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Résumé

L’attachement covalent des molécules de sonde aux pointes de porte-à-faux de force atomique (AFM) est une technique essentielle pour l’étude de leurs propriétés physiques. Cela nous permet de déterminer la force d’étirement, la force de désorption et la longueur des polymères via la spectroscopie de force à molécule unique à base d’AFM avec une reproductibilité élevée.

Résumé

La spectroscopie à molécule unique à base de force de force de force de force de force de force de force de force de force de force de force de force atomique (AFM) est un outil idéal pour étudier les interactions entre un seul polymère et des surfaces. Pour une véritable expérience de molécule unique, l’attachement covalent de la molécule de sonde est essentiel parce que ce n’est qu’alors que des centaines de traces d’extension de force avec une seule molécule unique peuvent être obtenues. De nombreuses traces sont à leur tour nécessaires pour prouver qu’une seule molécule est sondée. En outre, la passivation est cruciale pour prévenir les interactions indésirables entre la molécule de sonde unique et la pointe de porte-à-faux AFM ainsi qu’entre la pointe de porte-à-faux AFM et la surface sous-jacente. Le protocole de fonctionnalisation présenté ici est fiable et peut facilement être appliqué à une variété de polymères. Des événements caractéristiques à molécule unique (c.-à-d. des étirements et des plateaux) sont détectés dans les traces d’extension de la force. À partir de ces événements, des paramètres physiques tels que la force d’étirement, la force de désorption et la longueur de desorption peuvent être obtenus. Ceci est particulièrement important pour l’étude précise des systèmes sensibles aux stimuli au niveau de la molécule unique. Comme les systèmes exemplaires poly (éthylène glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) et polystyrène (PS) sont étirés et désorbés de SiOx (pour PEG et PNiPAM) et de surfaces monoolayers auto-assemblés hydrophobes (pour PS) dans un environnement aqueux.

Introduction

Depuis son invention dans les années 19801, le microscope à force atomique (AFM) est devenu l’une des techniques d’imagerie les plus importantes en sciences naturelles avec une résolution spatiale sous-nanométrique, la résolution des forces sous-piconewton et la possibilité de mesurer dans diverses conditions de solvant et de température2,3,4,5,6,7.

Outre l’imagerie8,9, AFM est utilisé pour effectuer la spectroscopie de force de molécule unique (SMFS) donnant un aperçu des interactions adhésives entre un seul polymère et les surfaces, les propriétés physiques des polymères simples et les mécanismes de déploiement des protéines7,10,11,12,13,14,15,16. Dans une expérience SMFS régulière, la pointe de porte-à-faux fonctionnalisée est mise en contact avec une surface de sorte que le polymère à l’AFM cantilever pointe physisorbs à cette surface. En rétractant la pointe de porte-à-faux AFM de la surface, un changement dans la déviation du porte-à-faux AFM est converti en une force menant à une courbe d’extension de force4. Les paramètres physiques tels que la force d’étirement, la force de désorption et la longueur de desorption peuvent être déterminés comme dépendants de différents paramètres tels que la vitesse de traction, le temps d’habiter à la surface, la profondeur d’indentation dans la surface, la température, le solvant17,18 et différentes surfaces comme les substrats solides, les films de polymère ou les bilayers lipidiques soutenus19,20,21,22. En outre, un polymère peut être sondé dans différentes directions spatiales, étudiant ainsi les propriétés de frottement du polymère23,24,25,26.

Une attachement covalente du polymère étudié à une pointe de porte-à-faux d’AFM est essentielle pour de telles études. Ainsi, un rendement élevé des événements à molécule unique avec un seul et même polymère lié à une pointe de porte-à-faux AFM empêche tout biais des résultats en raison de l’étalonnage de la constante printanière de l’AFM cantilever27,28, différents points d’attachement29 ou des polymères variables (avec des longueurs de contours différentes) comme dans le cas des expériences de nanopêche30,31,32. En outre, les interactions avec d’autres polymères ainsi que la moyenne des effets peuvent être largementévitées 18,28. Pour l’attachement covalent d’un polymère à la pointe de porte-à-faux AFM, différents types de modifications chimiques peuvent être appliqués, dont beaucoup sont résumés dans le livre par Hermanson33. Les réactions de liaison à base d’Amine et de thiol ainsi que la chimie des clics représentent les méthodes les plus couramment utilisées dans la fonctionnalisation de pointe de porte-à-faux AFM34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et coll.40 montrent comment utiliser la chimie 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS chimie pour attacher une protéine à une pointe de porte-à-faux AFM. Cependant, lesdits groupes fonctionnels ont tendance à lien croisé, conduisant ainsi à une perte de fonctionnalité43,44. En outre, les carbodiimides montrent une tendance à l’hydrolyse rapide dans la solution43. Les groupes de maleimide et de thiol sont généralement plus stables et ne montrent pas de réactions transversales. Le protocole présenté est une optimisation des protocoles précédemment publiés donnés dans les références35,39.

Ici, un protocole de fonctionnalisation fiable est présenté qui peut être facilement ajusté à un grand nombre de polymères différents, indépendamment des propriétés telles que la longueur de contour ou l’hydrophobicité. Trois polymères différents ont été choisis à titre d’exemple : le polyéthylène glycol hydrophile (PEG) et le poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) ainsi que le polystyrène hydrophobe de masse de masse de haute molaire (PS). Afin de fournir une capacité de liaison covalente avec une molécule appropriée de liaison, les trois polymères ont été choisis pour comportant une moiety de thiol téléchellique comme groupe final fonctionnel. La molécule de liaison elle-même est généralement un polymère PEG court avec deux sites actifs, un groupe de silane à une extrémité et un groupe de maleimide à l’autre extrémité. Le premier permet un attachement covalent à la pointe de porte-à-faux de l’AFM et le second une réaction contraignante avec le groupe de thiol du polymère de masse de haute molaire fonctionnalisé. En outre, les molécules inactives de liaison PEG servent de couche de passivation pour empêcher les interactions indésirables entre le polymère de sonde et la pointe de porte-à-faux d’AFM aussi bien qu’entre la pointe de porte-à-faux d’AFM et la surface sous-jacente.

Protocole

REMARQUE : Voir la figure 1 pour une vue d’ensemble schématique.

1. Configuration de réactif

REMARQUE : Les polymères utilisés pour ce protocole sont : le mâle-polyéthylène glycol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), thiol-polyethylène glycol-thiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) et thiol fini polystyrène (PS-SH, 1,3 mDa).

  1. Préparer la masse molaire bien définie et élevée PNiPAM-SH par polymérisation radicale de transfert d’atome, suivie par la conversion et la réduction du groupe final fonctionnel pour l’introduction d’une moiety de thiol, comme décrit dans la littérature18. Veuillez consulter la figure 1 pour les structures détaillées.
  2. Pour le stockage des produits chimiques, préparer des aliquots plus petits dans un système de boîte à gants sèche avec de l’atmosphère d’azote pour éviter l’exposition à l’oxygène atmosphérique et à l’humidité. PEG et PNiPAM sont hygroscopiques45,46 et les groupes finaux fonctionnels de PEG, PNiPAM et PS sont connus pour devenir facilement oxydés lorsqu’ils sont stockés dans des conditions ambiantes33,47,48. Tous les produits chimiques doivent être stockés à -20 oC.
  3. Utilisez des solvants de qualité analytique ou plus. En outre, utiliser de l’eau ultrapure pour rincer les puces de porte-à-faux AFM et la verrerie parce que les expériences à molécule unique sont très sensibles à toute contamination.

2. Configuration de l’équipement

REMARQUE : Utilisez des pincettes et des béchers en acier inoxydable ou en verre. Utilisez des pinces inversées pour une prise en toute sécurité (p. ex., le modèle R3 SA ayant une faible constante printanière).

  1. Préparer la solution RCA (eau ultrapure, peroxyde d’hydrogène et ammoniac (5:1:1)) pour nettoyer la verrerie et les pincettes.
  2. Mettre les vaisseaux dans un bécher et le remplir de RCA jusqu’à ce que la verrerie ou les pincettes soient entièrement recouvertes.
  3. Chauffer le bécher de l’étape 2.2 pour 1 h à 80 oC.
  4. Rincer les navires par la suite avec de l’eau ultrapure jusqu’à ce qu’aucune odeur piquante ne soit plus vérifiable (au moins trois fois).
  5. Verrerie sèche et pince à épiles dans un four (120 oC).

3. Fonctionnalisation de pointe

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte à fumée pour éviter l’inhalation de vapeurs organiques. De plus, des gants, une blouse de laboratoire et une protection oculaire sont nécessaires. Utilisez des gants nitrile ou en latex pour chaque étape afin d’éviter la contamination. Portez des gants résistants au solvant lors de l’utilisation du toluène. Toutes les étapes, sauf indication contraire, sont effectuées à RT. Utilisez de l’équipement frais et des gants pour chaque étape afin d’éviter une éventuelle contamination croisée.

  1. Effectuez l’activation de surface en appliquant du plasma d’oxygène à la puce en porte-à-faux D’AFM MLCT-Bio-DC.
    REMARQUE : L’efficacité du traitement plasmatique pour d’autres échelles de fonctionnalisation avec le contenu de l’oxygène dans la chambre de plasma.
    1. Utilisez des pincettes fraîchement nettoyées pour placer des puces en porte-à-faux AFM dans une chambre à plasma (40 kHz, 600 W).
    2. Utiliser un programme d’activation sur mesure : évacuation (0,1 mbar) - inondation avec de l’oxygène à une pression de : 0,2 mbar (4 min) - processus plasmatique (puissance : 40 %, durée : 2 min, pression du processus : 0,2 mbar).
    3. Ventilez la chambre et continuez avec l’étape 3.2.2 immédiatement afin d’empêcher toute adsorption de contaminants aux puces de porte-à-faux D’AFM de l’air.
  2. Silanisation et PEGylation
    REMARQUE : Le timing est un paramètre critique entre les étapes. Préparer des solutions aussi fraîches que possible pendant les temps d’attente. Les groupes de maleimide sont soumis à l’hydrolyse dans les médias aqueux et les thiols deviennent facilement oxydés aux disulfides dans la solution33,47 empêchant les réactions de fonctionnalisation de pointe d’AFM.
    1. Préparer une solution silane-PEG-mal dans le toluène (1,25 mg/mL) dans des tubes en plastique ou en verre résistants aux solvants et verser 6 ml de la solution dans des plats Petri plats plats, 3 ml chacun.
      REMARQUE : Si la fixation de plusieurs polymères de sonde est observée dans l’expérience SMFS, le mélange de silane-PEG-mal avec le silane-PEG non fonctionnel peut réduire le nombre de points d’ancrage. Pour l’ajustement de la couche de passivation PEG avec différentes masses (c.-à-d., longueurs de contour) peut être utilisé27.
    2. Incuber les puces en porte-à-faux AFM immédiatement après l’étape 3.1.3 dans la solution silane-PEG-mal (jusqu’à 10 croustilles par plat Petri) pour 3 h à 60 oC35.
    3. Sortez les plats Petri du four et laissez la solution refroidir pendant au moins 10 minutes.
    4. Rincer soigneusement chaque puce en porte-à-faux AFM. Réduisez l’impact des forces capillaires sur le porte-à-faux AFM lors du passage de l’interface solvant d’air, par exemple en inclinant légèrement ces puces lorsqu’elles s’immergent dans la solution.
      1. Pour les polymères PEG et PS, rincez trois fois avec le toluène.
      2. Pour le polymère PNiPAM, rincez une fois avec le toluène et deux fois avec de l’éthanol.
    5. Choisissez au moins deux puces en porte-à-faux AFM comme puces en porte-à-faux AFM de contrôle, en sautant l’étape 3.3 et en les rinçant comme suit pour augmenter la polarité du solvant :
      1. Pour les polymères PEG et PS, rincez deux fois avec de l’éthanol et une fois avec de l’eau ultrapure.
      2. Pour le polymère PNiPAM, rincez deux fois avec de l’eau ultrapure.
        REMARQUE : Les puces en porte-à-faux de contrôle d’AFM ont franchi toutes les étapes de fonctionnalisation, à l’exception de l’attachement de polymère (étape 3.3). Ils servent à prouver la propreté du processus de fonctionnalisation, le système de porte-puce en porte-à-faux AFM, les surfaces et les solvants utilisés pour l’expérience SMFS.
  3. Attachement covalent de polymère
    REMARQUE: Même si la pointe de porte-à-faux AFM devrait être complètement recouverte de groupes de maleimide, il n’y a que quelques sites de liaison pour le polymère de la sonde unique, parce que le maleimide subit une hydrolyse dans l’eau menant à des PEG inactifs47. Ces PEG inactifs agissent comme une couche de passivation, comme décrit ci-dessus.
    1. Incuber les puces en porte-à-faux AFM directement après l’étape 3.2.5 dans l’une des solutions polymères suivantes dans des plats Petri de 3 mL. Si le polymère respectif n’est pas dissous correctement, utilisez un bain d’eau de 40 oC et remuez bien la solution.
      REMARQUE : Comme l’utilisation de polymères terminés de thiol pourrait conduire à la formation de liaisons de disulfide entraver la réaction avec les groupes masculins de silane-PEG-mal, un agent de réduction est recommandé, en particulier si l’étape 3.3 est appliquée dans des tampons aqueux pour les polymères solubles dans l’eau33.
      1. Pour les polymères PEG et PS, utilisez une concentration de 1,25 mg/mL dans le toluène pendant 1 h à 60 oC.
      2. Pour les polymères PNiPAM, utilisez une concentration de 1,25 mg/mL en éthanol pendant 3 h à RT.
        REMARQUE : Si la fixation des polymères de sonde multiples est observée dans l’expérience SMFS, la concentration du polymère doit être réduite.
    2. Rincez soigneusement chaque puce en porte-à-faux AFM.
      1. Pour les polymères PEG et PS, rincez deux fois avec le toluène, deux fois avec de l’éthanol et une fois avec de l’eau ultrapure après un refroidissement de 10 minutes.
      2. Pour les polymères PNiPAM, rincez deux fois avec de l’éthanol et deux fois avec de l’eau ultrapure.
    3. Conservez chaque puce en porte-à-faux AFM séparément dans un petit plat Petri (1 ml) rempli d’eau ultrapure à 4 oC jusqu’à ce qu’il soit utilisé dans une expérience.

4. Préparation de surface

  1. Gaufrettes d’oxyde de silicium
    REMARQUE : Cette surface a été utilisée pour smFS avec PEG et PNiPAM.
    1. Couper une plaquette d’oxyde de silicium en petits morceaux à l’aide d’un couteau à diamants.
    2. Placez les morceaux d’oxyde de silicium séparément dans des tubes de microcentrifuge et remplissez ces tubes d’éthanol.
    3. Sonicate les morceaux d’oxyde de silicium pendant 10 min.
    4. Rincer les morceaux d’oxyde de silicium avec de l’éthanol deux fois et les sécher soigneusement sous un flux d’azote. Utilisez immédiatement les morceaux d’oxyde de silicium.
  2. Monolayer auto-assemblé de thiol hydrophobe alkane sur l’or (SAM)
    REMARQUE: Cette surface a été utilisée pour SMFS avec PS. Voir la littérature39,49 pour plus d’informations sur les SAM.
    1. Utilisez une plaquette de silicium enduit d’or (A [100], 5 nm titane, 100 nm d’or) pour effectuer des pas 4.1.1 - 4.1.4.
    2. Incuber les pièces de surface dans une solution de 1 dodecanthiol (2 mM) pour 18 h.
    3. Rincer les SAM fraîchement préparés à l’éthanol deux fois.
    4. Les SAM secs avec le débit d’azote pour une utilisation directe ou les entreposent dans l’éthanol jusqu’à 4 jours pour une utilisation ultérieure.

5. Acquisition de données

REMARQUE : Toutes les mesures montrées ici ont été exécutées dans l’eau ultrapure avec un AFM Cypher ES utilisant un stade d’échantillon de chauffage et de refroidissement pour la variation de température. En général, tous les APN fournissant la capacité de mesurer dans les liquides peuvent être utilisés.

  1. Insérez la puce en porte-à-faux AFM fonctionnalisée dans l’AFM.
  2. Collez la surface préparée dans un porte-échantillons qui convient à la mesure des liquides (p. ex., composé de reproduction haute résolution 101RF ou adhésif curable UV).
    REMARQUE : Ces agents de liaison sont très inertes et résistants à un grand nombre de solvants polaires. La résistance de l’adhésif aux solvants nonpolaires (p. ex., toluène ou hexane) ou à des températures élevées doit être vérifiée avant l’utilisation.
  3. Plongez la puce en porte-à-faux AFM et l’échantillon de sonde dans le liquide, ici : l’eau ultrapure.
    REMARQUE : Une goutte de solvant (environ 100 ll) peut être déposée sur le porte-puce en porte-à-faux AFM. Le fait de couvrir la puce en porte-à-faux AFM avec du solvant réduit les forces capillaires, ce qui autrement agirait sur le porte-à-faux AFM lorsqu’il s’approcherait de la surface de l’échantillon en passant par l’interface solvable.
  4. Si nécessaire, ajustez la température et laissez le système équilibrer.
    REMARQUE : Les changements de température peuvent entraîner une déviation du porte-à-faux AFM en raison d’un effet bimétallique pour les porte-à-faux AFM avec un revêtement réfléchissant comme l’aluminium ou l’or. L’équilibre doit être effectué à l’écart de la surface (plusieurs m) jusqu’à ce qu’aucun autre changement du signal de déviation ne soit observé (jusqu’à 15 minutes pour MLCT-Bio-DC).
  5. Variez la température au hasard pour exclure tout effet du vieillissement de la fonctionnalisation. Assurez-vous que les températures appliquées ne conduisent pas à une flexion irréversible du porte-à-faux AFM.
    REMARQUE : Tout effet de température sur les propriétés solvantes (comme l’évaporation ou les changements de viscosité) peut entraver vos expériences. Dans les exemples présentés, la température a varié sur une plage allant jusqu’à 40 K dans les étapes de 10 K prenant l’eau comme solvant (p. ex., de 278 K à 318 K).
  6. Approchez la surface pour déterminer l’InvOLS (sensibilité inverse du levier optique) en prenant des courbes d’extension de force sur une surface dure (comme l’oxyde de silicium). Pour cela, prenez le signal de déviation de la distance photodétrône (en V) vs piezo et déterminez la pente de la pièce représentant l’indentation de la pointe de porte-à-faux AFM dans la surface sous-jacente (régime répulsif) à l’aide d’une fonction linéaire. Afin de réduire les erreurs, prenez la moyenne d’au moins cinq valeurs pour obtenir la valeur finale InvOLS. Pour plus de détails, voir la littérature4,39.
    REMARQUE : Les InvOLS ne peuvent être déterminés de façon fiable que sur les surfaces dures. Dans le cas d’expériences sur des surfaces molles ou des interfaces, assurez-vous de placer une surface dure près de vos surfaces douces. Ensuite, l’étalonnage InvOLS peut être fait avant ou après vos expériences de surface molle sans avoir besoin de démonter la configuration AFM.
  7. Pour une détermination constante au printemps, déplacez le porte-à-faux AFM à une hauteur sans interactions attrayantes ni répulsives entre la pointe et la surface du porte-à-faux AFM (plusieurs m). Ensuite, enregistrez un spectre de bruit thermique où la densité spectrale de puissance (PSD) vs fréquence est tracée. Les étapes suivantes sont généralement effectuées par des fonctions intégrées automatisées dans les logiciels commerciaux AFM : premièrement, le spectre de bruit thermique acquis est analysé en adaptant une fonction à la DSP, par exemple, un simple oscillateur harmonique (SHO). L’ajustement est fait jusqu’au minimum entre la première et la deuxième résonance. Deuxièmement, la zone sous la partie ajustée de la parcelle PSD vs fréquence est déterminée représentant le déplacement carré moyen du porte-à-faux AFM dans la direction verticale. Enfin, le théorème d’équipementartition est utilisé pour obtenir la force de porte-à-faux AFM constante28,50.
    REMARQUE : Une plage de fréquence appropriée doit être utilisée comprenant le premier pic de résonance du porte-à-faux AFM. Pour obtenir un rapport signal-bruit satisfaisant, au moins 10 DSP doivent être accumulés avec la résolution de fréquence la plus élevée possible.
  8. Commencez l’expérience. Enregistrer les cartes de force en prenant des courbes d’extension de force d’une manière de type grille (p. ex., 10 x 10 points pour une superficie de 20 x 20 m2)pour éviter tout effet de surface local (p. ex., impuretés, dislocations) et pour la moyenne des différentes surfaces.
    REMARQUE : Les paramètres typiques sont une vitesse de traction de 1 m/s et un taux d’échantillonnage de 5 kHz pour assurer une résolution suffisante. Le taux d’échantillonnage doit être adapté lorsque la vitesse de traction est variée. La distance de rétractation doit être adaptée à la longueur de contour ou de désorption du polymère mesuré (environ deux fois la longueur prévue).
  9. Utilisez et variez le temps d’habiter vers la surface pour permettre au polymère unique d’adhérer à la surface (généralement 0 à 5 s).
  10. Répétez la détermination de l’InvOLS et de la constante printanière à la fin de l’expérience pour vérifier la cohérence et la stabilité du système.
    REMARQUE : Pour une forte adhérence entre le polymère et la surface, l’étalonnage peut être fait après l’expérience réelle pour préserver la fonctionnalisation.

6. Évaluation des données

REMARQUE : Pour l’évaluation des données, un logiciel écrit sur mesure basé sur Igor Pro a été utilisé pour effectuer les étapes suivantes.

  1. Convertir le signal de déviation brute (dans les Volts) en valeurs de force (dans Newtons) en multiplication avec l’InvOLS enregistré et la constante de ressort déterminée.
  2. Soustrayez la déviation du porte-à-faux AFM (après multiplication du signal de déviation brute avec l’InvOLS) de la distance entraînée par les éléments piezo en direction verticale afin d’obtenir la véritable extension (distance tip-surface)4.
  3. Corriger les courbes d’extension de force obtenues pour la dérive en installant une fonction linéaire à la ligne de base après le dernier événement et en soustrayant la même chose de la courbe d’extension de la force. La pièce ajustée devrait représenter une extension suffisante de la surface où ni les interactions attrayantes ni répulsives ne sont observées entre la pointe de porte-à-faux aFM et la surface sous-jacente. Ensuite, la ligne de base est réglée à l’axe zéro.
    REMARQUE : Dans le cas des mesures sur des surfaces très réfléchissantes comme l’or, des interférences peuvent apparaître. Ceux-ci résultent d’un reflet partiel du faisceau laser de la surface et de l’arrière du porte-à-faux AFM. Ainsi, les courbes obtenues de force-extension pourraient montrer un artefact de signal de force sinusoïdale le long de l’extension verticale. Il s’agit d’un artefact qui entrave les valeurs de la force finale. Afin de tenir compte de ces courbes d’extension de force, une correction est possible(figure 2).
  4. Si les interférences apparaissent dans les courbes d’extension de la force, sélectionnez une courbe représentative d’extension de force (courbe de rétraction) ne montrant aucun autre événement qu’un pic d’adhérence non spécifique et le même artefact sinusoïdale (c.-à-d. amplitude et phase) (figure 2A).
    REMARQUE : Lisser la courbe représentative d’extension de force afin d’obtenir le modèle de basse fréquence de l’interférence.
  5. Sélectionnez une courbe d’extension de force qui doit être corrigée(figure 2B).
  6. Superposer les deux courbes d’extension de force à partir des étapes 6.4. et 6,5. pour s’assurer que les deux montrent le même artefact sinusoïdale (c.-à-d. l’amplitude et la phase) (figure 2C).
  7. Soustrayez la courbe représentative (lissée) d’extension de force de la courbe d’extension de force à corriger, ce qui entraîne une ligne de base droite plutôt qu’une ligne de base sinusoïdale(figure 2D).
    REMARQUE : Veillez à ce que le pic d’adhérence non spécifique de la courbe représentative soit distinct de tout événement de molécule apparaissant dans les courbes à corriger. En fait, le choix de la courbe représentative est crucial pour une correction appropriée.

Résultats

Les exemples suivants montrent les résultats de l’étirement et de la désorption des polymères PEG, PNiPAM et PS. Tous les conseils en porte-à-faux AFM ont été fonctionnalisés avec le protocole donné ci-dessus. PEG et PNiPAM ont été mesurés sur SiOx avec variation de température. Pour une discussion détaillée des courbes d’étirement dépendantes de la température qui en résultent pour PEG et PNiPAM, voir Kolberg et coll.18 Un motif d’extension de force différent est un plateau de force constante (p. ex., lorsque le PS désorbe des monolayers auto-assemblés de méthyle terminé alkane thiols sur l’or (SAM) dans l’eau4,27,39,51).

Exemple 1 : Étirement de PEG et PNiPAM dans l’eau
Le comportement d’étirement dépendant de la température dans l’eau a été mesuré à l’aide de polymères PNiPAM et PEG uniques covalentement liés à une pointe de porte-à-faux AFM à une extrémité et physisorbed sur une surface siOx à l’autre extrémité. Après les expériences d’étalonnage et de contrôle propre (moins de 2 % des courbes d’extension de la force montrent des événements à molécule unique), au moins deux cartes de force ont été enregistrées pour chaque porte-à-faux AFM. L’expérience dépendante de la température a été réalisée en enregistrant au moins une carte de force à chaque température. Lorsque seulement peu d’événements d’étirement sont apparus, le porte-à-faux AFM respectif a été jeté et le prochain porte-à-faux AFM de la puce a été prise (généralement dans l’ordre C, B, D et E de MLCT-Bio-DC). Pour les données exemplaires de PEG, un seul événement d’étirement a été observé dans 95 des 500 courbes mesurées d’extension de force (19 %). Pour le PNiPAM, 252 courbes d’extension de force sur 600 ont montré un schéma d’étirement (42 %). Pour une meilleure comparaison des courbes d’extension de force, une courbe de maître unique pour chaque température a été générée. À cette fin, seules les courbes avec un événement d’étirement à au moins 500 pN, où les fluctuations conformationnelles et les effets de solvant sont négligeables, ont été choisis52. Le nombre final d’étirements pris en compte était de 3 à 278 K, 7 à 298 K et 4 à 318 K pour PEG et 4 à 278 K, 3 à 298 K et 3 à 318 K pour PNiPAM18.

La procédure de génération de courbes maîtresses est donnée dans la figure 3. Les courbes d’extension de force choisies(figure 3A) sont redimensionnelles à une longueur L0 (extension à une force de 500 pN), voir la figure 3B. Le pic d’adhérence montre une grande variation de l’adhérence non spécifique entre la surface et la pointe de porte-à-faux AFM, mais n’influence pas le comportement d’étirement du polymère. Après avoir fusionné les courbes redimensionnalées d’extension de force, elles sont moyennes par un lissage binominal tel que présenté dans la figure 3C. Pour cela, un filtre gaussien convove les données avec des coefficients normalisés dérivés du triangle de Pascal à un niveau égal au paramètre de lissage 2053. Enfin, une courbe principale est obtenue pour chaque température donnée dans la figure 3D. Le zoom-in montre la plage où l’effet de température sur le comportement de force-extension est le plus prononcé.

Une comparaison du comportement de température de PEG (A) et PNiPAM (B) peut être trouvée dans la figure 4. Pour PEG, on a observé une diminution de la force d’étirement avec une température croissante. Une augmentation d’environ 5 % de l’extension redimensionné à 100 pN a été observée lors de l’augmentation de la température de 278 à 318 K. Pour le PNiPAM, un changement opposé dépendant de la température pourrait être révélé. Une diminution d’environ 1 % de l’extension redimensionnée à 100 pN a été observée lorsque la température est passée de 278 à 328 K. En outre, l’énergie sans étirement pouvait être obtenue à partir des courbes du maître d’extension de la force en déterminant la zone sous la courbe pour une valeur de force donnée. Cela pourrait être utilisé pour extraire les contributions énergétiques et entropiques de l’énergie libre d’étirement à l’aide de la dynamique moléculaire (MD) simulations18.

Exemple 2 : Désorption de PS à partir d’une surface SAM dans l’eau
La désorption de PS d’une surface SAM dans l’eau pourrait être employée pour déterminer la force et la longueur de desorption et ainsi quantifier l’interaction hydrophobe. Après l’étalonnage, au moins deux cartes de force ont été enregistrées à deux endroits différents de la surface. Lorsque l’attachement des polymères a été couronné de succès, les courbes d’extension de la force montraient des plateaux de force constante, comme caractéristique, voir la figure 5A et la figure 5C. La désorption en ce qui a sur le plateau est observée lorsque la dynamique des liaisons sondées est beaucoup plus rapide que le taux de traction de la pointe en porte-à-faux AFM (quasi-équilibre). Les forces de désorption des courbes de force-extension de plateau fournissent directement des énergies libres d’adhérence en intégrant la trace de force-extension54. Ils ont été utilisés pour déterminer les interactions électrostatiques, dispersives et hydrophobes ainsi que les propriétés de friction des polymères simples sur les surfaces dans l’environnement liquide2,4,23,51,54,55.

Chaque plateau de force constante a été équipé d’une courbe sigmoidale pour déterminer la force de désorption et la longueur de desorption, qui ont ensuite été tracées dans histogrammes. Les histogrammes ont été équipés d’un Gaussien pour extraire la valeur maximale et l’écart standard. Pour une meilleure vue d’ensemble, la force de désorption et les valeurs de longueur ont été affichées ensemble dans une parcelle de dispersion, comme indiqué dans la figure 5B et la figure 5D.

Pour le polystyrène sur SAM dans l’eau, les forces de désorption déterminées correspondent à des valeurs précédemment obtenues19,23. Comme la longueur de desorption est corrélée avec la longueur de contour de polymère51, la distribution de longueur de desorption peut être utilisée comme preuve de la liaison covalente du polymère respectif à la pointe de porte-à-faux D’AFM via son groupe final fonctionnel. Ainsi, la longueur de desorption sert d’empreinte digitale.

Pour plus d’un polymère attaché à la pointe de porte-à-faux AFM, des cascades de plateaux (étapes discrètes) peuvent être observées dans les courbes d’extension de force56. Chaque plateau représente le desorption d’un polymère à une extension différente. L’expérience donnée dans la figure 5C et la figure 5D a montré un cas typique de deux polymères attachés à la pointe de porte-à-faux de l’AFM en même temps. En adaptant la rupture finale, une distribution bimodale pouvait être trouvée pour la longueur de desorption, tandis que la force de desorption a montré une distribution étroite. Dans ce cas, la plus petite longueur de desorption pourrait être trouvée dans 90% des courbes d’extension de force, soit comme un plateau unique ou comme un plateau supplémentaire sur le plateau plus long, tel que donné dans la figure 5C. La longueur de désorption plus élevée a été trouvée dans 37% des courbes de force-extension obtenues. Ainsi, la distribution de longueur de desorption pourrait être utilisée pour déterminer le nombre de différents polymères attachés à la pointe de porte-à-faux D’AFM. En général, une distribution étroite des valeurs de longueur de desorption est une bonne indication qu’un seul polymère a été sondé dans les courbes d’extension de force obtenues. Dans le même temps, une superposition des forces respectives-extension peut être utilisée pour décider si un et même polymère unique a été mesuré.

Après s’être avéré la liaison covalente d’un seul polymère PS, d’autres expériences avec ce polymère PS peuvent être effectuées substrat variable (surface solide ainsi que des films de polymère), conditions de solvants, température, vitesse de traction ou temps de séjour.

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Figure 1 : Aperçu schématique du processus de fonctionnalisation des pourboires. Inclut la modification chimique de la pointe de porte-à-faux d’AFM après (1) activation plasmatique (2) silanization/PEGylation et (3) l’attachement de polymère. En outre, les structures chimiques détaillées des polymères utilisés, à savoir PEG, PNiPAM et PS sont montrées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : Élimination des interférences dans les courbes d’extension de la force. (A) Trouver une courbe d’extension de force montrant un artefact de signal de force sinusoïdale le long de l’extension mais n’ayant pas d’événement d’étirement de molécule unique. (B) Choisissez une courbe d’extension de force avec un seul événement de molécule, qui doit être corrigée à partir de l’artefact sinusoïdale. (C) Superposer les courbes pour contrôler si les artefacts sinusoïdales des courbes correspondent vraiment. (D) En soustrayant la courbe d’extension de force (A) à partir de (B) une courbe d’extension de force avec une ligne de base droite est obtenue. Bien que le pic d’adhérence ne puisse pas être utilisé pour une analyse plus approfondie, la courbe d’extension de la force est maintenant corrigée pour l’artefact menant à des valeurs de force beaucoup plus précises dans la région de l’événement de molécule unique (ici: 'gt; 0.2 'm d’extension). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3 : Détermination des courbes de maître des courbes d’extension de force de PEG à 298 K. (A) Données expérimentales à 298 K, à l’aide de 7 courbes d’extension de force. Après redimensionnement à une longueur L0 à une force de 500 pN (B), les courbes d’extension de force peuvent être fusionnées et moyennes par lissage binominal obtenant une courbe de maître (C). Les courbes redimensionné sont données comme points tandis que la courbe de maître est montrée comme une ligne solide. Enfin, les courbes maîtresses obtenues pour différentes températures peuvent être comparées (D). Le zoom-in indique la plage où l’effet de température sur le comportement de force-extension est le plus prononcé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4 : Comparaison des courbes de maître dépendantes de la température du PNiPAM et du PEG. Pour PEG, on observe une augmentation de l’extension redimensionnalée à 100 pN (gamme de milieu de force) lors de l’augmentation de la température(A),tandis que pour le PNiPAM, un changement opposé dépendant de la température est révélé(B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 5 : Analyse des courbes d’extension de force du PS sur le SAM dans l’eau. (A) Courbe exemplaire d’extension de force (bleu) avec un ajustement sigmoïdale du plateau (violet). En outre, les flèches marquent la force déterminée (rouge) et la longueur (verte) du plateau. La force de désorption et les valeurs de longueur de desorption obtenues par des ajustements sigmoidal sont affichées dans une parcelle de dispersion et les histogrammes qui en résultent sont équipés d’un Gaussien. (B) Les valeurs moyennes déterminées de la force de desorption et de la longueur desorption sont (112 à 6) pN et (659 à 7) nm, où 93 % des courbes d’extension de force montrent de tels événements de plateau unique. (C) Courbe exemplaire d’extension de force (bleu) pour deux polymères attachés à la pointe de porte-à-faux AFM en même temps. Ici, la force de desorption montre une distribution unimodale avec une valeur de force moyenne de (117 à 5) pN, tandis qu’une distribution bimodale peut être trouvée pour la longueur de desorption menant à des valeurs moyennes de longueur de (656 - 9) nm et (1050 - 16) nm. (D) 90% des courbes échantillonnées de force-extension ne montrent que des événements de plateau unique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Le SMFS basé sur l’AFM est l’un des principaux outils pour étudier les interactions à une seule molécule dans la physique des polymères. Pour une véritable expérience à molécule unique, l’attachement covalent du polymère de la sonde à une pointe de porte-à-faux AFM est essentiel.

Beaucoup d’œuvres précédentes sont basées sur des expériences de nanopêche, en particulier pour PNiPAM, où les polymères sont adsorbés sur une surface, puis étirés en les cueillant au hasard à partir du substrat à l’aide d’un tip en porte-à-faux AFM30,31. Cela pourrait modifier les résultats et conduire à une mauvaise interprétation du comportement de la molécule unique. Là, les effets coopératifs pourraient dominer les résultats parce que les interactions avec les polymères voisins ne peuvent pas être exclues. Cela a un impact important sur les résultats, en particulier pour les polymères qui montrent un comportement significativement différent en vrac par rapport aux molécules isoléessimples 57,58.

Le protocole de fonctionnalisation présenté ici est fiable et peut être facilement appliqué à différents polymères, indépendamment de leur longueur de contour, hydrophobicity ou l’obstacle stérique des monomers. En outre, une passivation est fournie pour prévenir les interactions indésirables entre le polymère de sonde unique et la pointe de porte-à-faux AFM ainsi qu’entre la pointe de porte-à-faux AFM et la surface sous-jacente. En outre, l’évaluation des courbes d’extension de force montrant des événements d’étirement est montrée. Là, une procédure est proposée pour la détermination des courbes de force-extension. Cela offre un meilleur moyen de révéler, par exemple, les effets liés à la température sur le comportement d’extension de la force. En outre, l’analyse des événements de désorption d’une seule molécule comportant des plateaux de force constante est fournie. En outre, un moyen simple de corriger les artefacts de signal de force sinusoïdale dans les courbes de force-extension est donné qui pourrait autrement altérer les résultats de l’expérience.

Par rapport à Stetter et al.39, la procédure de fonctionnalisation présentée ici est réduite à trois étapes au lieu de quatre et la robustesse de la procédure est améliorée. L’avantage majeur de l’exécution de PEGylation et de silanization en une seule étape est d’avoir une réaction mieux contrôlée et d’augmenter le rendement. En outre, moins de solutions doivent être préparées et moins d’étapes de rinçage sont nécessaires. Cela réduit l’effort et le temps de préparation et augmente la reproductibilité. En outre, le déplacement des cantilevers AFM est toujours une partie essentielle du processus de fonctionnalisation. Un transfert d’une solution à l’autre risque toujours d’influencer fortement la qualité de la fonctionnalisation en raison des transferts par l’interface air-eau ou de la perte de porte-à-faux AFM par une mauvaise utilisation de pincettes.

Afin de prouver l’attachement covalent approprié d’un seul polymère à un cantilever AFM pointe différentes conditions doivent être remplies. Tout d’abord, les porte-à-faux de contrôle de l’AFM sont d’une importance significative et doivent être préparés à chaque fonctionnalisation. Le processus de fonctionnalisation et la cellule liquide pour effectuer les expériences ne sont considérés comme propres, que si un petit nombre de courbes d’extension de force montrent des étirements ou des plateaux dans l’expérience de contrôle (dans les exemples présentés de moins de 2%).

Un modèle d’étirement clair sans d’autres gouttes ou maxima est essentiel pour avoir des événements d’étirement de molécule unique approprié. En outre, la dépendance de la force de rupture sur le taux de chargement de la force à la rupture ou la réponse élastique complète de la courbe d’étirement doit être analysée afin d’exclure la désorption simultanée de polymères multiples59,60. Pour PEG et PNiPAM, 19 % et 42 % des courbes d’extension de force prises à différentes positions de la surface présentaient un tel schéma d’étirement, respectivement. Afin d’obtenir des événements d’étirement, la physisorption du polymère à la surface sous-jacente respective doit être forte. Sinon, un événement de desorption de plateau-comme est observé. Ceci est encore plus décisif pour la détection d’étirements à haute force (jusqu’à 500 pN ou plus). Comme cette forte physisorption n’est pas satisfaite pour chaque courbe d’extension de force, le rendement de tels événements est inférieur aux événements purs de desorption de plateau-comme. Comme alternative, des groupes fortement adhérants tels que des catéchols ou la chimioption entre le polymère et la surface sous-jacente peuvent être utilisés. Toutefois, cela nécessite l’introduction d’autres groupes fonctionnels ou des sites d’accouplement au polymère61,62.

En fait, la masse (c.-à-d. la longueur du contour) du polymère fournit une empreinte précieuse. Bien que la masse ne puisse pas être traduite directement dans la longueur mesurée du contour pour les raisons suivantes, la distribution de longueur est très précieuse pour définir les événements à molécule unique. Dans le cas d’un polymère PNiPAMƉ avec une faible polydispersité (1,28), nous avons trouvé des différences significatives dans les valeurs d’extension pour les événements d’étirement obtenus (et donc dans la longueur du polymère) dans les expériences. L’une des raisons en est la détermination de la longueur du polymère et de sa distribution. Dans la chromatographie de taille-exclusion (SEC), un poids relatif du polymère cible est déterminé par rapport à des normes comme PS ou poly (méthacrylate méthylique) (PMMA)63. On s’attend à ce que le poids relatif présumé s’écarte du poids moléculaire absolu parce que le rayon hydrodynamique du polymère cible et de la norme peut différer considérablement. En outre, la couche de silane peut être oligométisée par de l’eau fallacieuse dans le toluène pendant le processus de fonctionnalisation. L’attachement de ces oligomers à la pointe de porte-à-faux AFM conduit à une couche plus flexible avec moins de points d’ancrage64. En outre, le point d’attachement du polymère à la couche de silicium pourrait ne pas nécessairement être au sommet conduisant à un déplacement des valeurs de longueur détectées29. Alors qu’un modèle de polymère comme la chaîne vermifuge (WLC) ou le modèle de chaîne librement joint (FJC) ne peut pas reproduire le comportement d’extension de force respectif pour PEG ou PNiPAM correctement sur toute la gamme d’extension18,29,41,65,66, un tel modèle de polymère pourrait être précieux pour d’autres systèmes polymères et protéinés10,15,67,68.

L’attachement covalent d’un seul polymère PS (d’une longueur de contour de plus de 1 m) n’est considéré comme un succès que lorsqu’un nombre considérable de courbes d’extension de force montrent un plateau assez long de force constante(figure 5). Un plateau résultant du désorbage d’un seul polymère est défini par une seule chute brutale d’une force constante à la ligne de base à une certaine extension, comme le donne la figure 5A. Si plus de polymères sont attachés à la pointe de porte-à-faux de l’AFM, une cascade de plateaux est observée56 (figure 5C). La longueur du plateau (longueur de desorption), corrélante avec la longueur de contour de polymère51, doit être significativement plus longue que n’importe quel pic d’adhérence dû à l’adhérence non spécifique de la pointe de porte-à-faux d’AFM à la surface sous-jacente (ici autour de 200 nm). Les caractéristiques apparaissant uniquement dans une courbe d’extension de force unique, ne doivent pas être interprétées. Dans les expériences présentées, au moins 80 courbes sur 100 ont montré un plateau de plus de 200 nm dans au moins deux cartes de force à deux endroits différents sur la surface. En outre, la distribution des longueurs de desorption, à l’aide de parcelles de dispersion telles que donnée dans la figure 5B et 5D, révèlent si et combien de polymères sont liés à la pointe de porte-à-faux AFM. Dans le cas du PS, une distribution étroite de la force et de la longueur de desorption provenant des plateaux des courbes d’extension de la force a servi de preuve d’un attachement covalent réussi. Cela a finalement prouvé le succès du protocole de fonctionnalisation. Ainsi, nous recommandons fortement de présenter de telles distributions de force et de longueur dans les publications.

L’évaluation des courbes d’extension de force à l’aide d’algorithmes intégrés qui comprennent de nombreux paramètres prédésé doit être effectuée avec soin. Les raisons sont par exemple qu’un taux d’échantillonnage fixe n’est pas approprié pour chaque vitesse de traction appliquée ou qu’un lissage automatisé des courbes d’extension de force pourrait en moyenne des détails importants. Habituellement, une bonne compréhension de la procédure d’évaluation respective peut prévenir les erreurs dans la procédure d’évaluation, ce qui peut à son tour influencer fortement les résultats finaux d’une expérience SMFS basée sur l’AFM.

En résumé, nous présentons un protocole de fonctionnalisation qui est fiable et peut être facilement appliqué à une variété de polymères. En outre, une évaluation appropriée des courbes d’extension de force d’une molécule est présentée, permettant la détermination des paramètres physiques tels que la force d’étirement, la force de désorption et la longueur de desorption. Les protocoles et procédures présentés sont précieux pour l’étude des systèmes sensibles aux stimuli au niveau de la molécule unique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

B.N.B. et T.H. reconnaissent le financement de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande de la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC-2193/1 - 390951807, gefàrdert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der L’nder - EXC-2193/1 - 390951807, et subvention HU 997/1-13 (projet 420798410). M.G. reconnaît le soutien partiel dans le cadre du projet LOEWE iNAPO par le ministère de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et des Arts de l’État de Hessen. Nous remercions le Dr Wolfgang Bronner et le Dr Agne Zukauskaite de l’Institut Fraunhofer pour la physique appliquée de l’État solide IAF pour le don de gaufrettes de silicium enduit d’or de haute qualité.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Dodecanethiol (≥98%)Sigma-Aldrich, USA417364-500MLUsed for SAM
Ammonia solution (30%)Roth, GermanyCP17.2Used for cleaning
Cypher ESAsylum Research, an Oxford Instruments company, USA-AFM
Ethanol (≥99.9%)Roth, GermanyPO76.1Solvent
Gold coated silicon waferFraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany-Used for SAM
High Resolution Replicating CompoundMicroset Products Ltd, UK101RFBonding agent
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich, USAH1009Used for cleaning
Igor ProWavemetrics, USA-Software environment
Tetra-30-LF-PCDiener Electronic, Germany-Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilaneCreative PEG works, USAPHB-1923Linker polymer
MLCT-Bio-DCBruker, USAMLCT-Bio-DCAFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µmMicroChemicals, GermanyWSA40600250 P1314SNN1Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cmElga LabWater, Germany10034-540Ultrapure water source
R3 SAVomm GmbH, Germany5803 BlankTweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)Gallei Group, Saarland University, Germany-PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrenePolymer Source, CanadaP40722-SSHPS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiolCreative PEGWorks, USAPSB-615PEG probe polymer
Toluene (99.99%)Fisher ChemicalsT324-500Solvent

Références

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1 (2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T., Hashmi, S. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. , (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705 (2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110 (2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394 (2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. . Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187 (2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301 (2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

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