Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex

Résumé

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple de croissance, de purification, et de titrage du virus oncolytique de simplex d’herpès pour l’usage préclinique.

Résumé

Les virus oncolytiques (OV), tels que le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV), sont une stratégie de traitement en croissance rapide dans le domaine de l’immunothérapie du cancer. Les VQ, y compris le VSS O, se répliquent sélectivement dans les cellules cancéreuses et les tuent (épargnant les cellules saines/normales) tout en induisant une immunité antitumorale. En raison de ces propriétés uniques, les stratégies de traitement basées sur le vHS OHS sont de plus en plus utilisées pour le traitement du cancer, précliniquement et cliniquement, y compris le talimogene laherparevec (T-Vec) approuvé par la FDA. La croissance, la purification et le titrage sont trois techniques de laboratoire essentielles pour tout OV, y compris les VHSO, avant qu’ils ne puissent être utilisés pour des études expérimentales. Cet article décrit une méthode simple étape par étape pour amplifier l’oHSV en cellules de Vero. À mesure que les vhso se multiplient, ils produisent un effet cytopathique (CPE) dans les cellules vero. Une fois que 90-100% des cellules infectées montrent un CPE, elles sont doucement récoltées, traitées avec de la benzonase et du chlorure de magnésium (MgCl_2),filtrées, et soumises à la purification utilisant la méthode de saccharose-gradient. Après purification, le nombre d’oHSV infectieux (désigné comme unités formant plaque ou PPU) est déterminé par un « test de plaque » dans les cellules Vero. Le protocole décrit ici peut être employé pour préparer le stock d’oHSV de haut-titre pour des études in vitro dans la culture cellulaire et les expériences in vivo d’animal.

Introduction

Les virus oncolytiques (VE) sont une forme émergente et unique d’immunothérapie du cancer. Les OV se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales et les lysent (épargnant les cellules normales/saines)¹ tout en induisant une immunité antitumorale². Le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV) est l’un des virus les plus étudiés parmi tous les OVs. Il est le plus avancé dans la clinique, talimogene laherparepvec (T-VEC) étant le premier et le seul OV à recevoir l’approbation de la FDA aux États-Unis pour le traitement du mélanome avancé³. En plus du T-VEC, de nombreux autres oHSVs génétiquement modifiés sont testés précliniquement et cliniquement dans différents types de cancer^3,4,5,6,7,8. La biotechnologie avancée actuelle de l’ADN recombinant a encore augmenté la faisabilité de l’ingénierie de nouveaux oHSVs codant pour le(s) transgène(s) thérapeutique(s)^3,5. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination du titre de l’oHSV est essentiel avant qu’un oHSV (nouvellement développé) puisse être testé pour des études in vitro et in vivo. Cet article décrit une méthode simple étape par étape de croissance de l’oHSV (dans les cellules vero), de purification (par la méthode de gradient de saccharose) et de titrage (par un dosage de plaque de l’oHSV dans les cellules de Vero)(Figure 1). Il peut être facilement adopté dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour obtenir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.

Vero, une lignée cellulaire de rein de singe vert africain, est la lignée cellulaire la plus couramment utilisée pour la propagation de l’oHSV^{9,10,11,12, 13}car^les cellules Vero ont une voie de signalisation antivirale d’interféron^{défectueuse 14.} D’autres lignées cellulaires avec stimulateur inactivé des gènes d’interféron (STING) signalisation peuvent également être utilisés pour la croissance de l’oHSV^12,13. Ce protocole utilise des cellules Vero pour la croissance d’oHSV et l’analyse de plaque. Après la propagation, les cellules infectées par le vHSo sont récoltées, lysées et soumises à une purification, dans laquelle les cellules lysées sont d’abord traitées avec de la nucléase benzonase pour dégrader l’ADN de la cellule hôte, empêcher l’agrégation acide nucléique-protéine et réduire la viscosité du lysat cellulaire. Comme l’activation correcte de la benzonase nécessite souvent^mg2+,1-2 mM_MgCl2 est utilisé dans ce protocole^15. Les débris de cellules hôtes du lysat de cellules benzonase-traités sont en outre éliminés par filtration en série avant la centrifugation à gradient de saccharose à grande vitesse. Un coussin visqueux de solution de saccharose à 25% aide à assurer un taux de migration plus lent du virus à travers la couche de saccharose, laissant les composants liés à la cellule hôte dans le surnageant, améliorant ainsi la purification et limitant la perte de virus dans la pastille^16. L’oHSV purifié est ensuite titré sur les cellules Vero, et les plaques virales sont visualisées par coloration Giemsa¹⁷ ou coloration X-gal (pour lacZ codant oHSVs)^18.

Protocole

1) Croissance de l’oHSV

NOTA : Assurer l’approbation du comité de biosécurité de l’établissement avant de travailler avec le VSSO. Cette étude a été menée dans le cadre du Protocole N° 18007 approuvé par le CIB. Maintenir les précautions BSL2 : blanchir toutes les pipettes, pointes, tubes et autres matières qui entrent en contact avec le virus. Vaporisez les gants avec 70% d’alcool isopropylique avant que les mains ne quittent la hotte de culture cellulaire BSL2. Lavez-vous toujours soigneusement les mains à l’eau savonneuse après avoir travaillé avec un virus.

1. Le jour -1, ensemencer des cellules Vero à faible passage dans des fioles de²⁰ T-150 cm 2 à une densité de 7-8 × 10⁶ cellules/fiole en milieu cellulaire vero régulier.
   REMARQUE : Le milieu vero est préparé en complétant le milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (IFCS).
2. Le jour 0 (les cellules sont confluentes à 80-90%), ajouter l’inoculum oHSV sur les cellules Vero.
   1. Préparation du virus inoculum
      1. Utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01 (MOI peut varier de 0,01 à 0,1 selon la capacité de réplication du virus) pour l’amplification du virus. Utilisez la formule (1) pour calculer la quantité de virus (mL) pour 20 fioles.
         Quantité de virus (mL) pour 20 fioles = quantité de virus nécessaire (pfu)/titre du stock de virus (pfu/mL)(1)
      2. Utiliser la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco à haute teneur en glucose, complétée par un IFCS à 1 % pour préparer l’inoculum du virus (7 mL par fiole T-150 cm^2, c.-à-d. environ 140 mL pour 20 fioles). Ajouter la quantité requise d’oHSV à 140 mL de solution de DPBS à haute teneur en glucose/1% d’IFCS, vortex pendant 1 min, et garder le mélange prêt pour l’ajout aux cellules Vero.
   2. Laver les fioles T-150 cm^2x avec du DPBS à haute teneur en glucose complété par un IFCS à 1% (10 mL/lavage). Aspirer le DPBS/IFCS à 1 % et ajouter 7 mL de fiole d’inoculum du virus/T-150 cm^2.
   3. Balancer doucement les fioles pendant 5 min à l’aide d’une bascule à ballon pour une bonne répartition de l’inoculum sur la monocouche Vero, puis incuber les fioles à 37 °C pendant 1,5 à 2 h. Assurez-vous que l’étagère de l’incubateur est de niveau.
   4. Retirer l’inoculum et ajouter le DMEM complété par 1 % d’IFCS (25 mL/fiole). Incuber les fioles pendant 2-4 jours.
3. Vérifiez quotidiennement les fioles pour 90-100% CPE (voir figure 2).
4. Récoltez les cellules vero infectées par le vhso.
   1. Recueillir le surnageant de culture (~20 mL) de chaque fiole (laisser ~5 mL dans chaque fiole) dans des tubes à centrifuger coniques ou un contenant de support de 50 mL.
   2. Utilisez un grattoir à cellules pour gratter doucement les cellules du fond des flacons.
      REMARQUE: Les cellules doivent rapidement se détacher des flacons.
   3. Ajouter ~15 mL du surnageant de culture (recueilli à l’étape 1.4.1) à chaque fiole (ce qui porte le volume d’environ 20 mL dans chaque fiole, soit 400 mL pour 20 fioles) et laver délicatement le fond des fioles à quelques reprises à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL.
      Remarque : Ne pas pipet vigoureusement. Visez à garder toutes les cellules intactes.
   4. Recueillir les cellules (+ milieu) dans des tubes à centrifuger coniques de 50 mL sur de la glace (utiliser 8 tubes pour contenir 400 mL de cellules récoltées dans 20 flacons).
   5. Faire tourner les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
   6. Ajouter 1,25 mL (50 %) de tampon antivirus (VB) et 1,25 mL (50 %) de surnageant de culture (recueilli à l’étape 1.4.1) dans chaque tube de centrifugation et re-suspendre soigneusement chaque pastille. Transférer les cellules remises en suspension de huit tubes à centrifuger de 50 mL vers un tube de centrifugation conique de 50 mL.
      Remarque : Reportez-vous à la préparation de la solution VB dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution VB à l’aide d’un filtre de stérilisation de milieu. Utiliser 0,5 mL de VB + 0,5 mL de surnageant par fiole T-150 cm² pour la re-suspension, c’est-à-dire pour 20 fioles (20 mL), utiliser 10 mL de VB et 10 mL de surnageant de culture.
   7. Congeler les cellules re-suspendues à l’aide de glace carbonique/éthanol à 100 % et les conserver à -80 °C.

2) Purification de l’oHSV

1. Gel instantané (dans la glace carbonique et 100% éthanol)/dégel (dans un bain d’eau chaude à 37 °C) les cellules suivies d’une sonication au bain-marie pendant 1 min pendant un total de 3 cycles pour assurer une lyse appropriée des cellules pour libérer le virus dans le surnageant.
   REMARQUE: Effectuez une sonication pendant 1 min en utilisant une puissance de 40 kHz et 120 V. Si un sonicateur accordable n’est pas disponible, utilisez un sonicateur de bain d’eau à ultrasons. Prenez une aliquote de 50 μL pour le titrage à la section 3, ce qui aidera à déterminer laquelle des étapes suivantes est responsable de la perte potentielle du virus pendant la procédure de purification.
2. Traiter le lysat cellulaire avec de la benzonase nucléase (175 unités/mL) + 2 mM_MgCl2 (1 M stock = 2 μL/mL), du vortex et incuber pendant 30 min à 37 °C. Placez le tube sur de la glace et effectuez les étapes suivantes à 4 °C.
3. Pelleter les débris cellulaires par centrifugation à basse vitesse.
   1. Faire tourner le lysat cellulaire à 300 g pendant 10 min.
   2. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (remettre en suspension le granulé cellulaire dans 0,5 mL de VB, le désigner comme granulé-1 et le stocker à 4 °C pour l’utiliser à l’étape 2.3.5; voir figure 1).
   3. Faire tourner à nouveau le surnageant (obtenu à l’étape 2.3.2) à 500 g pendant 10 min.
   4. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (remettre en suspension le granulé cellulaire dans 0,5 mL de VB, le désigner comme granulé 2 et le stocker à 4 °C pour l’utiliser à l’étape 2.3.5; voir figure 1).
   5. Mélanger le granulé-1 en suspension (à partir de 2.3.2) et le granulé-2 (à partir du point 2.3.4) dans un nouveau tube à centrifuger de 1,7 mL, un vortex/sonique (bain d’eau) 2x, et tourner à 400 g pendant 10 min. Prélever le surnageant et le combiner avec le surnageant obtenu à l’étape 2.3.4 ; voir figure 1).
      REMARQUE: Effectuez la sonication pendant 1 min en utilisant une puissance de 40 kHz, 120 V pour empêcher l’agrégation virale avant la procédure de filtration à l’étape 2.4. Prendre une aliquote de 50 μL du surnageant combiné pour le titrage à la section 3.
4. Filtrer le surnageant combiné (~21 mL, c.-à-d. 20 mL de 1.4.6, 0,5 mL de 2.3.2 et 0,5 mL de 2.3.4) en utilisant la méthode de filtration en 3 étapes suivante.
   1. Prélever 21 mL du surnageant à l’aide d’une seringue de 10 mL (5-7 mL à chaque fois pour faciliter le passage à travers le filtre) et le faire passer à travers un filtre à membrane stérile de 5 μm de difluorure de polyvinylidène (PVDF) placé sur un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (étiqueté tube 1).
      1. Ajouter 1 mL de VB à un tube de centrifugeuse conique de 50 mL vidé au point 2.4.1 (pour recueillir la quantité infime restante de surnageant viré), vortex, et passer à travers le même filtre PVDF de 5 μm placé sur le TUBE 1 (portant le total à 22 mL de filtrat). Passez à l’étape 2.4.2.
   2. Prélever 22 mL du filtrat du TUBE 1 (comme au point 2.4.1) et le faire passer à travers un filtre à membrane stérile à ester de cellulose mixte (ECM) de 0,8 μm placé sur un nouveau tube à centrifugeuse conique de 50 mL (étiqueté tube 2).
      1. Ajouter 1 mL de VB au TUBE 1 vidé à l’étape 2.4.2, vortex, et le faire passer à travers le même filtre MCE de 0,8 μm placé sur le TUBE 2 (portant le total à 23 mL de filtrat). Passez à l’étape 2.4.3.
   3. Prélever 23 mL de filtrat du TUBE 2 (comme au point 2.4.1) et le faire passer à travers un filtre PVDF stérile de 0,45 μm placé sur un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (étiqueté tube 3).
      1. Ajouter 1 mL de VB au TUBE 2 vidé à l’étape 2.4.3, vortex, et le faire passer à travers le même filtre PVDF de 0,45 μm placé sur le TUBE 3 (portant le total à 24 mL de filtrat).
         NOTA : Prendre une partie aliquote de 50 μL du filtrat pour le titrage à la section 3.
5. Centrifugation à grande vitesse utilisant la méthode du gradient de saccharose
   REMARQUE: Un rotor F13-14x50cy à angle fixe a été utilisé dans ce protocole. Le rotor et la centrifugeuse doivent être à 4 °C avant de procéder aux étapes suivantes.
   1. Ajouter 10 mL d’une solution de saccharose à 25 % glacée et filtrée stérile (préparée en dissolvant 25 g de poudre de saccharose dans 100 mL de la solution saline équilibrée de Hank) dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 mL.
   2. Ajouter lentement (3 mL/min) 24 mL du filtrat du virus (obtenu à l’étape 2.4.3.1) au-dessus de la couche de saccharose. Prenez soin de maintenir des couches séparées du filtrat de virus et de la solution de saccharose.
      REMARQUE: Jusqu’à 30 mL de la couche virale peuvent être ajoutés sur 10 mL de la solution de saccharose.
   3. Centrifuger le tube pendant 90 min à 22 620 g à 4 °C.
   4. Retirer le surnageant et la couche de saccharose du tube de centrifugation conique de 50 mL.
      REMARQUE: Le culot de virus doit être blanchâtre. Prendre une aliquote de 50 μL du surnageant et une aliquote de 50 μL de la couche de saccharose pour le titrage à la section 3.
6. Re-suspendre le culot dans une solution de glycérol/PBS à 10 %.
   1. Ajouter 1 mL de glycérol stérile à 10 % (dilué dans du PBS) au tube de centrifugation conique de 50 mL pour couvrir la pastille.
      NOTA : La quantité du mélange en suspension peut varier (par exemple 0,8 à 1,2 mL) en fonction de la taille de la pastille. Un volume plus petit donnerait une concentration plus élevée de virus.
   2. Placer le tube de centrifugation conique de 50 mL sur de la glace pendant 2-4 h. Pendant cette période, soniquez/vortex la pastille toutes les 15 minutes pendant 30 s pour aider à déloger/re-suspendre la pastille.
   3. Recueillir la pastille en suspension (1 mL de glycérol à 10% / PBS + la taille de la pastille amènera le volume total à ~ 1,3 mL) dans un tube de microcentrifugation de 2 mL. [Facultatif : Ajouter un autre 0,3 mL de glycérol/PBS à 10 % au même tube de centrifugation conique de 50 mL pour recueillir la quantité de trace restante de la pastille, pipet de haut en bas, et combiner avec la pastille re-suspendue à l’étape 2.6.3 pour porter le volume total à ~1,6 mL.]
      1. Si la suspension à l’étape 2.6.3 est trouble ou trouble (due à des débris cellulaires), centrifuger le tube à 500 g pendant 10 min, transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL et passer à l’étape 2.6.4.
   4. Prendre une aliquote de 50 μL pour le titrage du vHS OHS à la section 3. Aliquote le reste de la solution (250 μL/aliquote) dans des tubes de microcentrifugation stériles avec bouchons à vis (bien scellés pour le stockage à long terme), congélation instantanée et conservation à -80 °C jusqu’à l’utilisation (prête pour des études expérimentales une fois le titre de l’oHSV déterminé).
      NOTA : Toutes les matières qui entrent en contact avec le virus doivent être blanchies ou traitées par rayonnement ultraviolet avant d’être retirées de la hotte ou éliminées.

3. Titrage du vHS OHSV et dosage de la plaque

1. Semences 1,7-1,8 x 10⁵ cellules vero/puits dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits en milieu cellulaire vero (DMEM avec 10% IFCS; voir étape 1.1).
   REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont réparties de manière homogène dans tout le puits; ne faites pas tourbillonner la plaque, ce qui peut provoquer une accumulation de cellules au milieu des puits. Pour éviter de tourbillonner, basculez lentement la plaque à la main verticalement, puis horizontalement, puis placez doucement la plaque dans l’incubateur.
2. Le lendemain (quand les cellules atteignent 70-80% confluence), aspirez le milieu de culture, et ajoutez 1 mL/puits de PBS de haut-glucose complété avec 1% IFCS. Laisser la plaque dans la hotte de culture cellulaire jusqu’à ce que l’étape 3.3 soit terminée.
3. Diluer le virus en série dans des tubes de polypropylène de 5 mL à l’aide de PBS/IFCS à 1 %(figure 3).
   NOTA : Utiliser la partie aliquote de 50 μL recueillie à l’étape 2.6.4 pour la dilution en série. Dans le^1er tube (dilution 10-3), ajouter 2 μL du virus en 1998 μL de PBS/1 % IFCS, vortex. Dans le 2^ième tube (dilution 10-5), prendre 10 μL du 1er tube dans 990 μL de PBS/1% IFCS, vortex. Dans le^3ème tube (dilution 10-6), prendre 100 μL du 2^ème tube dans 900 μL de PBS/1% IFCS, vortex; poursuivre cette dilution sérielle 10 fois jusqu’à une dilution de 10^{à 9.} Voir les détails dans Figure 3.
4. Aspirer pbs/1% IFCS, et ajouter 0,7 mL/puits du virus dilué en série (à partir de^10-5 à 10-9) aux cellules vero.
   REMARQUE: Ne laissez pas les cellules sécher.
5. Balancer doucement la plaque sur une bascule pendant 5 min à température ambiante (pour assurer une distribution homogène de l’inoculum du virus).
6. Incuber la plaque pendant 1,5 h à 37 °C.
   REMARQUE: Pendant cette période d’incubation, préparer une dilution de 1:1000 de l’immunoglobuline humaine G (IgG) dans le DMEM complété par un IFCS à 1%. Pour une plaque de 6 puits, préparer 12,5 mL de sorte que 2 mL/puits puissent être utilisés à l’étape 3.7. Ajuster la dilution pour tenir compte des variations de lot dans les IgG humaines.
7. Retirer l’inoculum du virus des puits et ajouter 2 mL/puits d’IgG humaine à 0,1 % (pour neutraliser l’oHSV dans le milieu de culture et prévenir la formation de plaques secondaires) dans du DMEM complété par 1 % d’IFCS. Incuber la plaque à 37 °C pendant 3-4 jours.
   REMARQUE: Les plaques claires se forment généralement en 3 jours.
8. Plaques de fixation et de coloration
   1. Retirez le surnageant et fixez les cellules dans du méthanol pur (1 mL/puits) pendant 5 min. Retirez le méthanol et laissez les plaques sécher à l’air.
   2. Diluer la tache de Giemsa (1:5) avec de l’eau désionisée et ajouter 1 mL de la tache de Giemsa diluée par puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10-15 min.
   3. Enlevez la tache, rincez à l’eau du robinet et laissez les plaques sécher à l’air.
   4. Comptez les plaques à l’aide d’un microscope à dissection.
   5. Facultatif pour les vHS o avec expression lacZ :
      1. Retirez le surnageant et fixez les cellules avec du glutaraldéhyde à 0,2% froid / 2% de paraformaldéhyde pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.
      2. Retirez la solution fixatrice et lavez les cellules 3x avec du PBS.
      3. Ajouter une solution X-gal aux cellules (1 mL/puits) et incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h.
         REMARQUE: La tache X-gal doit être préparée fraîchement le jour de la coloration; le stockage à long terme peut entraîner une décoloration de la couleur. Voir la préparation de la solution X-gal dans le tableau 1.
      4. Retirez la tache X-gal et lavez la plaque avec de l’eau du robinet pendant 1 min.
      5. Contre-coloration avec solution rouge neutre (1 mL/puits) pendant 2 min à température ambiante.
         NOTA: Voir préparation de la solution rouge neutre dans le tableau 1.
      6. Laver l’assiette avec de l’eau du robinet pendant 1 min; laisser sécher les plaques à l’air.
      7. Comptez les plaques bleues à l’aide d’un microscope à dissection (Figure 4).
9. Calculer le titre à l’aide de la formule (2)
   Titre en pfu/mL (unités formant plaque) = Nombre de plaques/0,7 mL facteur de dilution × (2)
   REMARQUE: Par exemple, si 25 plaques sont trouvées dans le puits de dilution^{10 -9,} le titre est de 25/0,7 × 10⁹ = 35,7 × 10⁹ = 3,57 × 10¹⁰ pfu/mL. Il s’agit du titre final oHSV des aliquotes préparées à l’étape 2.6.4.

Résultats

Un bref aperçu de l’ensemble du protocole est représenté à la figure 1,qui représente les étapes critiques impliquées dans la croissance, la purification et le titrage de l’oHSV. Les CPE dans les cellules Vero peuvent être détectées dès 4 h après l’infection par le VHS¹⁹. La figure 2 montre l’ŒP dans les cellules Vero à trois moments différents suivant l’infection par le VHSO. Le niveau du CPE augmente au fil du t...

Discussion

Le protocole commence par la croissance de l’oHSV dans les cellules Vero à faible passage. La confluence de la monocouche de cellules Vero devrait être d’environ 80% au moment de l’inoculation du virus, car les cellules envahies par la prolifération peuvent développer des structures fibreuses serrées qui peuvent réduire l’entrée de l’oHSV dans les cellules vero²⁰. Une fois que 90-100% CPE est observé, le surnageant de culture est retiré, les cellules sont récoltées, remises en...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL centrifuge tubes	Sigma	CLS3620
15 mL polypropylene centrifuge tubes	Falcon	352097
5 mL polypropylene tubes	Falcon	352063
50 mL polypropylene centrifuge tubes	Falcon	352098
6-well cell culture plates	Falcon	353046
Benzonase Nuclease	Sigma	E8263-25KU
Cell scraper	Fisher Scientific	179693
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	MT-10-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Corning	MT-21-031-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007003
Giemsa Stain	Sigma	G3032
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	50-262-23
Glycerol	Sigma	G5516
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	MT-21-021-CV
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline	Sigma	D4031
Human immune globulin	Gamastan	NDC 13533-335-12
Magnesium chloride	Fisher Chemical	M33-500
Media Sterilization filter, 250 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25E
Media Sterilization filter, 500 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25C
Neutral Red solution	Sigma	N4638
Paraformaldehyde	Fisher scientific	15710S
Plate rocker	Fisher	88861043
Potassium Ferricyanide	Sigma	P8131
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Sodium chloride	Fisher Chemical	S271-3
Sorvall ST 16R Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004381
Sorvall ST 21R Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75002446
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps	Fisher Scientific	02-681-371
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Syringe Filter, 0.45 PVDF	MilliporeSigma	SLHV033RS
Syringe Filter, 0.8 MCE	MilliporeSigma	SLAA033SS
Syringe filter, 5 µm PVDF	MilliporeSigma	SLSV025LS
T150 culture flask	Falcon	355001
Tris-HCl	MP Biomedicals LLC	816116
Ultrasonic water bath	Branson	CPX-952-116R
X-gal	Corning	46-101-RF