). Trois méthodes de traitement différentes, à savoir, le séchage chimique du disilazana hexaméthylique (HMDS), le séchage simple à l'air et le séchage à points critiques sont décrits pour la préparation de coquilles d'œufs rigides, d'embryons à un stade de développement précoce et de cultures fongiques respectivement.

Résumé

Bien que la microscopie électronique à balayage (SEM) soit largement utilisée pour l'analyse ultra-structurale de divers échantillons biologiques et non biologiques, les méthodes impliquées dans le traitement de différents échantillons biologiques impliquent des pratiques uniques. Toutes les pratiques conventionnelles décrites dans la littérature pour le traitement des échantillons trouvent encore des applications utiles, mais des changements subtils dans la préparation de l'échantillon peuvent modifier la qualité de l'image, ainsi que, introduire des artefacts. Par conséquent, l'utilisation d'une technique unique de préparation d'échantillons spécifique au type de tissu analysé est nécessaire pour obtenir une image de bonne qualité avec une résolution ultrastructurale. L'objectif de cette étude est de fournir les protocoles optimaux de préparation de l'échantillon pour l'imagerie des embryons, des coquilles d'œufs rigides et des cultures fongiques à l'aide de SEM. Les optimisations suivantes ont été recommandées pour donner de bons résultats pour les trois différents échantillons biologiques délicats étudiés. L'utilisation de fixatifs plus doux comme le paraformaldéhyde de 4 % ou le glutaraldéhyde de 3 % suivi de la déshydratation avec la série d'éthanol est obligatoire. Le mycélium fongique sur les blocs d'agar obtenus par les cultures de diapositives donne une meilleure intégrité ultrastructurale par rapport aux cultures prises directement à partir de plaques d'agar. Le séchage chimique des embryons avec HMDS permet le séchage sans introduire d'artefacts de tension de surface par rapport au séchage à points critiques. Le SMDM empêche la fissuration causée par le rétrécissement, car les échantillons sont moins cassants pendant le séchage. Cependant, pour la culture fongique, le séchage par point critique offre une qualité d'image acceptable par rapport au séchage chimique. Les coquilles d'œufs peuvent être représentées sans étapes de préparation spéciales, sauf pour un lavage complet et un séchage à l'air avant le montage. Les méthodes de préparation ont été normalisées en fonction de la qualité d'image acceptable obtenue à chaque essai.

Introduction

L'analyse ultrastructurale de microscope électronique de balayage (SEM) et la microscopie intracellulaire de formation image complètent la lumière pour le profilage tridimensionnel des procaryotes, des usines, et des animaux. La haute résolution spatiale d'un SEM en fait l'une des techniques les plus polyvalentes et les plus puissantes disponibles pour l'examen des caractéristiques microstructurales des spécimens à l'échelle nanométrique à micromètre. Les spécimens desséchés sont résolus aux structures compositionnelles et topographiques avec le détail intense, qui fournit la base pour développer des conclusions valides au sujet des relations fonctionnelles1,2,3 , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Lors de l'interprétation des images SEM de spécimens biologiques, il est très difficile de faire la distinction entre les structures indigènes et les artefacts qui sont créés au cours du traitement. SEM est généralement exploité à des vides très élevés pour éviter toute interférence des molécules de gaz affectant les faisceaux d'électrons primaires, secondaires ou rétrodiffusés émis par l'échantillon10,11. En outre, les matériaux biologiques sont sensibles aux dommages causés par les radiations en raison de leurs propriétés pauvres ou non conductrices. Il est essentiel que les spécimens chargés dans le SEM soient complètement secs et exempts de tout contaminant organique afin d'éliminer tout dégazage possible dans un environnement à vide élevé10,11. Comme les spécimens biologiques sont principalement composés d'eau, d'autres techniques de préparation sont nécessaires pour s'assurer que les structures indigènes sont conservées.

La résolution obtenue est basée sur l'optimisation des méthodes de préparation spécifiques aux types de spécimens et aux paramètres instrumentaux utilisés. Ainsi, il est nécessaire d'éviter d'utiliser des étapes de traitement généralisées pour tous les types de tissus. Certains spécimens biologiques exigeront un traitement moins rigoureux pour préserver leur structure, tandis que plus de temps et de soins pourraient être nécessaires pour les types délicats d'échantillons afin d'éviter l'introduction d'artefacts de séchage, tels que le rétrécissement et l'effondrement. La préparation de l'échantillon est une étape critique dans l'imagerie SEM; les résultats des études morphométriques sont remarquablement influencés par les procédures de préparation des spécimens12,13. Les étapes de préparation courantes pour de nombreux échantillons biologiques sont la fixation, la déshydratation et le revêtement avec un métal comme l'or, le platine ou le palladium pour convertir leurs surfaces pour être conductrices pour l'analyse SEM. La nature et la combinaison des étapes utilisées varient selon le type de tissu et les objectifs spécifiques de l'étude. L'accumulation de charges, la sensibilité aux dommages causés par le vide et les faisceaux d'électrons posent des problèmes lors du traitement d'échantillons biologiques délicats, ce qui fait qu'il faut d'autres étapes de traitement pour conserver la structure indigène de l'objet. L'utilisation de méthodes conventionnelles telles que la fixation du tétroxide d'osmium, et la déshydratation causent le rétrécissement et l'effondrement des tissus délicats14,15,16,17. L'objectif de l'étude est d'établir des méthodologies élégantes dérivées en combinant des idées d'études antérieures avec des modifications pour préparer et imager les tissus délicats mous (p. ex. embryons de reptiles, coquille d'œuf de tortues peintes et cultures fongiques).

La sélection d'une méthode de fixation appropriée est la première étape la plus importante pour l'analyse microscopique des spécimens biologiques. La fixation des tissus immédiatement après l'isoler d'un organisme est essentielle pour empêcher l'altération de leur morphologie due à la décomposition. Un fixatif efficace devrait mettre fin aux processus cellulaires en permédiant les cellules rapidement et en maintenant l'effet de façon irréversible pour stabiliser la structure de l'échantillon pour résister à la fois aux étapes de traitement et à l'examen ultérieurs dans le cadre du SEM17 , 18. Bien que plusieurs méthodes chimiques et physiques de fixation soient connues, la fixation chimique est plus couramment utilisée pour les spécimens biologiques afin d'éviter tout changement cellulaire dû à l'autolyse, à la putréfaction et aux effets de séchage. Il existe de nombreuses formulations chimiques fixatives discutées dans la littérature17,19,20,21,22,23, fixatives qui fonctionnent par dénaturation et coagulant les macromolécules biologiques, et celles qui se fixent par macromolécules covalentes de liaison croisée. Les alcools sont utilisés comme fixatifs dénaturants qui préservent l'ultrastructure très mal et sont utilisés principalement pour la microscopie légère et non recommandés pour l'analyse microscopique des électrons. Les fixatifs croisés comme le formaldéhyde, le glutaraldéhyde et le tétroxide d'osmium créent des liaisons intermoléculaires et intramoléculaires entre les macromolécules dans les tissus, offrant une excellente préservation des ultra-structures11 ,24,25,26. Les échantillons biologiques sont sensibles à la température. Il est recommandé de réduire la mobilité latérale des protéines membranaires, de ralentir la diffusion des molécules intercellulaires et de ralentir le taux de fixation11. Le temps nécessaire à la fixation des tissus dépend en grande partie de la taille de l'échantillon et de la vitesse à laquelle le fixatif se diffuse et réagit avec les composants de l'échantillon. Une fixation de nuit dans 4% de paraformaldéhyde ou 3% de glutaraldéhyde dans pbS à 4 oC est la méthode préférée pour l'analyse SEM des spécimens utilisés dans cette étude pour leurs propriétés pénétrantes séquentielles, qui permettent de traiter de plus petits échantillons délicats17 , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 27. Une étape post-fixation avec le tétroxide d'osmium est éliminée non seulement en raison de sa nature toxique, mais aussi en raison de sa nature toxique, mais aussi trouvé à mettre en œuvre aucun avantage supplémentaire pour améliorer la qualité de l'image pour les échantillons analysés dans cette étude.

Les échantillons biologiques contiennent des fluides qui interfèrent avec le fonctionnement du SEM; par conséquent, les échantillons doivent être séchés avant de l'insérer dans la chambre d'échantillon SEM. Une fois la déshydratation assurée, le solvant doit être retiré du tissu sans créer d'artefacts dans les spécimens en raison de la tension de surface/séchage. Trois méthodes de séchage différentes ont été couramment utilisées lors du traitement des tissus pour l'imagerie SEM: séchage à l'air, séchage point critique, et le gel des échantillons de séchage28,29,30,31. Peu d'études rapportent que les trois méthodes de séchage produisent des résultats identiques avec des échantillons de tissus animaux28,29,30,31. Une pratique générale utilisée pour les petits spécimens est la déshydratation chimique par la série de concentration ascendante de l'alcool et hexamethyldisilazane (HMDS), mais les spécimens plus grands sont séchés à l'aide d'un point critique de séchage (CPD) instrument32. Pendant le processus de séchage, des forces considérables se sont formées dans de petites cavités qui sont passées à travers le spécimen par une interface liquide/gaz; cela peut même conduire à un effondrement complet des structures creuses33. Toute déformation due au traitement pourrait alors être confondue comme une caractéristique structurale indigène du spécimen. Ainsi, le phénomène généralisé pour le traitement devrait être éliminé et un processus de séchage unique devrait être normalisé pour chaque type de tissu particulièrement quand les spécimens délicats de tissu sont analysés.

Dans plusieurs essais menés à l'aide de diverses combinaisons de tous les processus mentionnés ci-dessus, nous avons normalisé les méthodes qui peuvent être utilisées pour l'analyse SEM de trois tissus délicats: embryons de reptiles, coquilles d'œufs de tortues peintes, et les cultures fongiques. Les biologistes et les morphologues développementaux décrivent la morphogénèse normale et anormale pendant le développement d'embryons chez les animaux vertébrés représentatifs. Les recherches sur les voies de signalisation génique dépendent de la description morphologique de structures nouvelles. Pour éviter tout changement brusque dans la structure de l'embryon vertébré au cours de l'analyse SEM, nous recommandons le séchage chimique après déshydratation. Le séchage chimique à l'aide du SDM est la méthode de séchage relativement récente et les avantages comprennent une rapidité relative, une facilité d'utilisation, une perte de coûts et l'expertise et l'équipement limités nécessaires9. La DPC est une technique de séchage couramment utilisée à l'aide de colsaging CO2 à travers les spécimens à une température et une pression spécifiques. Nous avons identifié que le HMDS convient au séchage des tissus mous et délicats et permet de traiter de plus grands échantillons par rapport au séchage à points critiques, ce qui a causé une déformation importante des tissus embryonnaires. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour préparer des échantillons pour l'imagerie SEM afin d'étudier les caractéristiques morphologiques des champignons34. Les spécimens fongiques sont généralement fixés dans le tétroxide d'osmium suivi de la déshydratation de l'éthanol et du séchage critique de point, qui peut fournir des résultats satisfaisants, bien que les effets toxiques du tétroxide d'osmium6,7,35 et la perte de matériaux fongiques tout en changeant des solutions pendant le traitement sont des inconvénients prononcés. La technique de préparation des échantillons utilisant le séchage à l'air sans fixation a également été pratiquée36, mais les résultats en structures rétrécies et effondrées, et l'observation de ces spécimens peut facilement être mal interprétée tout en caractérisant l'espèce. L'hypha fongique perd son intégrité au contact des liquides et un séchage uniforme peut ne pas être réalisé pour restaurer la structure. En raison de cet effet, le lyophilisation est couramment utilisé pour sécher les tissus mous comme le mycélium fongique. Le séchage par congélation fonctionne bien pour les matériaux propres, mais la présence de sels ou de sécrétion obscurcira les détails de surface qui ne seront identifiés qu'à l'étape d'observation de la SEM. Nous avons couplé la méthode de culture de diapositive avec la fixation de glutaraldéhyde et le séchage critique de point pour produire des détails structurels des hyphes et des spores fongiques intacts. Bien que le séchage de CPD ait causé le rétrécissement dans des embryons, il a eu comme conséquence les structures mycéliales bien préservées une fois couplées avec la fixation de glutaraldéhyde. La coquille d'œuf est d'une importance primordiale pour l'embryon d'animaux ovipares en agissant non seulement comme une couverture protectrice, mais aussi en fournissant une stabilité mécanique, la perméabilité au gaz et à l'eau, et une réserve de calcium pour l'embryon en développement. Les coquilles d'œufs de tortues d'eau douce sont classées comme « rigides » en fonction de leur structure, et en raison de leur disponibilité ont reçu une attention significative de la part des biologistes1,2,3,4 , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38.

Nous détaillons des méthodes simples pour l'examen facile des membranes de coquille d'oeuf et de coquille de la tortue peinte qui peuvent être appliquées à n'importe quelle espèce rigide de coquille d'oeuf. Les méthodologies de préparation ont été évaluées en fonction de la qualité de l'image résultante et de la réduction des artefacts potentiels.

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Protocole

REMARQUE : Des œufs de tortue sépareuse (Chrysemys picta) utilisés dans cette étude ont été recueillis pendant la saison de nidance de mai à juin 2015-16 à partir de la station Rice Creek Field, Oswego New York, avec la permission du Département de l'environnement de l'État de New York. Conservation (DEC).

1. Méthode de séchage chimique pour traiter les embryons pour SEM

  1. Recueillir les œufs de tortue s'ils proviennent des champs pendant la saison de nidification. Préparer les chambres d'incubation à l'avance, faites de boîtes en plastique avec couvercles (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm remplis de milieu de literie préparé avec un mélange humide de vermiculite et de mousse de tourbe (1:1 ratio). Faire 4-6 trous d'environ 0,25 cm le long des côtés des boîtes et sur le couvercle pour permettre l'aération.
  2. Retirer délicatement le sol du nid pour découvrir les œufs. Essuyez la surface des œufs de tortue avec de la teinture diluée d'iode (1:25 000) pour contrôler la contamination microbienne pendant l'incubation. Placez les couvées séparées les unes des autres, la taille de la couvée de la tortue peinte peut varier de 5 à 9 œufs et placer un maximum de 8-9 œufs par boîte.
    REMARQUE : Manipulez soigneusement les œufs pendant la collecte, essuyant, étiquetant et plaçant à l'intérieur des boîtes. La position et l'alignement des œufs doivent être les mêmes qu'ils ont été pondus, tout mouvement inhibera le développement des embryons.
  3. Enterrez manuellement la moitié des œufs dans la literie, couvrez et placez la boîte à l'intérieur de l'incubateur à 30 oC. Incuber les œufs pendant 10-17 jours pour obtenir les stades embryonnaires 12, 13 et 18 utilisés respectivement dans cette étude. Ajouter de l'eau distillée pour mouiller partiellement le milieu de literie tous les deux jours afin d'éviter la déshydratation et de maintenir le niveau d'humidité pour le développement normal des embryons.
    REMARQUE : L'incubation et la mise en scène des embryons sont selon un tableau complet du développement publié plus tôt39.
  4. Fixer les embryons en faisant la première coupe sur un côté de la coquille d'œuf dorsal et la membrane jaune ensemble, verticale à l'axe long à l'aide de ciseaux pointus. Insérez soigneusement les ciseaux dans le jaune pour éviter de couper le disque embryonnaire. Maintenant, coupez le côté latéral de l'œuf le long de l'axe long, puis coupez l'autre côté de l'œuf le long de l'axe court.
  5. Peler l'élément excisé avec le côté embryonnaire à l'aide de forceps. Couper l'autre côté latéral de la coquille d'œuf et placer la pièce excisée en saline tamponnée en phosphate (PBS à un pH de 7,4).
    REMARQUE : L'œuf de tortue est rempli de jaune d'œuf très visqueux et le côté dorsal de l'embryon adhère à la membrane de la coquille d'œuf. La membrane de coquille d'œuf près de l'embryon change avec l'incubation du blanc translucide au blanc opaque et crayeux. Cela permet de localiser l'embryon au centre de l'axe long et d'être considéré comme un endroit sombre calcifié de l'extérieur40,41.
  6. Utilisez un stéréomicroscope pour isoler les embryons avec la membrane jaune en les épluchant de la coquille d'œuf à l'aide de forceps. Enlever les membranes extra-embryonnaires à l'aide de forceps et de micro-ciseaux. Transférer l'embryon à l'aide d'une cuillère d'embryon dans un plat Petri frais pour laver le sang ou le jaune.
  7. Utilisez des plaques claires de 12 puits pour fixer les embryons pendant la nuit dans 4 % de paraformaldéhyde dans le PBS à 4 oC ou dans 2 à 3 % de glutaraldéhyde dans le PBS. Placez un à trois embryons dans chaque puits en fonction de la taille des embryons. Assurer une infiltration complète (les échantillons apparaîtront en blanc) pour les embryons plus âgés en prolongeant le temps de fixation de 2 à 3 jours. Rincer les embryons 3x avec du PBS frais pendant 5 min chaque rinçament.
    REMARQUE : Évitez d'endommager la surface de l'embryon en utilisant des inserts en polystyrène avec des fonds en treillis en polyester pour les plaques de 12 puits pour transférer des spécimens d'un solvant à un autre.
  8. Déshydrater les échantillons à l'aide d'une série de concentration d'éthanol dans l'eau distillée : 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 95 % et 100 % et traiter les échantillons pendant 1 h dans chaque solution de déshydratation. Répétez l'étape avec 100% d'éthanol deux fois pour assurer une déshydratation complète. S'il n'est pas utilisé immédiatement, entreposez les échantillons dans 70 % d'éthanol à -20 oC pendant une plus longue période.
  9. Embryons secs utilisant une série de hexamethyldisilazana (HMDS) à 100% concentration d'éthanol: 1:2, 2:1 et 100%. Laisser les échantillons dans chaque solution pendant 20 min et garder le plat Petri partiellement couvert pendant le processus.
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes impliquant des HMDS dans le capot de fumée avec l'équipement personnel nécessaire de protection car HMDS est fortement toxique.
  10. Laissez les embryons dans la solution finale 100% HMDS recouverte entièrement ou partiellement d'une hotte de fumée pendant la nuit, ce qui facilite l'évaporation du HMDS, laissant les échantillons prêts pour le montage et le revêtement par pulvérisation. Couvrir le plat pour éliminer la poussière qui s'installe sur les échantillons.
    REMARQUE : Le tissu apparaîtra blanc après le séchage complet et les échantillons partiellement séchés auront l'air de couleur jaune, laisseront ces tissus dans le capot de fumée pendant une plus longue période.
  11. Choisissez la taille des talons d'aluminium et du ruban adhésif au carbone par taille de l'échantillon analysé. Montez soigneusement les échantillons séchés sur un talon d'épingle en aluminium standard (12,7 mm x 8 mm) à l'aide d'un ruban conducteur en carbone à double bâton (12 mm).
  12. Introduire des échantillons montés dans la chambre du pelage pour enrober le spécimen d'une très fine pellicule d'or pour éliminer l'effet de charge. Plaque d'or les spécimens pour 60-120 s à un crasseurs de 35 mA.
  13. Montez les talons jusqu'aux plaques de pore correspondantes en attachant solidement les manches. Transférer le titulaire de l'échantillon dans ou hors de la chambre d'échantillon de SEM à l'aide de l'outil d'échange d'échantillons. Imagez les échantillons en mode à vide élevé avec une tension de faisceau accélérant de 10 kV et un courant d'émission de 10 A.
    REMARQUE : Portez toujours des gants pendant la manipulation d'échantillons, les porte-échantillons, les talons de montage et les outils de transfert pour éviter la contamination par la graisse des mains vers le système SEM.
  14. Testez d'autres techniques énumérées ci-dessous pour comparer la résolution des spécimens obtenus à partir de la procédure ci-dessus.
    1. Inclure une post-fixation avec 1% de tétroxyde d'osmium pendant 1 h à température ambiante après l'étape 1.7.
    2. Retirez partiellement ou complètement le HMDS à l'étape 1.10 pour une évaporation rapide et rapide du HMDS.
    3. Traiter les embryons après l'étape 1.8 à l'aide du séchage à points critiques (CPD) en suivant les étapes 3.3-3.4.

2. Préparation de la coquille d'œuf pour SEM à l'aide d'une méthode de séchage à l'air

  1. Recueillir et incuber les œufs de tortue peinte (Chrysemys picta) pour fixer les embryons tels que spécifiés dans les étapes 1.1-1.7.
  2. Conservez les coquilles d'œufs dans l'eau distillée après fixation de l'embryon à l'étape 2.1. Nettoyer soigneusement les coquilles d'œufs en trempant dans de l'eau distillée pendant au moins 1 h pour éliminer la contamination par le jaune et l'albumine.
  3. Coquilles d'œufs séchées à l'air après avoir lavé sur des lingettes antistatiques délicates dans le capot de fumée pendant la nuit. Conservez les coquilles d'œufs séchées dans des bouteilles de spécimens propres étiquetées par nombre et par stade.
  4. Montez, claquez le pelage et imagez les spécimens en suivant les étapes spécifiées dans les étapes 1.11-1.13.

3. Méthode critique de séchage de point pour préparer des cultures fongiques pour SEM

  1. Établir des cultures de diapositives
    1. Préparer des supports d'agar de dextrose de pomme de terre (PDA) pour les cultures fongiques : Ajouter 39 g de puissance PDA dans 1 L d'eau distillée dans un flacon Erlenmeyer. Bien mélanger en faisant tourbillonner le flacon et autoclaver le support à 121 oC pendant 30 min. Laissez refroidir la solution multimédia, puis ajoutez l'antibiotique chloramphenicol (25 g/mL) à l'aide d'une micropipette stérile.
      REMARQUE : Après la stérilisation, la solution d'agar doit être chaude et elle ne se solidifiera pas bientôt. Refroidissez-le assez pour qu'il n'inactive pas les antibiotiques.
    2. Mélanger en tourbillonnant et verser les assiettes (environ 10-12 ml de support pour chaque plat Petri de 10 cm), empiler soigneusement et laisser solidifier.
    3. Utilisez une lame de scalpel stérile pour découper de petits blocs d'agar d'environ 1/2 à 3/4 de pouce. Retirez et placez un bloc d'agar sur une lame de microscope en verre propre.
    4. Placez la lame dans un plat Petri propre pour prévenir la contamination et préserver l'humidité pendant l'incubation.
    5. Soulevez la glissière du fond du plat Petri à l'aide d'un cure-dent stérile pour créer une tension de surface entre la plaque et la glissière pour enlever la glissière de verre sans perturber la croissance délicate après l'incubation.
    6. Utilisez une boucle stérile ou une aiguille pour transférer certains des champignons de l'inoculum du spécimen à chacun des quatre côtés du bloc d'agar sur la diapositive.
    7. Placez un bordereau propre sur la surface du bloc d'agar après l'inoculation. Ajouter quelques gouttes d'eau distillée stérile au plat Petri autour de la glissière pour assurer l'humidité des champignons en croissance.
    8. Sceller la plaque en partie à l'aide d'un film de paraffine et incuber la plaque à 30 oC pendant une durée appropriée (pour les espèces de Fusarium couvent de 36 à 48 h).
    9. Retirez la glissière du plat Petri et séparez le bordereau bien adhéré du bloc d'agar à l'aide de forceps stériles. Fixer les blocs d'agar dans 3% de glutaraldéhyde dans PBS pendant la nuit à 4 oC.
  2. Déshydrater les échantillons en passant par une série d'éthanol : 10 %, 25 %, 50 %, 75 % et 90 % avec 15 min par changement. Traiter les échantillons pour la déshydratation finale avec deux changements dans 100% d'éthanol d'une durée de 30 minutes chacun pour assurer une saturation complète.
  3. Séchage des points critiques : Placez les échantillons déshydratés dans la chambre de l'appareil CPD. Sceller et refroidir la chambre en ouvrant les vannes pour permettre au LIQUIDE CO2 d'entrer et d'évacuer l'éthanol, jusqu'à ce que le LIQUIDE CO2 remplisse complètement la chambre.
    1. Scellez et chauffez la chambre lentement pour atteindre un point critique lorsque la pression de la chambre dépasse 1000 psi et que la température dépasse 31 oC, la phase liquide et gazeuse du CO2 est en équilibre. Égoutter lentement le CO2 de la chambre et l'échantillon sous forme de gaz pour éviter les effets de la tension de surface.
  4. Effectuer le montage, le placage d'or et l'imagerie des spécimens en suivant les étapes spécifiées dans les étapes 1.11-1.13.
  5. Effectuez une analyse comparative en séchant chimiquement les spécimens à partir de l'étape 3.2 à l'aide du SMDHm en suivant les étapes 1.9-1.13.

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Résultats

La figure 1 montre l'analyse micrographique électronique de balayage des embryons peints de tortue (Chrysemyspicta). Des œufs de tortue peints recueillis et incubés sur un support de literie, montés sur des talons d'aluminium à la suite d'un séchage chimique, ont été utilisés pour l'imagerie SEM (figure1A-E). Une vue latérale d'un embryon de stade 12 montre les structures craniofacial ; la proéminence maxillaire s'étend au-...

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Discussion

Dans notre étude, différents agents de fixation, méthodes de déshydratation et de séchage ont été testés pour préparer trois différents échantillons biologiques délicats pour l'imagerie SEM : embryons, coquilles d'œufs et cultures fongiques. SEM est couramment utilisé pour l'analyse de surface, de sorte que la pénétration fixative est moins préoccupante, mais il faut comprendre que les structures internes mal fixées causeront le rétrécissement vers l'intérieur ou / et les structures de surface effond...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler

Remerciements

Les auteurs tient à remercier le Dr Daniel Baldassarre, SUNY Oswego pour les discussions et commentaires utiles sur le manuscrit. Cette étude a été appuyée par Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge Grants SUNY Oswego and National Science Foundation (NSF) Small Grants to PGL and JG.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFischer ScientificS25127Afor slide cultures
Aluminum pin stubTedpella1611112.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose AgarBD 213400DF0013-17-6Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
ChloramphenicolFischer BioReagentsBP904-100Antibiotic for media
Coarse VermiculiteGreenhouse MegastoreSO-VER-12bedding medium
Clear 12- well plateCorning07-201-589for fixing embryo
CoverslipsFischer ScientificS17525Bfor slide culture
Critical Point DryerQuorum CPDEMS850critical point drying
Culture dishesFischer Scientific08 747BDISH PETRI 100X10MM 12/PK
EthanolFischer ScientificA406P 4dehydration agent
Forceps- Aquarius TweezersTedpella5804style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
GlutaraldehydeFischer ScientificG151-1fixative
Gold target for sputter coaterDENTON VACUUMTAR001-0158Gold Target, 2.375″ D X .002″
HexamethyldisilazanaFischer ScientificC19479-5000chemical drying agent
Kim wipesKimtechS-8115cleaning
Microscope slidesThermo Scientific67-762-16for slide culture
Microscopy ScissorsTedpella1327Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissorsTedpella1346Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo SpoonFine Science Tools10370-17Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell InsertsCorning0330B0915 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
ParaformaldehydeFischer ScientificT353 500fixative
Peat mossWalmart- Miracle Gro551705263bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tapeTedpella500012 mm OD
Sputter coaterDENTON VACUUMDESK Vthin metal coating
SEMJEOL USAJEOL JSM 6610LV scanning electron scopeelectron microscopy

Références

  1. Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
  2. Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
  3. Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
  4. Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
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