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Resumo

Um protocolo da microdissecção da captação do laser (LCM) foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene nas pilhas de todo o tecido duro.

Resumo

O rendimento e a integridade do RNA são decisivos para a análise do RNA. Entretanto, é frequentemente desafiante tecnicamente manter a integridade do RNA durante todo o procedimento inteiro da microdissecção da captação do laser (LCM). Desde que os estudos de LCM trabalham com baixas quantidades de material, as preocupações sobre rendimentos limitados do RNA são igualmente importantes. Conseqüentemente, um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. Avaliou-se o efeito do protocolo de coloração, da espessura dos criossecções, da quantidade de tecido microdissecado, do kit de extração de RNA e do sistema de LCM utilizado no rendimento de RNA e na integridade Obtida de células ósseas microdissecadas. As seções congeladas oito-μm-grossas do osso foram feitas usando uma película adesiva e manchadas usando um protocolo rápido para uma mancha comercial de LCM. A amostra foi imprensada entre uma membrana de polietileno tereftalato (PET) e a película adesiva. Um sistema de LCM que usa a gravidade para a coleção da amostra e um método coluna-baseado da extração do RNA foi usado para obter o RNAs da alta qualidade do suficiente rendimento. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene in situ nas pilhas de todo o tecido duro em circunstâncias fisiológicas e em processos da doença.

Introdução

Os tecidos são compo de tipos heterogêneos e espacialmente distribuídos da pilha. Diferentes tipos de células em um determinado tecido podem responder de forma diferente ao mesmo sinal. Portanto, é essencial ser capaz de isolar populações de células específicas para a avaliação do papel de diferentes tipos de células em condições fisiológicas e patológicas. A microdissecção de captura a laser (LCM) oferece um método relativamente rápido e preciso para isolar e remover células especificadas de tecidos complexos1. Os sistemas de LCM usam o poder de um feixe de laser para separar as pilhas do interesse das seções histológicas do tecido sem a necessidade para o processamento enzimático ou o crescimento na cultura. Isto significa que as pilhas estão em seu habitat natural do tecido, e que a arquitetura do tecido que inclui a relação Spatial entre pilhas diferentes é mantida. A morfologia das células capturadas e do tecido residual é bem preservada, e vários componentes teciduais podem ser amostrados sequencialmente a partir do mesmo slide. As células isoladas podem então ser usadas para análise subsequente de seu conteúdo de RNA, DNA, proteína ou metabólito2,3.

Para analisar a expressão gênica em diferentes populações celulares, ou após diferentes tratamentos, é necessário obter mRNAs de qualidade e quantidade suficientes para a análise subsequente4,5. Em contraste com o DNA, as RNAs são mais sensíveis à fixação e o uso de tecido congelado é recomendado quando o objetivo é estudar o RNA. Desde que os mRNAs estão degradados rapidamente por ribonucleases onipresente (RNase), as condições RNase-livres estritas durante a manipulação e a preparação do espécime e evitando o armazenamento das amostras na temperatura ambiente são exigidas. Além, as técnicas rápidas sem nenhumas etapas aquosas prolongadas da fase são cruciais impedir a degradação6do RNA. O rendimento e a integridade do RNA também podem ser afetados pelo processo de LCM e osistema deLCM utilizado7,8. Atualmente, quatro sistemas de LCM com diferentes princípios operacionais estão disponíveis2. O método da extração do RNA pode igualmente ser importante, desde que os jogos diferentes da isolação do RNA foram testados com diferenças significativas na quantidade e na qualidade do RNA7,8.

Qualquer método de preparo tecidual requer encontrar um equilíbrio entre a obtenção de bom contraste morfológico e a manutenção da integridade do RNA para análises adicionais. Para preparar seções congeladas do osso, um filme adesivo foi desenvolvido e melhorado continuamente9. As seções do osso são cortadas e manchadas diretamente na película adesiva. Esta película adesiva é aplicável a muitos tipos de mancha, e pode ser empregada para isolar as pilhas do interesse dos Cryosections do osso usando LCM9,10,11,12,13, a 14. Todos os passos, incluindo a remoção cirúrgica, incorporação, congelamento, corte e coloração pode ser concluída dentro de menos de uma hora. É importante ressaltar que células como osteoblastos, células de forro ósseo e osteoclastos podem ser claramente identificadas9,10,11,12,13,14. Este método tem a vantagem de ser rápido e simples. Um método alternativo para a geração de criossecções ósseas é o uso do sistema de transferência de fita15. No entanto, a última técnica é mais demorada e requer instrumentação adicional, uma vez que as secções têm de ser transferidas da fita adesiva para lâminas de membrana pré-revestidas por ultravioleta (UV) cross-linking. Embora o sistema de transferência de fita tenha sido acoplado com êxito com o LCM16,17,18,19, deve-se notar que o revestimento reticulado pode criar um padrão de plano de fundo que pode interferir com a identificação do tipo celular20.

Tipicamente, apenas pequenas quantidades de RNA são extraídas de células microdissecadas, e a qualidade e a quantidade de RNA são frequentemente avaliadas por eletroforese microcapilar21. Um programa de computador é usado para atribuir um índice da qualidade aos extratos do RNA chamados número da integridade do RNA (RIN). Um valor de RIN de 1,0 indica o RNA completamente degradado, visto que um valor de 10,0 sugere que o RNA esteja inteiramente intacto22. Geralmente, os índices sobre 5 são considerados suficientes para estudos do RNA. Os testes padrões da expressão de gene nas amostras com um valor de RIN de 5.0 − 10.0 foram relatados para correlacionar bem uns com os outros23. Embora a sensibilidade deste método seja elevada, uma vez que tão pouco quanto 50 PG/μL do RNA total pode ser detectado, pode ser muito difícil obter uma avaliação da qualidade se a concentração do RNA na amostra for muito baixa. Conseqüentemente, a fim avaliar a qualidade do RNA, a seção do tecido que permanece após o LCM é usada frequentemente para extrair o RNA, introduzindo com pipting o amortecedor na corrediça24.

Embora o LCM seja usado extensivamente em tecidos congelados diferentes, os valores de RIN de RNAs extraídos são relatados raramente. Além disso, não há estudos comparativos para esclarecer o método mais adequado para estudar RNA em ossos do rato. No presente estudo, foram utilizados cortes congelados de fêmures de camundongo adulto para otimizar a preparação da amostra, o protocolo de LCM e a extração de RNA para obtenção de RNAs de alta qualidade. O presente protocolo foi otimizado especialmente para o sistema de LCM que utiliza a gravidade para coleta de amostras.

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Protocolo

O tecido ósseo de camundongos foi usado em estrita conformidade com as diretrizes vigentes para o cuidado dos animais e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais.

1. animais e congelamento de incorporação

  1. Animais da casa em condições de temperatura ambiente constante (RT; 24 ° c) e um ciclo de 12 h de luz/12 h escuro com acesso gratuito à comida e água.
    Nota: os tecidos ósseos deste estudo foram obtidos de camundongos machos selvagens de 3 meses, tipo C57Bl/6.
  2. Na necropsia, exsanguinar camundongos da veia cava abdominal anestesia geral (cetamina/xilazina, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
    Nota: A fim evitar a degradação do RNA, use instrumentos e materiais RNase-livres, luvas do desgaste e trabalhe rapidamente evitando o armazenamento das amostras no RT durante todo o experimento inteiro.
  3. Remova os fêmures inteiros ràpida, limpe-os dos tecidos macios circunvizinhos usando o bisturi e as toalhas de papel. Derrame o composto ideal da temperatura do corte (OCT) no molde de incorporação, e põr o fémur na parte inferior do molde de incorporação. Snap-congelar as amostras em nitrogênio líquido. OCT é transparente em RT e branco quando congelado.
  4. Uma vez que inteiramente congelado, enrole as amostras na folha e transfira-as no gelo seco a-80 ° c. Armazene amostras em-80 ° c até o processamento adicional.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. preparação da seção

  1. Ajuste a temperatura no criostat a-19 ° c e do suporte do bloco a-17 ° c. Limpe o interior do criostat usando 70% de etanol. Coloque a lâmina descartável para tecidos duros, as lâminas de vidro e uma ferramenta de encaixe no criostat para esfriar. Mantenha-os dentro do criostat para a duração do corte.
  2. Transfira o bloco de tecido congelado em gelo seco para o criostato e deixe-o equilibrar por pelo menos 10 min.
    Nota: Evite descongelamento repetitivo e ciclagem frequente de um bloco de-80 ° c a-19 ° c para criseccionamento.
  3. Pressione a parte inferior do molde de incorporação para empurrar o bloco de OCT fora do molde. Aplique o suficiente OCT médio ao suporte do bloco para aderir o bloco a ele. Aguarde até que o meio OCT esteja totalmente congelado.
  4. Coloque o suporte do bloco no suporte do objeto e aperte-o no lugar. Ajuste a posição da lâmina e apare o bloco usando incrementos de corte de 15 μm para remover a OCT cobrindo a amostra. Se a amostra foi cortada mais cedo e a superfície expor ao ar, descarte as primeiras 2 − 3 seções do tecido do bloco.
  5. Ajuste o criostat para gerar seções de 8 μm e corte 2 − 3 criosecções que serão descartadas (os primeiros serão tipicamente mais grossos que 8 μm). Coloque a película adesiva no bloco e utilize uma ferramenta de encaixe para aderir ao bloco. Faça o corte lentamente e em uma velocidade constante segurando a seção pelo filme.
  6. Coloque o filme (amostra virada para cima) imediatamente em uma corrediça de vidro pré-arrefecida (no criobar dentro do criostat) para evitar a descongelar da amostra. Use a fita para fixar a película à corrediça de vidro para uma mancha mais fácil. Prossiga imediatamente com o protocolo de coloração.

3. protocolo de coloração rápida

  1. Prepare 40 mL das seguintes soluções em tubos de 50 mL e coloque-os no gelo: 95% de etanol, água sem RNase, 100% de etanol, 100% de etanol e 100% de xileno. Realize todas as etapas no gelo (exceto a coloração). Para cada dia experimental, Prepare todos os reagentes aquosos frescos com água RNase-livre.
    Atenção: Trabalhe no capô para evitar a intoxicação por xileno.
  2. Incubar seções para 30 s em 95% etanol, em seguida, mergulhar seções 30 s em água RNase livre para remover OCT com cuidado e completamente que podem interferir com o LCM e aplicações a jusante.
  3. Dispensar 50 μL de mancha de seção congelada comercial de LCM (tabela de materiais) na seção, incubar por 10 s no RT e drená-la coloc a borda da corrediça no papel de tecido absorvente. Remova o excesso de manchas enxaguando 30 s em 100% de etanol.
  4. Mergulhe os cortes ósseos em um segundo tubo com 100% de etanol por 30 s e transfira-os para 100% de xileno por 30 s.
  5. Põr a película adesiva (a amostra que enfrenta acima) na corrediça de vidro seca como um apoio. Tome cuidado para que o filme não é impactado e colocado tão plana quanto possível. Não permita que a amostra seque completamente.
  6. Coloque uma corrediça do frame da membrana do animal de estimação nela. Em breve Pressione um dedo enluvado na membrana para anexá-lo ao filme. A amostra é então imprensada entre a membrana e a película adesiva. O filme adesivo não deve ser dobrado ou enrugado e não deve haver bolhas de ar entre o filme e a membrana. Prossiga imediatamente com o LCM.

4. microdissecção da captação do laser

  1. Limpe o estágio e o suporte do tampão do RNase usando o solvente de superfície (tabela dos materiais). Coloque o slide e as tampas no porta-lâmina e no suporte da tampa, respectivamente.
  2. Ajuste o foco e adquira a visão geral do slide com o objetivo 1.25 x. Mude para o objetivo de 40x e ajuste o foco. Escolha a área de interesse usando a visão geral do slide. Ajuste os parâmetros do laser como segue: abertura, 7; poder do laser, 60; velocidade, 5; freqüência de pulso, 201; contrapeso da amostra, 20. Otimize esses parâmetros para cada objetivo.
  3. Se o laser não conseguir cortar a amostra, aumente a potência do laser. Alternativamente, o laser pode ser aplicado mais de uma vez. Além disso, inspecione o alvo para manchas de cortes incompletos e redesenhada a linha nesses pontos usando a opção mover e recortar . Guarde as definições do laser para a dissecção dos diapositivos subsequentes.
  4. Selecione osteoblastos, osteócitos e células do forro ósseo no osso femoral distal esponjoso ou cortical com base em critérios morfológicos. Desenhe uma linha para o caminho do laser mais longe das células alvo para minimizar os danos causados pelo laser UV. Realize todas as microdissecções em menos de 1 h após a coloração.
  5. Colete cada tipo de célula em uma tampa separada de um tubo de 0,5 mL.
    Nota: A captura a seco em vez da recuperação líquida pode evitar a degradação do RNA. Além, os volumes muito pequenos do amortecedor contidos na tampa do tubo do microcentrifugador podem evaporar ou cristalizar (dependendo de sua composição) durante o LCM.
  6. Confirme o sucesso da captação pela observação da tampa do tubo da coleção após o LCM onde aplicável. Proceder imediatamente com a extração do RNA.

5. extração de RNA

  1. Dispensar 50 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol na tampa do tubo de recolha e lyse a amostra introduzindo a pipetagem para cima e para baixo na tampa durante 1 min. Gire o lisado e adicione 300 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol no tubo. Se várias tampas vão ser agrupadas, tome cuidado para que o volume total de buffer é como recomendado para o kit de extração de RNA (tabela de materiais).
    Atenção: o β-Mercaptoetanol deve ser adicionado para proteger o RNA da degradação, mas é considerado tóxico. Use roupas e luvas protetoras e trabalhe no capô.
  2. Além disso, para cada slide Prepare um rotulado 1,5 mL tubo de microcentrífuga com 350 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol. Use as seções restantes após o LCM para extrair o RNA. Separe cuidadosamente o filme da membrana e lyse a amostra, introduzindo lentamente o tampão de lise na secção várias vezes.
    Nota: A quantidade total de tampão de Lise deve ser 350 μL. Não use tudo de uma vez para a digestão como ele vai fluir fora do slide.
  3. Coloque as amostras de lisado em gelo seco e guarde-as em-80 ° c.
    Observação:     o protocolo pode ser pausado aqui.
  4. Descongelar os lisados em RT. Transfira lisados de células colhidas de LCM de tubos de coleta para os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Se mais de uma tampa foi usada para colher a amostra, a associação de vários lisados.
  5. Extraia o RNA de acordo com as instruções do fabricante. Trate colunas com DNase I para remover o DNA genómico. RNA de elute com 14 μL de água RNase-livre, tendo por resultado um eluate de 12 μL. Armazene o RNA em-80 ° c.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

6. medida do rendimento e da integridade do RNA

  1. Thaw RNA em gelo molhado. Meça o rendimento e a integridade do RNA isolado usando a electroforese microcapilar. Carregue o RNA total (1 μL por a amostra) em um chip (tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.

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Resultados

Um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso de femurs do rato. No protocolo otimizado, as secções de osso congelado de 8 μm de espessura foram cortadas numa película adesiva e manchadas utilizando um protocolo rápido para uma mancha de secção congelada comercial de LCM. A amostra foi imprensada entre a membrana PET e a película adesiva. As células ósseas do rato foram microdissecadas utilizando um sistem...

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Discussão

Tanto a qualidade quanto a quantidade de RNA podem ser afetadas negativamente em todas as etapas da preparação da amostra, como manipulação tecidual, processo de LCM e extração de RNA. Conseqüentemente, um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter suficiente quantidade de RNA de alta qualidade para a análise subseqüente da expressão de Gene.

Para a LCM, a maioria dos laboratórios utiliza secções 7 − 8 μm de espessura2. Seções mais grossas permitiria que mais mat...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a UTE Zeitz e a Nikole Ginner por sua excelente ajuda técnica, bem como a Vetcore e a equipe de cuidados com animais para seu apoio.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma63689-25ML-F
Absolute ethanol EMPLURAMerck Millipore8,18,76,01,000
Adhesive film (LMD film)Section-LabC-FL001
Agilent 2100 Bioanalyzer SystemAgilent Technologies
Agilent RNA 6000 Pico Chip KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus HistoGene Staining SolutionApplied Biosystems12241-05
Cryofilm fitting toolSection-LabC-FT000
Cryostat Leica CM 1950Leica Biosystems
Glass microscope slides, cut color frosted orangeVWR Life Science631-1559
Histology tissue molds PVCMEDITE48-6302-00
LMD7 Laser Mikrodissektion SystemLeica Microsystems
Low profile Microtome Blades Leica DB80 XLLeica Biosystems14035843496
Nuclease-free waterVWR Life ScienceE476-500ML
PET membrane slides 1.4 μmMolecular Machines & Industries GmbH50102
RNase Away surface decontaminantMolecular BioProduct7002
RNeasy Micro KitQiagen74004
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compoundSakura Finetek4583
XyleneVWR Life Science2,89,73,363

Referências

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