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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole de microdissection de capture laser (LCM) a été développé pour obtenir une quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression génique dans les cellules osseuses. L'étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole LCM rapporté ici peut être utilisé pour étudier l'expression des gènes dans les cellules de tout tissu dur.

Résumé

Le rendement et l'intégrité de l'ARN sont décisifs pour l'analyse de l'ARN. Cependant, il est souvent techniquement difficile de maintenir l'intégrité de l'ARN tout au long de la procédure de microdissection de capture laser (LCM) entière. Étant donné que les études lCM fonctionnent avec de faibles quantités de matériel, les préoccupations au sujet des rendements limités de l'ARN sont également importantes. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression de gène dans les cellules d'os. L'effet du protocole de coloration, de l'épaisseur des cryosections, de la quantité microdissé de tissu, du kit d'extraction d'ARN, et du système de LCM employé sur le rendement et l'intégrité d'ARN obtenus des cellules d'os microdissés a été évalué. Des sections d'os congelées de huit m d'épaisseur ont été fabriquées à l'aide d'un film adhésif et tachées à l'aide d'un protocole rapide pour une tache lCL commerciale. L'échantillon a été pris en sandwich entre une membrane de polyéthylène téphtalate (PET) et le film adhésif. Un système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillons et une méthode d'extraction de l'ARN à base de colonnes ont été utilisés pour obtenir des ARN de haute qualité de rendement suffisant. L'étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole lCM rapporté ici peut être employé pour étudier l'expression in situ de gène dans les cellules de n'importe quel tissu dur dans les conditions physiologiques et les processus de la maladie.

Introduction

Les tissus sont constitués de types de cellules hétérogènes et distribuées spatialement. Différents types de cellules dans un tissu donné peuvent réagir différemment au même signal. Par conséquent, il est essentiel d'être en mesure d'isoler des populations cellulaires spécifiques pour l'évaluation du rôle des différents types de cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. La microdissection de capture au laser (LCM) offre une méthode relativement rapide et précise pour isoler et enlever les cellules spécifiées des tissus complexes1. Les systèmes LCM utilisent la puissance d'un faisceau laser pour séparer les cellules d'intérêt des sections de tissus histologiques sans avoir besoin de traitement enzymatique ou de croissance de la culture. Cela signifie que les cellules sont dans leur habitat tissulaire naturel, et que l'architecture tissulaire, y compris la relation spatiale entre les différentes cellules est conservée. La morphologie des cellules capturées et du tissu résiduel est bien préservée, et plusieurs composants tissulaires peuvent être échantillonnés séquentiellement à partir de la même diapositive. Les cellules isolées peuvent ensuite être utilisées pour l'analyse ultérieure de leur ARN, ADN, protéines ou métabolites2,3.

Afin d'analyser l'expression des gènes dans différentes populations cellulaires, ou après différents traitements, il est nécessaire d'obtenir des ARNm de qualité et de quantité suffisantes pour l'analyse ultérieure4,5. Contrairement à l'ADN, les ARN sont plus sensibles à la fixation et l'utilisation de tissus congelés est recommandée lorsque l'objectif est d'étudier l'ARN. Étant donné que les ARNm sont rapidement dégradées par des ribonucalis omniprésents (RNase), des conditions strictes sans RNase pendant la manipulation et la préparation des échantillons et d'éviter le stockage des échantillons à température ambiante sont nécessaires. En outre, les techniques rapides sans aucune étape aqueuse prolongée de phase sont cruciales pour empêcher la dégradation d'ARN6. Le rendement et l'intégrité de l'ARN peuvent également être affectés par le processus LCM et le système LCM utilisé7,8. Actuellement, quatre systèmes LCM avec des principes d'exploitation différents sont disponibles2. La méthode d'extraction de l'ARN peut également être importante, puisque différents kits d'isolement d'ARN ont été testés avec des différences significatives dans la quantité et la qualité d'ARN7,8.

Toute méthode de préparation des tissus nécessite de trouver un équilibre entre l'obtention d'un bon contraste morphologique et le maintien de l'intégrité de l'ARN pour d'autres analyses. Pour la préparation des sections congelées de l'os, un film adhésif a été développé et continuellement amélioré9. Les sections osseuses sont coupées et tachées directement sur le film adhésif. Ce film adhésif est applicable à de nombreux types de coloration, et peut être utilisé pour isoler les cellules d'intérêt de cryosections osseuses en utilisant LCM9,10,11,12,13, 14. Toutes les étapes, y compris l'ablation chirurgicale, l'intégration, la congélation, la coupe et la coloration peuvent être complétées en moins d'une heure. Fait important, les cellules telles que les ostéoblastes, les cellules de doublure osseuse, et les ostéoclastes peuvent être clairement identifiés9,10,11,12,13,14. Cette méthode a l'avantage d'être rapide et simple. Une autre méthode pour générer des cryosections osseuses est d'utiliser le système de transfert de bande15. Cependant, cette dernière technique prend plus de temps et nécessite une instrumentation supplémentaire, puisque les sections doivent être transférées du ruban adhésif sur des glissières de membrane précouchées par liaison croisée ultraviolette (UV). Bien que le système de transfert de bande a été couplé avec succès avec LCM16,17,18,19, il convient de noter que le revêtement relié transversal peut créer un modèle de fond qui peut interférer avec l'identification de type cellulaire20.

Typiquement, seulement de petites quantités d'ARN sont extraites des cellules microdissés, et la qualité et la quantité d'ARN sont souvent évaluées par électrophorèse micro-capillaire21. Un programme informatique est utilisé pour attribuer un indice de qualité aux extraits d'ARN appelés numéro d'intégrité de l'ARN (RIN). Une valeur RIN de 1,0 indique l'ARN complètement dégradé, tandis qu'une valeur de 10,0 suggère que l'ARN est entièrement intact22. Habituellement, les indices de plus de 5 sont considérés comme suffisants pour les études d'ARN. Des modèles d'expression génique dans des échantillons d'une valeur RIN de 5,0 à 10,0 ont été rapportés en corrélation entreeux 23. Bien que la sensibilité de cette méthode soit élevée, puisque l'on peut détecter à moins de 50 pg/L d'ARN total, il peut être très difficile d'obtenir une évaluation de la qualité si la concentration d'ARN dans l'échantillon est très faible. Par conséquent, afin d'évaluer la qualité de l'ARN, la section tissulaire restante après le LCM est souvent utilisée pour extraire l'ARN, en tampon pipetting sur la diapositive24.

Bien que le LCM ait été largement utilisé sur différents tissus congelés, les valeurs RIN des ARN extraites sont rarement rapportées. En outre, il n'existe pas d'études comparatives pour clarifier la méthode la plus appropriée pour étudier l'ARN dans les os de souris. Dans la présente étude, des sections congelées de fémurs de souris adultes ont été utilisées pour optimiser la préparation de l'échantillon, le protocole LCM et l'extraction de l'ARN afin d'obtenir des ARN de haute qualité. Le protocole actuel a été optimisé en particulier pour le système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d'échantillons.

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Protocole

Le tissu osseux des souris a été employé dans le strict respect des directives en vigueur pour des soins d'animal et tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum la souffrance animale.

1. Animaux et Congeler l'intégration

  1. Maison des animaux dans des conditions de température ambiante constante (RT; 24 oC) et d'un cycle sombre de 12 h/12 h avec accès gratuit à la nourriture et à l'eau.
    REMARQUE: Des tissus osseux dans cette étude ont été obtenus à partir de souris sauvages mâles de type C57BL/6 de 3 mois.
  2. À l'autopsie, exsanguinate souris de la veine abdominale cava sous anesthésie générale (kétamine/xylazine, 100/6 mg/kg intrapéritonéal).
    REMARQUE: Afin d'éviter la dégradation de l'ARN, utilisez des instruments et des matériaux sans NNase, portez des gants et travaillez rapidement en évitant le stockage des échantillons à RT tout au long de l'expérience.
  3. Enlever les fémurs entiers rapidement, les nettoyer des tissus mous environnants à l'aide de scalpel et de papier essuie-tout. Verser la température de coupe optimale (OCT) composé dans le moule d'encastrement, et mettre le fémur dans le fond du moule d'intégration. Congelez les échantillons dans de l'azote liquide. OCT est transparent à RT et blanc lorsqu'il est congelé.
  4. Une fois entièrement congelés, envelopper les échantillons dans du papier d'aluminium et les transférer sur de la glace sèche à -80 oC. Conserver les échantillons à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient traités.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparation de la section

  1. Fixer la température dans le cryostat à -19 oC et du bloc à -17 oC. Essuyez l'intérieur du cryostat à l'aide de 70 % d'éthanol. Placez la lame jetable pour les tissus durs, les lames de verre et un outil d'ajustement dans le cryostat pour refroidir. Gardez-les à l'intérieur du cryostat pendant toute la durée de la section.
  2. Transférer le bloc de tissu congelé sur la glace sèche au cryostat et lui permettre d'équilibrer pendant au moins 10 min.
    REMARQUE: Évitez le dégel répétitif et le cycle fréquent d'un bloc de -80 oC à -19 oC pour la cryosection.
  3. Appuyez sur le fond du moule d'intégration pour pousser le bloc OCT hors du moule. Appliquer suffisamment de milieu OCT au support de bloc pour y adhérer le bloc. Attendez que le milieu OCT soit complètement congelé.
  4. Placez le support de bloc dans le support d'objet et serrez-le en place. Ajustez la position de la lame et coupez le bloc à l'aide d'incréments de coupe de 15 m pour enlever l'OCT couvrant l'échantillon. Si l'échantillon a été coupé plus tôt et que la surface est exposée à l'air, jetez les premières sections de tissu de 2 à 3 du bloc.
  5. Ajustez le cryostat pour générer des sections de 8 m et coupez des cryosections de 2 à 3 qui seront jetées (les premières seront généralement plus épaisses que 8 m). Placez le film adhésif sur le bloc et utilisez un outil approprié pour adhérer au film au bloc. Faire la coupe lentement et à une vitesse constante en tenant la section par le film.
  6. Placez le film (échantillon face vers le haut) immédiatement sur une lame de verre prérefroidie (sur la cryobar dans le cryostat) pour éviter la décongélation de l'échantillon. Utilisez du ruban adhésif pour fixer le film à la glissière de verre pour une coloration plus facile. Procédez immédiatement avec le protocole de coloration.

3. Protocole de coloration rapide

  1. Préparer 40 ml des solutions suivantes dans des tubes de 50 ml et les mettre sur la glace : 95 % d'éthanol, de l'eau sans RNase, 100 % de l'éthanol, 100 % de l'éthanol et 100 % de la xylène. Effectuer toutes les étapes sur la glace (sauf la coloration). Pour chaque journée expérimentale, préparez tous les réactifs aqueux frais avec de l'eau sans RNase.
    MISE EN GARDE: Travaillez dans le capot pour éviter l'intoxication par le xylène.
  2. Incuber des sections pour 30 s dans 95 % d'éthanol, puis tremper les sections 30 s dans de l'eau sans RNase pour enlever l'OCT avec soin et complètement, ce qui peut interférer avec les applications lCLet et en aval.
  3. Distribuer 50 l de tache commerciale de section congelée LCM (Table of Materials) sur la section, incuber pendant 10 s à RT et le vider en plaçant le bord de la glissière sur du papier de soie absorbant. Enlever l'excès de taches en rinçant 30 s dans 100% d'éthanol.
  4. Immerger les sections osseuses dans un deuxième tube avec 100% d'éthanol pour 30 s et les transférer à 100% xylène pour 30 s.
  5. Mettre le film adhésif (échantillon orienté vers le haut) sur la glissière en verre sec comme support. Veillez à ce que le film ne soit pas touché et placé aussi plat que possible. Ne laissez pas l'échantillon sécher complètement.
  6. Placez une glissière à membrane PET. Appuyez rapidement sur un doigt ganté sur la membrane pour l'attacher au film. L'échantillon est ensuite pris en sandwich entre la membrane et le film adhésif. Le film adhésif ne doit pas être plié ou ridé et il ne devrait pas y avoir de bulles d'air entre le film et la membrane. Procédez immédiatement avec le LCM.

4. Microdissection de capture de laser

  1. Nettoyer la scène et le porte-capuchon de RNase à l'aide de décontaminant de surface (Tableau des matériaux). Chargez la glissière et les bouchons dans le porte-glissière et le porte-capuchon, respectivement.
  2. Ajuster la mise au point et acquérir aperçu diapositive avec 1.25x objectif. Changer à l'objectif 40x et ajuster la mise au point. Choisissez la zone d'intérêt à l'aide de la vue d'ensemble de la diapositive. Ajuster les paramètres laser comme suit : ouverture, 7; puissance laser, 60; vitesse, 5; fréquence des impulsions, 201; bilan des spécimens, 20. Optimisez ces paramètres pour chaque objectif.
  3. Si le laser ne parvient pas à couper l'échantillon, augmentez la puissance du laser. Alternativement, le laser peut être appliqué plus d'une fois. En outre, inspectez la cible pour les taches de coupes incomplètes et re-dessiné la ligne dans ces endroits en utilisant l'option Déplacer et couper. Enregistrez les réglages laser pour la dissection des diapositives suivantes.
  4. Sélectionnez les ostéoblastes, les ostéocytes et les cellules de la muqueuse osseuse dans des os antémaux ou corticales fétaux distaux en fonction de critères morphologiques. Tracez une ligne pour la trajectoire laser plus loin des cellules cibles pour minimiser les dommages causés par le laser UV. Effectuer toutes les microdissections en moins de 1 h après la coloration.
  5. Recueillir chaque type de cellule dans un bouchon séparé d'un tube de 0,5 ml.
    REMARQUE: La capture sèche au lieu de la récupération liquide peut éviter la dégradation de l'ARN. En outre, de très petits volumes de tampon contenus dans le bouchon du tube de microcentrifuge peuvent s'évaporer ou se cristalliser (selon sa composition) pendant le LCM.
  6. Confirmer le succès de capture par l'observation du bouchon du tube de collecte après le LCM le cas échéant. Procédez immédiatement avec l'extraction de l'ARN.

5. Extraction d'ARN

  1. Distribuer 50 l de la mémoire tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol dans le bouchon du tube de collecte et lyser l'échantillon en faisant monter et descendre le bouchon pendant 1 min. Faites glisser le lysate et ajoutez 300 oL du tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol dans le tube. Si plusieurs bouchons vont être mis en commun, veillez à ce que le volume total de tampon soit recommandé pour le kit d'extraction de l'ARN(Tableau des matériaux).
    ATTENTION : Le mercaptoéthanol doit être ajouté pour protéger l'ARN de la dégradation, mais il est considéré comme toxique. Portez des vêtements et des gants de protection et travaillez dans le capot.
  2. De plus, pour chaque diapositive, préparez un tube de microcentrifuge de 1,5 ml étiqueté avec 350 l de la mémoire tampon de lyse contenant du mercaptoéthanol. Utilisez les sections restantes après le LCM pour extraire l'ARN. Séparez soigneusement le film de la membrane et lysez l'échantillon en pipetting lentement le tampon de lyse sur la section à plusieurs reprises.
    REMARQUE: La quantité totale de tampon de lyse doit être de 350 l. Ne pas l'utiliser tout à la fois pour la digestion car il s'écoulera de la diapositive.
  3. Déposer les échantillons de lysate sur de la glace sèche et les conserver à -80 oC.
    REMARQUE:     Le protocole peut être mis en pause ici.
  4. Décongeler les lysates à RT. Transférer les lysates des cellules récoltées par LCM des tubes de collecte dans les tubes microcentrifugede de 1,5 ml. Si plus d'un bouchon a été utilisé pour récolter l'échantillon, encommunlez plusieurs lysates.
  5. Extraire l'ARN selon les instructions du fabricant. Traiter les colonnes avec DNase I pour enlever l'ADN génomique. Armoirie d'Elute avec 14 l d'eau sans RNase, résultant en une eluate de 12 L. Conserver l'ARN à -80 oC.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

6. Mesure du rendement et de l'intégrité de l'ARN

  1. Décongeler l'ARN sur la glace humide. Mesurer le rendement et l'intégrité de l'ARN isolé à l'aide d'électrophorèse micro-capillaire. Chargez l'ARN total (1 L par échantillon) dans une puce (Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.

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Résultats

Un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression de gène dans les cellules d'os des fémurs de souris. Dans le protocole optimisé, des sections d'os congelées de 8 m d'épaisseur ont été coupées sur un film adhésif et tachées à l'aide d'un protocole rapide pour une tache commerciale de section gelée lUM. L'échantillon a été pris en sandwich entre la membrane PET et le film adhésif. Les cellules osseuses de souris ont été micro...

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Discussion

La qualité et la quantité d'ARN peuvent être affectées négativement à toutes les étapes de la préparation d'échantillon telle que la manipulation de tissu, le processus de LCM, et l'extraction d'ARN. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse suivante d'expression de gène.

Pour l'AmC, la plupart des laboratoires utilisent des sections de 7 à 8 m d'épaisseur2. Des sections plus épai...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient Ute Zeitz et Nikole Ginner pour leur excellente aide technique ainsi que le Vetcore et le personnel de soins aux animaux pour leur soutien.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma63689-25ML-F
Absolute ethanol EMPLURAMerck Millipore8,18,76,01,000
Adhesive film (LMD film)Section-LabC-FL001
Agilent 2100 Bioanalyzer SystemAgilent Technologies
Agilent RNA 6000 Pico Chip KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus HistoGene Staining SolutionApplied Biosystems12241-05
Cryofilm fitting toolSection-LabC-FT000
Cryostat Leica CM 1950Leica Biosystems
Glass microscope slides, cut color frosted orangeVWR Life Science631-1559
Histology tissue molds PVCMEDITE48-6302-00
LMD7 Laser Mikrodissektion SystemLeica Microsystems
Low profile Microtome Blades Leica DB80 XLLeica Biosystems14035843496
Nuclease-free waterVWR Life ScienceE476-500ML
PET membrane slides 1.4 μmMolecular Machines & Industries GmbH50102
RNase Away surface decontaminantMolecular BioProduct7002
RNeasy Micro KitQiagen74004
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compoundSakura Finetek4583
XyleneVWR Life Science2,89,73,363

Références

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