Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo manoscritto, descriviamo un semplice metodo di crescita, purificazione e titolazione del virus dell'herpes simplex oncolitico per uso preclinico.

Abstract

I virus oncolitici (OV), come il virus dell'herpes simplex oncolitico (oHSV), sono una strategia di trattamento in rapida crescita nel campo dell'immunoterapia oncologica. Gli OV, incluso l'oHSV, replicano selettivamente e uccidono le cellule tumorali (risparmiando cellule sane / normali) mentre inducono l'immunità antitumorale. A causa di queste proprietà uniche, le strategie di trattamento basate su oHSV sono sempre più utilizzate per il trattamento del cancro, preclinicamente e clinicamente, incluso il talimogene laherparevec (T-Vec) approvato dalla FDA. La crescita, la purificazione e la titolazione sono tre tecniche di laboratorio essenziali per qualsiasi VS, compresi gli OHSV, prima che possano essere utilizzati per studi sperimentali. In questo articolo viene descritto un semplice metodo passo-passo per amplificare l'oHSV nelle celle Vero. Man mano che gli oHSV si moltiplicano, producono un effetto citopatico (CPE) nelle cellule di Vero. Una volta che il 90-100% delle cellule infette mostra un CPE, vengono raccolte delicatamente, trattate con benzonasi e cloruro di magnesio (MgCl2),filtrate e sottoposte a purificazione utilizzando il metodo del gradiente di saccarosio. Dopo la purificazione, il numero di oHSV infettivi (designati come unità di formatura della placca o PFU) è determinato da un "saggio di placca" nelle cellule di Vero. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per preparare stock di oHSV ad alto titolo per studi in vitro sulla coltura cellulare e esperimenti su animali in vivo.

Introduzione

I virus oncolitici (UV) sono una forma emergente e unica di immunoterapia oncologica. I televisori replicano selettivamente nelle cellule tumorali e lenalisi (risparmiando cellule normali / sane)1 mentre inducono l'immunità antitumorale2. Il virus dell'herpes simplex oncolitico (oHSV) è uno dei virus più studiati tra tutti gli UV. È più lontano lungo la clinica, con Talimogene laherparepvec (T-VEC) che è il primo e unico OV a ricevere l'approvazione della FDA negli Stati Uniti per il trattamento del melanoma avanzato3. Oltre al T-VEC, molti altri OHSV geneticamente modificati sono in fase di test preclinicamente e clinicamente in diversi tipidi cancro 3,4,5,6,7,8. L'attuale biotecnologia avanzata del DNA ricombinante ha ulteriormente aumentato la fattibilità dell'ingegneria di nuovi oHSV codificanti per transgeni terapeutici3,5. Un efficiente sistema di propagazione, purificazione e determinazione del tintore oHSV è fondamentale prima che qualsiasi oHSV (di nuova sviluppo) possa essere testato per studi in vitro e in vivo. Questo documento descrive un semplice metodo passo-passo di crescita oHSV (nelle cellule vero), purificazione (con il metodo del gradiente di saccarosio) e titolazione (mediante un saggio di placca oHSV nelle cellule Vero)(Figura 1). Può essere facilmente adottato in qualsiasi ambiente di laboratorio biosicurezza di livello 2 (BSL2) per ottenere uno stock virale di alta qualità per studi preclinici.

Vero, una linea di cellule renali di scimmia verde africana, è la linea cellulare più comunemente usata per la propagazione oHSV9,10,11,12,13 poiché le cellule vero hanno una via di segnalazione dell'interferone antiviraledifettosa 14. Altre linee cellulari con stimolatore inattivato di geni interferoni (STING) possono essere utilizzate anche per la crescita oHSV12,13. Questo protocollo utilizza cellule Vero per la crescita oHSV e il test della placca. Dopo la propagazione, le cellule infettate da oHSV vengono raccolte, lisciviate e sottoposte a purificazione, in cui le cellule lisciviate vengono prima trattate con nucleasi benzonasi per degradare il DNA delle cellule ospiti, prevenire l'aggregazione acido-proteina nucleica e ridurre la viscosità del lisato cellulare. Poiché la corretta attivazione della benzonasi richiede spesso Mg2+,in questo protocollo 15 viene utilizzato1-2 mM MgCl2. I detriti delle cellule ospiti del llysato cellulare trattato con benzonasio vengono ulteriormente eliminati mediante filtrazione seriale prima della centrifugazione ad alta velocità del gradiente di saccarosio. Un cuscino viscoso per la soluzione di saccarosio al 25% aiuta a garantire un tasso più lento di migrazione del virus attraverso lo strato di saccarosio, lasciando componenti correlati alle cellule ospiti nel supernatante, migliorando così la purificazione e limitando la perdita di virus nel pellet16. L'oHSV purificato viene quindi titolato sulle cellule Vero e le placche virali vengono visualizzate da Giemsa chemacchia 17 o colorazione X-gal (per la codifica LacZ oHSV)18.

Protocollo

1) crescita oHSV

NOTA: Garantire l'approvazione del comitato istituzionale per la biosicurezza prima di lavorare con oHSV. Questo studio è stato condotto nell'ambito del protocollo IBC n. 18007 approvato. Mantenere le precauzioni BSL2: sbiancare tutte le pipette, le punte, i tubi e altri materiali che entrano in contatto con il virus. Spruzzare guanti con 70% di alcol isopropile prima che le mani lascino il cappuccio di coltura cellulare BSL2. Lavarsi sempre accuratamente le mani con acqua di sapone dopo aver lavorato con un virus.

  1. Il giorno -1, semina cellule Vero a basso passaggio in 20 T-150 cm2 fiasche ad una densità di 7-8 × 106 cellule / pallone nel normale mezzo cellulare Vero.
    NOTA: Vero medium viene preparato integrando il mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco con siero di vitello fetale inattivato al 10% (IFCS).
  2. Il giorno 0 (le cellule sono confluenti all'80-90% ), aggiungere l'inoculo oHSV sulle cellule di Vero.
    1. Preparazione dell'inoculo del virus
      1. Utilizzare una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01 (MOI può variare da 0,01 a 0,1 a seconda della capacità di replicazione del virus) per l'amplificazione del virus. Utilizzare la formula (1) per calcolare la quantità di virus (mL) per 20 contenitori.
        Quantità di virus (mL) per 20 fiasche = quantità di virus necessaria (pfu)/titolo di stock virale (pfu/mL)(1)
      2. Utilizzare la salina tamponata con fosfato (DPBS) ad alto glucosio di Dulbecco integrata con 1% di IFCS per preparare l'inoculo del virus (7 ml per pallone T-150 cm2, cioè ~ 140 mL per 20 mambi). Aggiungere la quantità richiesta di oHSV a 140 mL di soluzione IFCS ad alto glucosio DPBS/1%, vortice per 1 minuto e mantenere la miscela pronta per l'aggiunta alle cellule Vero.
    2. Lavare il T-150 cm2 fiasche 2x con DPBS ad alto glucosio integrato con 1% IFCS (10 mL/ lavaggio). Aspirare il DPBS/1% IFCS e aggiungere 7 ml di inoculo virale/T-150 cm2 pallone.
    3. Dondolare delicatamente i mazzi per 5 minuti utilizzando un rocker per la corretta distribuzione dell'inoculo sul monostrato Vero, quindi incubare i contenitori a 37 °C per 1,5-2 ore. Assicurarsi che lo scaffale dell'incubatore sia livellato.
    4. Rimuovere l'inoculo e aggiungere DMEM integrato con 1% IFCS (25 mL/pallone). Incubare i contenitori per 2-4 giorni.
  3. Controllare quotidianamente i contenitori per il 90-100% di CPE (vedere figura 2).
  4. Raccogli le cellule Vero infettate da oHSV.
    1. Raccogliere il supernatante di coltura (~20 mL) da ogni pallone (lasciare ~5 mL in ogni pallone) in tubi di centrifuga conica da 50 ml o contenitore di supporti.
    2. Utilizzare un raschietto per celle per raschiare delicatamente le cellule dal fondo dei contenitori.
      NOTA: Le cellule dovrebbero uscire rapidamente dai contenitori.
    3. Aggiungere ~15 mL del supernatante di coltura (raccolto nel passaggio 1.4.1) a ciascun pallone (che porta il volume di ~ 20 mL in ogni pallone, cioè 400 mL per 20 fiasche) e lavare delicatamente il fondo dei mazzi di lino alcune volte utilizzando un tubo sierologico sterile da 10 ml.
      NOTA: Non pipet vigorosamente. Cerca di mantenere intatte tutte le cellule.
    4. Raccogliere le cellule (+ mezzo) in tubi di centrifuga conica da 50 ml su ghiaccio (utilizzare 8 tubi per contenere 400 ml di cellule raccolte da 20 contenitori).
    5. Ruotare le cellule a 300 g per 10 min a 4 °C e aspirare il supernatante.
    6. Aggiungere 1,25 mL (50%) di Virus Buffer (VB) e 1,25 mL (50%) di coltura supernatante (raccolto nel passaggio 1.4.1) ad ogni tubo di centrifuga e sospendere accuratamente ogni pellet. Trasferire le celle risostillate da otto tubi di centrifuga da 50 ml a un tubo di centrifuga conica da 50 ml.
      NOTA: fare riferimento alla preparazione della soluzione VB nella tabella 1. Sterilizzare il filtro della soluzione VB utilizzando un filtro di sterilizzazione multimediale. Utilizzare 0,5 ml di VB + 0,5 mL di supernatante per pallone T-150 cm2 per la nuova sospensione, cioè per 20 mambi (20 mL), utilizzare 10 ml di VB e 10 ml di supernatante di coltura.
    7. Congelare le cellule ri-sospese utilizzando ghiaccio secco / 100% etanolo e conservare a -80 °C.

2) purificazione oHSV

  1. Snap-freeze (nel ghiaccio secco e 100% di etanolo)/scongelamento (in un bagno d'acqua calda a 37 °C) le cellule seguite da bagno d'acqua-sonicazione per 1 minuto per un totale di 3 cicli per garantire una corretta lisi delle cellule per rilasciare virus nel supernatante.
    NOTA: Eseguire la sonicazione per 1 minuto utilizzando 40 kHz, 120 V di potenza. Se non è disponibile un sonicatore tonnibile, utilizzare un sonicatore ad ultrasuoni per il bagno d'acqua. Prendere un'aliquota di 50 μL per la titolazione nella sezione 3, che aiuterà a identificare quale delle seguenti misure è responsabile di una potenziale perdita di virus durante la procedura di purificazione.
  2. Trattare il lisato cellulare con Benzonasi Nucleasi (175 unità/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M stock = 2 μL/mL), vortice e incubare per 30 min a 37 °C. Posizionare il tubo sul ghiaccio ed eseguire i seguenti passaggi a 4 °C.
  3. Pellettizzazione dei detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa velocità.
    1. Ruotare il lysate cellulare a 300 g per 10 min.
    2. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (sospendere di nuovo il pellet di cella in 0,5 ml di VB, designarlo come pellet-1 e conservare a 4 °C per l'uso nella fase 2.3.5; vedere figura 1).
    3. Ruotare nuovamente il supernatante (ottenuto nel passaggio 2.3.2) a 500 g per 10 min.
    4. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (sospendere di nuovo il pellet di cella in 0,5 ml di VB, designarlo come pellet-2 e conservare a 4 °C per l'uso nella fase 2.3.5; vedere figura 1).
    5. Unire il pellet-1 ri-sospeso (da 2.3.2) e pellet-2 (da 2.3.4) in un nuovo tubo di centrifuga da 1,7 ml, vortice / sonicato (bagno d'acqua) 2x e girare a 400 g per 10 minuti. Raccogliere il supernatante e combinarlo con il supernatante ottenuto al passaggio 2.3.4; cfr. figura 1).
      NOTA: Eseguire la sonicazione per 1 minuto utilizzando 40 kHz, potenza di 120 V per prevenire l'aggregazione virale prima della procedura di filtrazione nel passaggio 2.4. Prendere un'aliquota di 50 μL del supernatante combinato per la titolazione nella sezione 3.
  4. Filtrare il supernatante combinato (~21 mL, cioè 20 mL da 1.4.6, 0.5 mL da 2.3.2 e 0.5 mL da 2.3.4) utilizzando il seguente metodo di filtrazione in 3 passaggi.
    1. Esegnare 21 ml del supernatante utilizzando una siringa da 10 ml (5-7 ml ogni volta per un facile passaggio attraverso il filtro) e passarlo attraverso un filtro sterile a membrana in polivinilidene da 5 μm (PVDF) posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (etichettato come TUBE 1).
      1. Aggiungere 1 ml di VB a un tubo di centrifuga conico da 50 mL svuotato in 2.4.1 (per raccogliere la quantità residua di supernatante virus), vortice, e passare attraverso lo stesso filtro PVDF da 5 μm posto su TUBE 1 (portando il totale a 22 ml di filtrato). Procedere al passaggio 2.4.2.
    2. Estraere 22 ml del filtrato da TUBE 1 (come in 2.4.1) e passarlo attraverso un filtro sterile a membrana in cellulosa mista (MCE) da 0,8 μm posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (etichettato come TUBE 2).
      1. Aggiungere 1 mL di VB a TUBE 1 svuotato nel passaggio 2.4.2, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro MCE da 0,8 μm posto su TUBE 2 (portando il totale a 23 ml di filtrato). Procedere al passaggio 2.4.3.
    3. Esegnare 23 ml di filtrato da TUBE 2 (come in 2.4.1) e passarlo attraverso un filtro PVDF sterile da 0,45 μm posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 mL (etichettato come TUBE 3).
      1. Aggiungere 1 ml di VB a TUBE 2 svuotato nel passaggio 2.4.3, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro PVDF da 0,45 μm posto su TUBE 3 (portando il totale a 24 ml di filtrato).
        NOTA: Prendere un'aliquota di 50 μL del filtrato per la titolazione nella sezione 3.
  5. Centrifugazione ad alta velocità con il metodo del gradiente di saccarosio
    NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato un rotore ad angolo fisso F13-14x50cy. Sia il rotore che la centrifuga devono essere a 4 °C prima di procedere con i seguenti passaggi.
    1. Aggiungere 10 ml di una soluzione di saccarosio al 25% ghiacciata e filtrata sterile (preparata sciogliendo 25 g di polvere di saccarosio in 100 ml di soluzione salina bilanciata di Hank) in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml.
    2. Lentamente (3 mL/min) aggiungere 24 mL del filtrato virale (ottenuto dal gradino 2.4.3.1) sopra lo strato di saccarosio. Fare attenzione a mantenere strati separati del filtrato del virus e della soluzione di saccarosio.
      NOTA: Fino a 30 mL dello strato virale possono essere aggiunti oltre 10 mL della soluzione di saccarosio.
    3. Centrifugare il tubo per 90 min a 22.620 g a 4 °C.
    4. Rimuovere il supernatante e lo strato di saccarosio dal tubo di centrifuga conica da 50 ml.
      NOTA: Il pellet del virus deve essere biancastro. Prendere un'aliquota di 50 μL del supernatante e un'aliquota di 50 μL dello strato di saccarosio per la titolazione nella sezione 3.
  6. Sospendere di nuovo il pellet in soluzione di glicerolo/PBS al 10%.
    1. Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile al 10% (diluito in PBS) al tubo di centrifuga conica da 50 ml per coprire il pellet.
      NOTA: La quantità della miscela ri-sospesa può variare (come 0,8-1,2 mL) a seconda delle dimensioni del pellet. Un volume minore darebbe una maggiore concentrazione di virus.
    2. Posizionare il tubo di centrifuga conica da 50 ml sul ghiaccio per 2-4 ore. Durante questo periodo, sonicare /vortice il pellet ogni 15 minuti per 30 s per aiutare a spodestare / sospendere il pellet.
    3. Raccogliere il pellet ri-sospeso (1 ml di glicerolo/PBS + la dimensione del pellet porterà il volume totale a ~ 1,3 ml) in un tubo di microcentrifugo da 2 ml. [Facoltativo: aggiungere altri 0,3 ml di glicerolo/PBS al 10% di glicerolo/PBS allo stesso tubo di centrifuga conico da 50 mL per raccogliere la quantità di traccia rimanente del pellet, pipetta su e giù e combinare con il pellet ri-sospeso nel passaggio 2.6.3 per portare il volume totale a ~1,6 mL.]
      1. Se la sospensione nel passaggio 2.6.3 è torbida o torbida (a causa di detriti cellulari), centrifugare il tubo a 500 g per 10 minuti, trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo da 2 ml e procedere al passaggio 2.6.4.
    4. Prendere un'aliquota di 50 μL per la titolazione oHSV nella sezione 3. Aliquotare il resto della soluzione (250 μL/aliquota) in tubi sterili a microcentrifugo con tappi a vite (ben sigillati per lo stoccaggio a lungo termine), congelare a scatto e conservare a -80 °C fino all'uso (pronto per studi sperimentali una volta determinato il titolo oHSV).
      NOTA: Tutti i materiali che entrano in contatto con il virus devono essere sbiancati o trattati con radiazioni ultraviolette prima di essere rimosso dalla cappa o dallo smaltimento.

3. titolazione oHSV e dosaggio della placca

  1. Seme 1,7-1,8 x 105 cellule Vero/pozzo in una piastra di coltura cellulare a 6 porri nel mezzo cellulare Vero (DMEM con 10% IFCS; vedere fase 1.1).
    NOTA: Assicurarsi che le cellule siano distribuite in modo omogeneo in tutto il pozzo; non ruotare la piastra, che può causare accumulo di cellule nel mezzo dei pozzi. Per evitare vorticosi, scuotere lentamente la piastra a mano verticalmente, quindi orizzontalmente, quindi posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore.
  2. Il giorno successivo (quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza), aspirano il mezzo di coltura e aggiungono 1 mL / pozzo di PBS ad alto glucosio integrato con 1% IFCS. Lasciare la piastra nella cappa di coltura cellulare fino al completamento del passaggio 3.3.
  3. Diluire serialmente il virus in tubi in polipropilene da 5 ml utilizzando PBS/1% IFCS (Figura 3).
    NOTA: Utilizzare l'aliquota di 50 μL raccolta nel passaggio 2.6.4 per la diluizione seriale. Nel tubo 1st (diluizione10-3), aggiungere 2 μL del virus nel 1998 μL di PBS/1%IFCS, vortice. Nel secondo tubo(diluizione 10-5), prendere 10 μL dal tubo 1st in 990 μL di PBS/1% IFCS, vortice. Nel tubo 3rd (10-6 diluizione), prendere 100 μL dal 2° tubo in 900 μL di PBS/1% IFCS, vortice; continuare questa diluizione seriale di 10 volte fino alladiluizione 10-9. Vedere i dettagli nella figura 3.
  4. Aspirare PBS/1% IFCS e aggiungere 0,7 mL/pozza del virus diluito serialmente (a partire da 10-5 a 10-9) alle cellule Vero.
    NOTA: Non lasciare asciugare le cellule.
  5. Dondolare delicatamente la piastra su un rocker per 5 minuti a temperatura ambiente (per garantire una distribuzione omogenea dell'inoculo del virus).
  6. Incubare la piastra per 1,5 ore a 37 °C.
    NOTA: Durante questo periodo di incubazione, preparare la diluizione 1:1000 dell'immunoglobulina umana G (IgG) in DMEM integrata con 1% IFCS. Per una piastra a 6 po porsi, preparare 12,5 mL in modo che 2 mL / pozzo possano essere utilizzati nel passaggio 3.7. Regolare la diluizione per tenere conto delle variazioni di lotto nell'IgG umano.
  7. Rimuovere l'inoculo virale dai pozzi e aggiungere 2 mL/pozzo dello 0,1% di IgG umano (per neutralizzare l'oHSV nel terreno di coltura e prevenire la formazione di placche secondarie) in DMEM integrato con 1% IFCS. Incubare la piastra a 37 °C per 3-4 giorni.
    NOTA: Le placche chiare di solito si formano in 3 giorni.
  8. Piastre di fissaggio e colorazione
    1. Rimuovere il supernatante e fissare le cellule in metanolo puro (1 mL / pozzo) per 5 minuti. Rimuovere il metanolo e lasciare asciugare le piastre all'aria.
    2. Diluire la macchia di Giemsa (1:5) con acqua deionizzata e aggiungere 1 mL della macchia diluita di Giemsa per pozzo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
    3. Rimuovere la macchia, risciacquare con acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria le piastre.
    4. Contare le placche usando un microscopio sezionato.
    5. Facoltativo per oHSV con espressione lacZ:
      1. Rimuovere il supernatante e fissare le cellule con glutaraldeide fredda dello 0,2% /2% di paraformaldeide per 5-10 min a temperatura ambiente.
      2. Rimuovere la soluzione fissante e lavare le celle 3 volte con PBS.
      3. Aggiungere la soluzione X-gal alle cellule (1 mL/pozzo) e incubare la piastra a 37 °C per 2 ore.
        NOTA: La macchia X-gal deve essere preparata appena il giorno della colorazione; conservazione a lungo termine potrebbe portare allo sbiadimento del colore. Vedere la preparazione della soluzione X-gal nella tabella 1.
      4. Rimuovere la macchia X-gal e lavare la piastra con acqua del rubinetto per 1 minuto.
      5. Contro-macchia con soluzione Neutra Rossa (1 mL/pozzo) per 2 min a temperatura ambiente.
        NOTA: Vedere preparazione della soluzione rossa neutra nella tabella 1.
      6. Lavare il piatto con acqua del rubinetto per 1 minuto; lasciare asciugare le piastre all'aria.
      7. Contare le placche blu utilizzando un microscopio sezionato (Figura 4).
  9. Calcolare il carattere utilizzando la formula (2)
    Timone in pfu/mL (unità di formatura della placca) = Numero di placche/0,7 mL × fattore di diluizione (2)
    NOTA: Ad esempio, se 25 placche si trovano nel pozzo didiluizione 10 -9, il titolo è 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Questo è il giacimento finale di aliquote oHSV preparato nella fase 2.6.4.

Risultati

Una breve panoramica dell'intero protocollo è illustrata nella figura 1, che rappresenta i passaggi critici coinvolti nella crescita, purificazione e titolazione di oHSV. Cpe nelle cellule vero può essere rilevato già 4 h infezione post-HSV19. La figura 2 mostra cpe nelle cellule Vero in tre diversi punti di tempo a seguito dell'infezione da oHSV. Il livello del CPE è aumentato nel tempo. In questo protocollo, il 90-100% cpe è solita...

Discussione

Il protocollo inizia con la crescita di oHSV nelle cellule vero a basso passaggio. La confluenza del monostrato a cellule Vero dovrebbe essere ~80% al momento dell'inoculazione del virus in quanto le cellule invase possono sviluppare strutture fibrose strette che possono ridurre l'ingresso di oHSV nelle cellule Vero20. Una volta osservato il 90-100% cpe, il supernatante della coltura viene rimosso, le cellule vengono raccolte, rimescolate in VB /supernatante (vedi passaggio 1.4.6), congelate a sca...

Divulgazioni

SDR è co-inventore di brevetti relativi a virus simplex dell'herpes oncolytic, di proprietà e gestito dalla Georgetown University e dal Massachusetts General Hospital, che hanno ricevuto royalties da Amgen e ActiVec Inc. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

La ricerca nel laboratorio saha è stata supportata in parte da fondi del DIPARTIMENTO (W81XWH-20-1-0702) e della Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey erano parzialmente supportati da NIH (R01 CA160762).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL centrifuge tubesSigmaCLS3620
15 mL polypropylene centrifuge tubesFalcon352097
5 mL polypropylene tubesFalcon352063
50 mL polypropylene centrifuge tubesFalcon352098
6-well cell culture platesFalcon353046
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KU
Cell scraperFisher Scientific179693
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorningMT-10-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineCorningMT-21-031-CV
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007003
Giemsa StainSigmaG3032
GlutaraldehydeFisher Scientific50-262-23
GlycerolSigmaG5516
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)CorningMT-21-021-CV
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered SalineSigmaD4031
Human immune globulinGamastanNDC 13533-335-12
Magnesium chlorideFisher ChemicalM33-500
Media Sterilization filter, 250 mLNalgene, Fisher Scientific09-740-25E
Media Sterilization filter, 500 mLNalgene, Fisher Scientific09-740-25C
Neutral Red solutionSigmaN4638
ParaformaldehydeFisher scientific 15710S
Plate rockerFisher88861043
Potassium FerricyanideSigmaP8131
Potassium FerrocyanideSigmaP9387
Sodium chlorideFisher ChemicalS271-3
Sorvall ST 16R CentrifugeThermoFisher Scientific75004381
Sorvall ST 21R CentrifugeThermoFisher Scientific75002446
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw CapsFisher Scientific02-681-371
SucroseFisher ScientificBP220-1
Syringe Filter, 0.45 PVDFMilliporeSigmaSLHV033RS
Syringe Filter, 0.8 MCEMilliporeSigmaSLAA033SS
Syringe filter, 5 µm PVDFMilliporeSigmaSLSV025LS
T150 culture flaskFalcon355001
Tris-HClMP Biomedicals LLC816116
Ultrasonic water bathBransonCPX-952-116R
X-galCorning46-101-RF

Riferimenti

  1. Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
  2. Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
  3. Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
  4. Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
  5. Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
  6. Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
  7. Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
  8. Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
  9. Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
  10. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
  11. Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
  12. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
  13. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
  14. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
  15. Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
  16. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  17. Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
  18. Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
  19. Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
  20. Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
  21. Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
  22. Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
  23. Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
  24. Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
  25. Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
  26. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
  27. Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
  30. Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Immunologia e infezioneNumero 171Virus oncoliticoeffetto citopaticoHSVcrescita del viruspurificazione del virusmetodo del gradiente di saccarosiosaggio della placca

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati