Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos de processamento detalhados para amostras de tecidos delicados de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). Três métodos de processamento diferentes, a saber, a secagem química do disilazana do hexametil (HMDS), a secagem simples do ar, e a secagem crítica do ponto são descritos preparando cascas de ovo rígidas, embriões em estágios adiantados do desenvolvimento, e culturas fungosas respectivamente.

Resumo

Embora a microscopia eletrônica de varredura (MEV) esteja sendo amplamente utilizada para a análise ultraestrutural de várias amostras biológicas e não biológicas, os métodos envolvidos no processamento de diferentes amostras biológicas envolvem práticas únicas. Todas as práticas convencionais descritas na literatura para processamento de amostras ainda encontram aplicações úteis, mas mudanças sutis na preparação da amostra podem alterar a qualidade da imagem, bem como, introduzir artefatos. Assim, a utilização de uma técnica de preparo de amostra única específica para o tipo de tecido analisado é necessária para obter uma imagem de boa qualidade com resolução ultraestrutural. O foco deste estudo é fornecer os protocolos ideais da preparação da amostra para embriões da imagem latente, cascas de ovo rígidas, e culturas fungosas usando o SEM. As seguintes otimizações foram recomendadas para produzir bons resultados para as três diferentes amostras biológicas delicadas estudadas. O uso de fixadores mais leves como paraformaldeído a 4% ou glutaraldeído a 3% seguido de desidratação com séries de etanol é obrigatório. Micélio fúngico em blocos de agar obtidos por culturas de slides produz uma melhor integridade ultraestrutural em comparação com culturas tomadas diretamente de placas de agar. A secagem química de embriões com HMDS fornece secagem sem introduzir artefatos de tensão superficial em comparação com a secagem de ponto crítico. HMDS previne rachaduras causadas por encolhimento como as amostras são menos frágeis durante a secagem. No entanto, para a cultura fúngica, ponto crítico de secagem fornece qualidade de imagem aceitável em comparação com a secagem química. Os Eggshells podem ser imaged sem etapas especiais da preparação à exceção da lavagem completa e do ar que secam antes da montagem. As metodologias de preparo foram padronizadas com base na qualidade de imagem aceitável obtida com cada ensaio.

Introdução

Análise ultraestrutural do microscópio eletrônico de varredura (SEM) e microscopia de luz intracelular do suplemento da imagem latente para o perfilamento tridimensional dos prokaryotes, das plantas, e dos animais. A alta resolução espacial de um MEV torna uma das técnicas mais versáteis e poderosas disponíveis para o exame de características microestruturais de espécimes no nanômetro para escala de micrômetro. Espécimes dessecados são resolvidos para estruturas composicional e topográficas com detalhes intensos, o que fornece a base para o desenvolvimento de conclusões válidas sobre as relações funcionais^{1,2,3 , 4. º , 5. º , 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9}. ao interpretar imagens de sem de espécimes biológicos, é um grande desafio distinguir entre estruturas nativas e os artefatos que são criados durante o processamento. O SEM é operado geralmente em aspiradores muito elevados para evitar toda a interferência das moléculas de gás que afetam os feixes de elétron preliminares, secundários ou backdispersos emitidos da amostra^10,11. Também, os materiais biológicos são suscetíveis aos danos da radiação devido a suas propriedades pobres ou não-conduzindo. É essencial para que os espécimes carregados no sem sejam completamente secos e livres de todos os contaminadores orgânicos para eliminar todo o desgaseificação possível em um ambiente elevado do vácuo^10,11. Como espécimes biológicos são principalmente compostos de água, técnicas preparativas adicionais são necessárias para garantir que as estruturas nativas são mantidas.

A resolução obtida é baseada na otimização dos métodos de preparo específicos para os tipos de amostras e parâmetros instrumentais utilizados. Assim, é necessário evitar o uso de etapas de processamento generalizado para todos os tipos de tecido. Alguns espécimes biológicos exigirá um processamento menos rigoroso para preservar sua estrutura, enquanto mais tempo e cuidados podem ser necessários para tipos delicados de amostras para evitar a introdução de artefatos de secagem, como encolhimento e colapso. A preparação da amostra é um passo crítico na imagem SEM; os achados dos estudos morfométricos são notavelmente influenciados pelos procedimentos de preparo do espécime^12,13. As etapas comuns da preparação para muitas amostras biológicas são fixação, desidratação e revestimento com um metal tal como o ouro, a platina ou o paládio para converter suas superfícies para ser condutoras para a análise de SEM. A natureza e a combinação das etapas utilizadas variarão dependendo do tipo de tecido e dos objetivos específicos do estudo. Acúmulo de carga, sensibilidade ao vácuo e dano de feixe de elétrons colocam problemas ao processar amostras biológicas delicadas suaves, necessitando de etapas adicionais de processamento para reter a estrutura nativa do objeto. O uso de métodos convencionais como a fixação do tetróxido de ósmio e a desidratação causam encolhimento e o colapso dos tecidos delicados^14,15,16,17. O objetivo do estudo é estabelecer metodologias elegantes derivadas combinando ideias de estudos anteriores com modificações para preparar e imagem de tecidos delicados macios (por exemplo, embriões de répteis, casca de ovo de tartarugas pintadas e culturas fúngicas).

A seleção de um método apropriado da fixação é a primeira etapa a mais importante para a análise microscópica de espécimes biológicos. A fixação dos tecidos imediatamente após o isolamento de um organismo é essencial para evitar alterações na sua morfologia devido à decomposição. Um fixador eficaz deve encerrar os processos celulares, permeando as células rapidamente e mantendo o efeito irreversivelmente para estabilizar a estrutura da amostra para suportar as etapas de processamento subsequentes e exame o SEM^{17 , 18}. embora diversos métodos químicos e físicos da fixação sejam sabidos, a fixação química é usada mais geralmente para espécimes biológicos para evitar todas as mudanças celulares devido à autólise, ao putrefaction, e aos efeitos de secagem. Existem inúmeras formulações químicas fixativas discutidas na literatura^{17,19,20,21,22,23}, fixativas que trabalham por desnaturação e coagulando macromoléculas biológicas, e aquelas que fixam por macromoléculas de ligação cruzada covalentemente. Os álcoois são usados como fixadores desnaturando que preservam ultraestrutura muito mal e são usados na maior parte para a microscopia de luz e não recomendado para a análise microscópica do elétron. Os fixadores cross-linking como o formaldeído, o glutaraldeído e o tetróxido do ósmio criam o reticulação intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro dos tecidos, fornecendo a preservação excelente das ultra-estruturas^{11 ,24,25,26}. As amostras biológicas são sensíveis à temperatura. Recomenda-se que a temperatura no início da fixação seja de 4 ° c para reduzir a mobilidade lateral das proteínas da membrana, para retardar a difusão das moléculas intercelulares e retardar a taxa de fixação¹¹. O tempo necessário para a fixação dos tecidos depende em grande parte do tamanho da amostra e da velocidade com que o fixador se difunde e reage com os componentes da amostra. Uma fixação durante a noite em paraformaldeído a 4% ou glutaraldeído a 3% em PBS a 4 ° c é o método preferencial para a análise de MeV de espécimes utilizados neste estudo para suas propriedades penetrantes sequenciais, que permitem a transformação de amostras delicadas menores^{17 , 18 anos} de ^{, 19} anos de ^{, 20} anos de ^{, 27}. um passo pós-fixação com tetroxida de ósmio é eliminado não só devido à sua natureza tóxica, mas também não foi encontrado para implementar nenhuma vantagem adicional para melhorar a qualidade da imagem para as amostras analisadas neste estudo.

As amostras biológicas contêm fluidos que interferem na operação de SEM; daqui, as amostras precisam de ser secas antes de inseri-la na câmara da amostra de SEM. Uma vez que a desidratação é assegurada, o solvente deve ser removido do tecido sem criar artefatos nos espécimes devido à tensão de superfície/secagem. Três diferentes métodos de secagem foram comumente utilizados durante o processamento de tecidos para sem imagem: secagem de ar, secagem de ponto crítico e congelamento de amostras de secagem^28,29,30,31. Poucos estudos relatam todos os três métodos de secagem produzindo resultados idênticos com amostras de tecido animal^28,29,30,31. Uma prática geral usada para espécimes menores são a desidratação química por série de concentração ascendente de álcool e hexametildissilazano (HMDS), mas os espécimes maiores são secos usando um ponto crítico de secagem (CPD) instrumento³². Durante o processo de secagem, forças consideráveis formadas em pequenas cavidades que são passadas através do espécime por uma interface de líquido/gás; Isto pode mesmo conduzir a um colapso completo das estruturas ocas³³. Qualquer deformação que ocorra devido ao tratamento pode então ser confundida como uma característica estrutural nativa do espécime. Assim, o fenômeno generalizado para o processamento deve ser eliminado e um processo de secagem original deve ser estandardizado para cada tipo de tecido especial quando os espécimes delicados do tecido são analisados.

Em vários ensaios realizados utilizando várias combinações de todos os processos acima mencionados, padronizamos os métodos que podem ser utilizados para a análise de MeV de três tecidos delicados: embriões de répteis, cascas de ovos de tartarugas pintadas e culturas fúngicas. Biólogos e morfologistas do desenvolvimento descrevem morfogênese normal e anormal durante o desenvolvimento embrionário em animais vertebrados representativos. As investigações sobre as vias de sinalização genética dependem da descrição morfológica das novas estruturas. Para evitar qualquer mudança abrupta na estrutura do embrião de vertebrados durante a análise de SEM, recomendamos a secagem química após a desidratação. A secagem química usando HMDS é o método de secagem relativamente o mais novo e as vantagens incluem o quickness relativo, a facilidade de utilização, o custo perdido, e a perícia e o equipamento limitados necessários⁹. O CPD é uma técnica de secagem comumente usada usando o de co₂ nos espécimes em uma temperatura e pressão específicas. Nós identificamos que HMDS é apropriado para secar tecidos delicados macios e permite que as amostras maiores sejam processadas comparadas à secagem crítica do ponto, que causou a deformação extensiva aos tecidos embrionário. Vários métodos têm sido utilizados para preparar amostras para a imagem SEM para estudar as características morfológicas dos fungos³⁴. Os espécimes fúngicos são comumente fixados em tetroxida de ósmio, seguidos por desidratação de etanol e secagem de ponto crítico, o que pode proporcionar resultados satisfatórios, embora os efeitos tóxicos do ósmio tetroxida^6,7,35 e perder materiais fúngicos, enquanto as soluções em mudança durante o processamento são desvantagens pronunciadas. A técnica da preparação da amostra que usa o ar-secagem sem fixação foi praticada igualmente³⁶ mas resultados em estruturas encolhidos e desmoronadas, e a observação de tais espécimes pode facilmente ser interpretada mal ao caracterizar a espécie. A hipha fúngica perde sua integridade em contato com líquidos e uma secagem até mesmo pode não ser alcançada para restaurar a estrutura. Devido a este efeito, a liofilização é comumente usada para secar tecidos moles como micélio fúngico. A secagem por congelamento funciona bem para materiais limpos, mas a presença de quaisquer sais ou secreção obscurecer os detalhes superficiais que serão identificados apenas no estágio de visualização de SEM. Nós acoplamos o método da cultura da corrediça com fixação do glutaraldeído e ponto crítico que secam para render detalhes estruturais de hifas e de spores fungosos intactos. Embora a secagem do CPD causasse o encolhimento nos embriões, conduziu às estruturas micelial bem preservadas quando acoplada com a fixação do glutaraldeído. A casca de ovo é de importância primordial para o embrião de animais oviparosos, não só agindo como uma cobertura protetora, mas também proporcionando estabilidade mecânica, permeabilidade ao gás e água, e uma reserva de cálcio para o embrião em desenvolvimento. As cascas de água doce da tartaruga são classificadas como "rígidas" com base em sua estrutura, e devido à sua disponibilidade têm recebido atenção significativa dos biólogos^{1,2,3,4 , 5. º , 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 37 , 38}.

Nós detalham métodos simples para a examinação fácil da casca de ovo e das membranas da casca da tartaruga pintada que pode ser aplicada a toda a espécie rígida da casca de ovo. As metodologias de preparação foram avaliadas com base na qualidade da imagem resultante e redução de artefatos potenciais.

Protocolo

Nota: os ovos de tartaruga pintada (Chrysemys picta) utilizados neste estudo foram recolhidos durante a época de nidificação de maio a junho de 2015-16 de Rice Creek Field Station, Oswego New York, com permissão obtida do departamento de estado de Nova York de Environmental Conservação (DEC).

1. método de secagem química para processar embriões para SEM

1. Colete ovos de tartaruga de locais de campo durante a temporada de nidificação. Prepare as câmaras de incubação com antecedência, feitas de caixas de plástico com tampas (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm preenchido com meio de cama preparado com uma mistura úmida de vermiculita e musgo de turfa (1:1 ratio). Faça 4-6 furos de aproximadamente 0,25 cm ao longo dos lados das caixas e na tampa para permitir a aeração.
2. Retire suavemente o solo do ninho para descobrir os ovos. Limpe a superfície de ovos de tartaruga com tintura de iodo diluída (1:25000) para controlar a contaminação microbiana durante a incubação. Coloc as embreagens separadas de se, o tamanho da embreagem da tartaruga pintada pode variar de 5-9 ovos e coloc um máximo de 8-9 ovos por a caixa.
   Nota: Manuseie cuidadosamente os ovos durante a recolha, limpeza, rotulagem e colocação no interior das caixas. A posição e o alinhamento dos ovos precisam ser os mesmos que foram colocados, qualquer movimento inibirá o desenvolvimento embrionário.
3. Enterrar manualmente os ovos metade na cama, cubra e coloque a caixa dentro da incubadora fixado em 30 ° c. Incubar os ovos por 10-17 dias para obtenção dos estágios embrionários 12, 13 e 18, respectivamente, utilizados neste estudo. Adicione a água destilada para molhar parcialmente o meio do fundamento cada outro dia para evitar a desidratação e para manter o nível de umidade para o desenvolvimento normal dos embriões.
   Nota: os embriões da incubação e da plataforma são de acordo com uma tabela desenvolvente completa publicada mais cedo³⁹.
4. Fixar os embriões, fazendo o primeiro corte em um lado da casca de ovo e gema dorsal juntos, vertical para o eixo longo usando tesouras pontiagudas. Insira a tesoura na gema cuidadosamente para evitar cortar o disco embrionário. Agora corte o lado lateral do ovo ao longo do eixo longo e, em seguida, corte o outro lado do ovo ao longo do eixo curto.
5. Descasque a parte extirpada aberta com o lado do embrião que usa o fórceps. Corte o outro lado lateral da casca de ovo e coloque a peça extirpada em salina tamponada com fosfato (PBS a um pH de 7,4).
   Nota: o ovo da tartaruga é enchido com a gema de ovo altamente viscosa e o lado dorsal do embrião adere à membrana da casca de ovo. A membrana da casca de ovo perto do embrião muda com a incubação do branco translúcido a um branco opaco, Chalky. Isso permite localizar o embrião no centro do eixo longo e ser visto como um ponto calcificado escuro do exterior^40,41.
6. Use um estereomicroscópio para isolar os embriões juntamente com a membrana da gema, descascando-os da casca de ovo usando fórceps. Remova as membranas extra-embrionárias usando fórceps e Microtesoura. Transfira o embrião usando uma colher de embrião para PBS fresco em uma placa de Petri para lavar qualquer sangue ou gema.
7. Use placas claras de 12 poços para fixar os embriões durante a noite em paraformaldeído a 4% em PBS a 4 ° c ou em 2-3% de glutaraldeído em PBS. Coloque um a três embriões em cada poço, dependendo do tamanho dos embriões. Assegure a infiltração completa (as amostras parecerá brancas) para uns embriões mais velhos estendendo o tempo da fixação por 2-3 dias. Enxágüe os embriões 3x com PBS fresco durante 5 min cada enxaguadura.
   Nota: Evite danificar a superfície do embrião usando pastilhas de poliestireno com fundo de malha de poliéster para placas de 12 poços para transferir espécimes de um solvente para outro.
8. Deshidratar amostras utilizando uma série de concentração de etanol em água destilada: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% e 100% e tratar amostras para 1 h em cada solução de desidratação. Repita o passo com 100% de etanol duas vezes para garantir a desidratação completa. Se não for utilizado imediatamente, armazene amostras em 70% de etanol a-20 ° c por um período mais longo.
9. Embriões secos utilizando uma série de hexamethyldisilazana (HMDS) para 100% de concentração de etanol: 1:2, 2:1 e 100%. Deixe as amostras em cada solução por 20 min e mantenha a placa de Petri parcialmente coberta durante o processo.
   Nota: realize todas as etapas envolvendo HMDS na capa das emanações com a engrenagem de proteção pessoal necessária como HMDS é altamente tóxico.
10. Deixe os embriões na solução final de 100% HMDS coberta completamente ou parcialmente em uma capa de fumaça durante a noite auxiliando na evaporação de HMDS, deixando amostras prontas para montagem e revestimento de Sputter. Cubra o prato para eliminar a poeira que se fixam sobre as amostras.
    Nota: o tecido aparecerá branco após a secagem completa e amostras parcialmente secas vai olhar amarelo na cor, deixar esses tecidos na capa de fumaça por um longo tempo.
11. Escolha o tamanho dos esboços de alumínio e fita adesiva de carbono por tamanho da amostra analisada. Monte as amostras secas cuidadosamente em um stub de pino de alumínio padrão (12,7 mm x 8 mm) usando fita condutora de carbono de vara dupla (12 mm).
12. Introduza amostras montadas na câmara do coater do Sputter para revestir o espécime com uma película muito fina do ouro para eliminar o efeito da carga. Placa de ouro os espécimes para 60-120 s em um 35 mA Sputter.
13. Monte os stubs nas placas de poros correspondentes, fixando firmemente os parafusos de fixação. Transfira o suporte da amostra para dentro ou para fora da câmara de amostra de SEM utilizando a ferramenta de troca de amostras. Imagem as amostras no modo de alto vácuo com uma tensão de feixe de aceleração de 10 kV e corrente de emissão 10 μA.
    Nota: sempre use luvas durante o manuseio de amostras, suportes de amostra, esboços de montagem e ferramentas de transferência para evitar a contaminação de graxa das mãos para o sistema SEM.
14. Teste as técnicas alternativas alistadas abaixo para comparar a definição dos espécimes obtidos do procedimento acima.
    1. Inclua uma borne-fixação com o tetróxido do ósmio de 1% por 1 h na temperatura ambiente após a etapa 1,7.
    2. Remova parcialmente ou completamente o HMDS na etapa 1,10 para a evaporação rápida rápida de HMDS.
    3. Processe embriões após a etapa 1,8 usando a secagem de ponto crítico (CPD) seguindo as etapas 3.3-3.4.

2. preparando a casca de ovo para SEM usando um método de secagem de ar

1. Coletar e incubar os ovos de tartaruga pintada (Chrysemys picta) para fixar os embriões conforme especificado nas etapas 1.1-1.7.
2. Guarde as cascas de ovos em água destilada após a fixação do embrião no passo 2,1. Limpe as cascas de ovos completamente por imersão em água destilada por pelo menos 1 h para eliminar a contaminação de gema e albumina.
3. Os ovos ar-secos após a lavagem em toalhetes antiestáticos delicados na capa da emanação durante a noite. Armazene cascas de ovo secas em garrafas de amostra limpas rotuladas por número e estágio.
4. Monte, Sputter casaco e imagem os espécimes, seguindo as etapas especificadas nas etapas 1.11-1.13.

3. ponto crítico método de secagem para a preparação de culturas fúngicas para SEM

1. Estabelecer culturas de slides
   1. Prepare a mídia de agar dextrose de batata (PDA) para culturas fúngicas: Adicione 39 g de potência PDA em 1 L de água destilada em um balão de Erlenmeyer. Misture bem girando o balão e autoclave a mídia em 121 ° c por 30 min. permitir que a solução de mídia esfriar e, em seguida, adicione o antibiótico cloranfenicol (25 μg/mL) usando uma micropipeta estéril.
      Nota: após a esterilização, a solução de agar deve ser quente e não solidificar em breve. Resfriá-lo o suficiente para que ele não vai desativar os antibióticos.
   2. Misture-o girando e despeje as placas (aproximadamente 10-12 mL de mídia para cada prato de Petri de 10 cm), empilhe cuidadosamente e deixe solidificar.
   3. Use uma lâmina de bisturi estéril para cortar pequenos blocos de agar cerca de 1/2 a 3/4 de uma polegada. Retire e coloque um bloco de agar em um slide de microscópio de vidro limpo.
   4. Coloque o slide em uma placa de Petri limpa para evitar a contaminação e preservar a umidade durante a incubação.
   5. Levante o slide da parte inferior da placa de Petri usando um palito estéril para criar tensão superficial entre a chapa e a corrediça para remover a lâmina de vidro sem interromper o crescimento delicado após a incubação.
   6. Use um laço estéril ou uma agulha para transferir alguns dos fungos do inóculo do espécime a cada um dos quatro lados do bloco do agar na corrediça.
   7. Coloque uma lamínula limpa na superfície do bloco de agar após a inoculação. Adicione algumas gotas de água destilada estéril ao prato de Petri em torno da corrediça para assegurar a umidade para os fungos crescentes.
   8. Selar a placa parcialmente usando a película de parafina e incubar a placa em 30 ° c por um período de tempo apropriado (para a espécie do Fusarium incubar para 36 a 48 h).
   9. Retire a lâmina da placa de Petri e separe a lamínula firmemente aderida do bloco de agar utilizando fórceps estéril. Fixar os blocos de agar em 3% de glutaraldeído em PBS durante a noite a 4 ° c.
2. Desidrata as amostras passando por uma série de etanol: 10%, 25%, 50%, 75% e 90% com 15 min por mudança. Processe as amostras para a desidratação final com duas mudanças no etanol 100% com duração de 30 minutos cada para garantir a saturação completa.
3. Secagem de ponto crítico: Coloque amostras desidratadas na câmara do aparelho de CPD. Sele e fixe a câmara abrindo as válvulas para permitir o líquido CO₂ dentro e o ethanol do respiradouro para fora, até que o líquido co₂ Encha completamente a câmara.
   1. Sele e aqueça a câmara lentamente para conseguir um ponto crítico quando a pressão da câmara excede 1000 libras por polegada quadrada e a temperatura excede 31 ° c, a fase do líquido e do gás de CO₂ está no equilíbrio. Drene lentamente o CO₂ da câmara e a amostra como o gás para evitar efeitos da tensão de superfície.
4. Realize a montagem, chapeamento de ouro e imagem os espécimes seguindo as etapas especificadas nas etapas 1.11-1.13.
5. Realize análises comparativas quimicamente secando os espécimes da etapa 3,2 usando HMDS seguindo as etapas 1.9-1.13.

Resultados

Figura 1 mostra análise micrográfica eletrônica de varredura de embriões de tartaruga pintada (Chrysemys picta) . Ovos de tartaruga pintados coletados e incubados em um meio de cama, montados em esboços de alumínio após secagem química, foram utilizados para a imagem SEM (Figura 1a-E). Uma vista lateral de um embrião do estágio 12 mostra as estruturas craniofacial; a proeminência Maxillary estende além do mandibular e limita...

Discussão

Em nosso estudo, diferentes agentes de fixação, métodos de desidratação e secagem foram testados para preparar três diferentes amostras biológicas delicadas para a imagem SEM: embriões, cascas de ovos e culturas fúngicas. O SEM é comumente usado para análise de superfície, de modo que a penetração fixativa é menos preocupante, mas deve ser entendido que estruturas internas mal fixas causarão encolhimento interno ou/e estruturas superficiais colapsadas. O tempo prolongado da fixação deve igualmente ser c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy