Normalisation et maintenance des cultures organoïdes hépatiques et intestinales canines 3D pour une utilisation dans la recherche biomédicale

Résumé

Des méthodes expérimentales de prélèvement de cellules souches adultes dans des tissus intestinaux et hépatiques canins afin d’établir des cultures organoïdes 3D sont décrites. En outre, les techniques de laboratoire permettant d’assurer une croissance constante et de fournir des procédures opérationnelles normalisées pour prélever, biobanquer et raviver les cultures organoïdes intestinales et hépatiques canines sont discutées.

Résumé

Les chiens développent des maladies multifactorielles complexes analogues aux humains, y compris les maladies inflammatoires, les maladies métaboliques et le cancer. Par conséquent, ils représentent de grands modèles animaux pertinents avec le potentiel translationnel de la médecine humaine. Les organoïdes sont des structures auto-assemblées en 3 dimensions (3D) dérivées de cellules souches qui imitent la microanatomie et la physiologie de leur organe d’origine. Ces modèles translationnels in vitro peuvent être utilisés pour des applications de perméabilité et de découverte de médicaments, l’évaluation toxicologique et pour fournir une compréhension mécaniste de la physiopathologie des maladies chroniques multifactorielles. En outre, les organoïdes canins peuvent améliorer la vie des chiens de compagnie, en fournissant des informations dans divers domaines de la recherche vétérinaire et en facilitant les applications de traitement personnalisé en médecine vétérinaire. Un petit groupe de donneurs peut créer une biobanque d’échantillons organoïdes, réduisant ainsi le besoin de prélèvement continu de tissus, car les lignées cellulaires organoïdes peuvent être sous-cultivées indéfiniment. Ici, trois protocoles axés sur la culture d’organoïdes canins intestinaux et hépatiques dérivés de cellules souches adultes sont présentés. Le canine Organoid Isolation Protocol décrit les méthodes de traitement des tissus et l’incorporation de l’isolat cellulaire dans une matrice de soutien (matrice membranaire extracellulaire solubilisée). Le protocole d’entretien des organoïdes canins décrit la croissance et l’entretien des organoïdes, y compris le nettoyage et le passage ainsi que le moment approprié pour l’expansion. Le protocole de prélèvement d’organoïdes et de biobanque décrit les moyens d’extraire, de congeler et de conserver les organoïdes pour une analyse plus approfondie.

Introduction

Les rongeurs sont le modèle animal le plus couramment utilisé pour la recherche biomédicale et ^{translationnelle1}. Ils sont exceptionnellement utiles pour étudier la pathogenèse moléculaire de base des maladies, bien que leur pertinence clinique pour les maladies multifactorielles chroniques ait récemment été remise en ^question2. Le modèle canin présente plusieurs avantages par rapport aux ^rongeurs3,4. Les chiens et les humains partagent des similitudes dans la métabolomique et le microbiome intestinal qui se sont développées en raison de la consommation de l’alimentation humaine à diverses périodes de leur domestication5,6,7. Les similitudes entre l’anatomie et la physiologie gastro-intestinales canines et humaines en sont un autre ^exemple8.

De plus, les chiens partagent souvent des environnements et des modes de vie similaires avec leurs ^{propriétaires9}. La durée de vie plus longue des chiens par rapport aux rongeurs permet le développement naturel de nombreuses maladies ^chroniques10. Les maladies inflammatoires de l’intestin ou syndrome métabolique sont des exemples de maladies chroniques multifactorielles qui partagent des similitudes importantes entre les humains et les ^chiens11,12. Les essais précliniques canins impliquant des chiens atteints de maladies naturelles peuvent générer des données plus fiables que celles obtenues à partir de modèles de ^rongeurs13. Cependant, pour minimiser l’utilisation de la recherche sur les animaux vivants et se conformer aux principes des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer)¹⁴, des alternatives aux tests in vivo utilisant des organoïdes canins in vitro 3D ont ^émergé15.

Les organoïdes sont des structures auto-assemblées dérivées de cellules souches 3D qui récapitulent la physiologie et la microanatomie de leurs organes ^{d’origine16,17}. Cette technologie a été décrite pour la première fois par Sato et al. en 200917 et a permis plus d’études in vitro traduisibles dans des lignées cellulaires épithéliales qu’auparavant possibles avec des cultures de cellules cancéreuses 2D18,19,20. Les organoïdes sont des modèles in vitro utiles dans de nombreuses disciplines biomédicales telles que les études toxicologiques précliniques21,22,23, d’absorption ou de ^{métabolisme24,25,26,27,28}, ainsi que dans les approches médicales personnalisées29,30,31 . La culture réussie d’organoïdes intestinaux canins a été décrite pour la première fois en ²⁰¹⁹¹², tandis que des organoïdes hépatiques dérivés d’un chien ont été signalés pour la première fois par Nantasanti et al. en 201532. Les organoïdes canins ont depuis été utilisés avec succès dans des études portant sur les entéropathies chroniques canines, les tumeurs stromales gastro-intestinales, l’adénocarcinome ^colorectal12 et la maladie de ^Wilson33,34.

Alors que les cellules souches adultes peuvent être prélevées par nécropsies, la technologie organoïde ne nécessite pas toujours le sacrifice des animaux. Les biopsies endoscopiques et laparoscopiques, ou même les aspirations à l’aiguille fine ^{d’organes35}, sont une source viable de cellules souches adultes pour l’isolement organoïde épithélial12. L’utilisation généralisée de ces techniques non invasives dans la pratique vétérinaire facilite les options de recherche translationnelle inverse (traduction de l’information de la pratique clinique vétérinaire à la pratique clinique humaine et vice versa)¹⁵. Les progrès de la technologie organoïde peuvent être assurés par la normalisation des méthodes de culture et de maintenance organoïdes. Le protocole organoïde présenté ici est partiellement basé sur les travaux précédemment publiés de Saxena et al. de ²⁰¹⁵³⁶, et les méthodes ont été adaptées pour s’adapter aux spécificités de la culture organoïde intestinale et hépatique canine. Le flux de travail global des protocoles organoïdes canins est illustré à la figure 1.

Le protocole d’isolement organoïde canin introduit des méthodes d’obtention d’échantillons à partir de biopsies endoscopiques, laparoscopiques et chirurgicales, ainsi que de nécropsies. Il décrit le prétraitement initial des échantillons de tissus et les méthodologies utilisées pour le transport vers le laboratoire. Les matériaux et les réactifs nécessaires à l’isolation organoïde sont résumés dans la section « Préparation à l’isolement ». Le processus d’isolement des cellules souches adultes à partir d’échantillons de tissus est décrit plus en détail. Enfin, le processus de placage des organoïdes dans des structures en forme de dôme à l’aide d’une matrice membranaire extracellulaire solubilisée est discuté.

Le deuxième protocole, Canine Organoid Maintenance Protocol, décrit les méthodes de documentation et de culture des organoïdes. Les changements de médias et leur fréquence sont abordés dans cette section. En outre, les procédures de laboratoire telles que le passage et le nettoyage des cultures cellulaires, qui sont essentielles pour assurer le maintien réussi des organoïdes canins 3D, sont décrites. Le passage approprié est une étape critique du protocole, et les ajustements et le dépannage possibles de cette étape sont discutés plus en détail dans le manuscrit.

Le dernier protocole est le protocole de prélèvement d’organoïdes canins et de biobanque contenant des méthodes de préparation d’organoïdes adultes pour l’incorporation de paraffine et la préservation de l’ARN. Les méthodes de biobanque d’échantillons organoïdes dans le stockage d’azote liquide sont également décrites ici. Enfin, les moyens de décongeler les échantillons congelés et de soutenir leur croissance sont discutés.

En conclusion, cet article vise à fournir des procédures cohérentes de culture organoïde canine grâce à la normalisation des protocoles inter-laboratoires. Ce faisant, le manuscrit vise à faciliter la reproductibilité des données dérivées de modèles organoïdes canins afin d’accroître leur pertinence dans la recherche biomédicale translationnelle.

Figure 1 : Flux de travail des protocoles organoïdes canins. Le protocole d’isolement organoïde canin décrit la préparation du matériel nécessaire à l’isolement organoïde, le prélèvement d’un échantillon de tissu (au moyen de nécropsies, de biopsies endoscopiques, laparoscopiques et chirurgicales) et des conseils sur la dissociation cellulaire et le placage de la population cellulaire. Le protocole d’entretien des organoïdes canins traite du nettoyage et du passage de la culture organoïde. Le protocole de prélèvement d’organoïdes et de biobanque traite de la préparation d’échantillons organoïdes pour l’incorporation de paraffine et la caractérisation plus poussée des organoïdes. Les méthodes permettant de biobanquer les cultures organoïdes et de les faire revivre du stockage dans de l’azote liquide sont également discutées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

La recherche a été approuvée et réalisée conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de l’Iowa (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).

REMARQUE : La section suivante (étapes 1 à 3) décrit le protocole d’isolement des organoïdes canins.

1. Préparation à l’isolement

1. Tubes de transport : Avant l’isolement organoïde (généralement 24 h avant), remplissez un tube conique de 50 mL avec 10 mL de mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) de Dulbecco enrichi de 0,2 mL de Strep Pen.
2. Pour les biopsies laparoscopiques, incisionnelles ou excisionnelles, préparez trois tubes coniques supplémentaires de 50 mL. Remplir ces tubes avec 10 mL de solution chélatante complète (1x CCS; voir tableau 1).
   REMARQUE: Pour l’étape 1.2, 2 mM de N-acétylcystéine (NAC) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) peuvent également être utilisés comme solution traditionnelle utilisée pour la récolte de cellules souches. Aucune différence n’a été observée lors de l’utilisation de 1x CCS ou NAC dans PBS. Les deux solutions sont ajoutées pour libérer des cellules dans la solution.
3. Gardez les tubes à 4 °C pendant la nuit et transportez les tubes sur de la glace pour le reste du protocole.
4. Préparer cinq tubes centrifuges de 15 mL avec 5 mL de 1x CCS, un tube centrifuge de 15 mL avec 3 mL de 1x CCS, un tube centrifuge vide de 15 mL (tube surnageant) et un tube centrifuge de 15 mL avec 5 mL de 1x CCS et 2 mL de sérum fœtal bovin (FBS).
   REMARQUE: Ce qui précède peut être préparé avant le jour de l’isolement si plusieurs échantillons sont traités. Pour l’illustration, voir la disposition du tube d’isolation à la figure 2.
5. Le jour de l’isolement, préparez une boîte de Pétri, un scalpel, un seau à glace et un DMEM/F12 avancé froid dans l’armoire de biosécurité. Placer le nombre requis de plaques de culture cellulaire de 24 puits dans l’incubateur (37 °C; 5 % d’atmosphère de _CO2 ) à préchauffer.
6. Placer la matrice de membrane extracellulaire solubilisée (ECM; voir Tableau des matériaux) sur la glace pour commencer à décongeler.
   REMARQUE: L’immersion dans la glace protège contre la décongélation rapide et aide à éviter la solidification. Une boîte d’embouts de pipette peut être placée dans le congélateur pour aider à plaquer l’ECM solubilisé.
7. Précérez une centrifugeuse à 4 °C.
8. Déplacer le milieu complet avec des facteurs de croissance « CMGF+ » ou « milieu organoïde » (voir le tableau 1 pour la composition) du congélateur/réfrigérateur à un bain-marie à 37 °C. Évitez l’exposition directe à la lumière lorsque cela est possible.

Figure 2 : Disposition du tube d’isolement. La configuration recommandée pour la récolte de tissus comprend 10 mL de DMEM/F12 avancé et 0,2 mL de streptocoque dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. De plus, trois tubes de 50 mL remplis de 10 mL de 1x CCS sont nécessaires pour les biopsies chirurgicales ou les nécropsies. La disposition recommandée des tubes pour les étapes d’isolation comprend cinq tubes contenant 5 mL de 1x CCS à utiliser pendant les étapes de lavage CCS. Le premier tube est utilisé comme tube d’échantillonnage contenant le tissu haché, et les tubes restants servent de réservoirs de 1x CCS à ajouter au premier tube. Le sixième tube contient 3 mL de 1x CCS pour rincer le tissu restant du tube d’échantillon lors du transfert sur une plaque de 6 puits. Ces six tubes seront utilisés avant l’étape d’incubation de l’EDTA. Un tube avec 5 mL de 1x CCS et 2 mL de FBS sert de tube d’échantillonnage après l’incubation de l’EDTA, et le surnageant de ce tube est transféré avec des cellules souches dans un tube vide pour le reste de l’isolement. Maintenir les tubes à 4 °C avant de commencer l’isolement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Prélèvement de tissus

1. Les biopsies endoscopiques intestinales et laparoscopiques (diamètre 2,8 mm) peuvent être acquises à l’aide de grandes pinces à biopsie. Prélever au moins huit échantillons endoscopiques par site intestinal.
2. Prélever les échantillons directement dans les tubes de transport et les placer sur la glace.
3. Pour les biopsies chirurgicales et les nécropsies, prélevez des morceaux de tissu d’une taille de 0,5 cm x 0,5 cm et placez-les dans le premier tube CCS 1x.
   REMARQUE: Pour les biopsies intestinales, enlevez tout contenu intestinal restant et grattez la couche muqueuse avec un scalpel pour enlever les villosités. Si les échantillons sont abondants, des biopsies supplémentaires peuvent être prélevées dans des cryoviales contenant un réactif de stockage de l’ARN (1 mL) ou incorporés à la paraffine pour une comparaison future entre les organoïdes et leur tissu d’origine. Dans le cas de biopsies pour l’analyse TEM, ne pas gratter les villosités et stocker l’échantillon dans un agent de conservation (3 % de paraformaldéhyde et 3 % de glutaraldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) et conserver à 4 °C.
4. Secouez vigoureusement le tube 1x CCS pendant environ 30 s, puis transférez l’échantillon dans un nouveau tube CCS 1x à l’aide d’une pince. Répétez ce processus deux fois.
5. Transférer l’échantillon du dernier tube CCS 1x dans le tube de transport (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) et ramener l’échantillon au laboratoire.
   REMARQUE: Les échantillons prétraités de cette façon peuvent également être expédiés pendant la nuit sur la glace (ne pas expédier sur la glace sèche).

3. Isolation organoïde

REMARQUE: Effectuez l’isolation à l’aide de techniques aseptiques dans une armoire de biosécurité. Voir la figure 3 pour le flux de travail d’isolement organoïde canin.

1. Agiter l’échantillon de tissu dans le tube de transport pendant environ 30 s et enlever l’excès de surnageant jusqu’à ce qu’il reste 0,5 mL dans le tube par pipetage lent près de la surface du fluide. Assurez-vous de ne pas jeter de tissu.
2. Transférer le tissu et le surnageant restant dans une boîte de Petri stérile. À l’aide d’un scalpel jetable (ou de pinces et de ciseaux stérilisés), coupez et hachez le tissu en plus petits morceaux (taille de 1 ^mm2) ressemblant à une consistance de purée pendant environ 5 min.
3. Pipet le tissu haché avec du liquide de la boîte de Petri au premier tube CCS. Ajouter 2 mL de DMEM/F12 avancé à la boîte de Pétri, rincer le tissu restant et transférer dans le premier tube CCS.
4. Vortex le tube CCS 1x pendant 5 s environ cinq fois. Laissez les biopsies se déposer au fond du tube de 15 mL (environ 1 min) et retirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 5 mL dans le tube. Transférez le 1x CCS du nouveau tube vers le tube d’échantillonnage.
5. Répétez l’étape précédente pour les deux tubes suivants. Lors des deux derniers lavages, retirez le surnageant jusqu’à 3 mL restant dans le tube.
6. Transférer les biopsies et 1x CCS du tube d’échantillonnage vers un puits d’une plaque de 6 puits. Ensuite, ajoutez 3 mL de 1x CCS au tube d’échantillonnage, faites tourbillonner doucement pour recueillir tout tissu restant et transférez-le dans le même puits de la plaque.
7. Ajouter 150 μL de 0,5 M d’EDTA (pour obtenir un volume total de 6,15 mL dans un puits). Placez la plaque à 6 puits sur un mélangeur/bascule à 20 °C et 24 tr/min à 20 °C. Incuber les échantillons de foie pendant 10 min et les échantillons intestinaux pendant 1 h sur la bascule en mouvement.
8. Transportez la plaque de 6 puits jusqu’à l’armoire de biosécurité. Transférer le tissu haché et le liquide dans un tube CCS/FBS 1x et laisser les tissus se déposer. Transporter le surnageant (cette portion comprend maintenant des cellules souches libres) et environ 0,2 mL de la partie supérieure du tissu vers le tube vide.
9. Faire tourner le tube contenant l’échantillon (700 x g pendant 5 min à 4 °C). Les cellules souches sont maintenant entassées avec le tissu haché. Retirez et jetez soigneusement le surnageant pour ne pas déranger la pastille.
10. Remettre la pastille en Advanced DMEM/F12 et faire tourner à nouveau le tube (700 x g pendant 5 min à 4 °C). Aspirez le surnageant et ne dérangez pas la pastille.
11. Calculer le volume d’ECM solubilisé nécessaire à l’ensemencement des cellules et tissus dissociés. Utilisez 30 μL d’ECM solubilisé par puits d’une plaque de 24 puits pour obtenir une densité d’ensemencement appropriée.
    REMARQUE : Incorporer un échantillon après l’isolement dans 4 à 6 puits d’une plaque de 24 puits (c.-à-d. en fonction de la quantité de tissu haché dans l’échantillon).
12. Ajouter le volume calculé d’ECM solubilisé au tube d’échantillonnage et pipeter lentement de haut en bas pour éviter la formation de bulles. Ensemencez la suspension au milieu des puits afin que l’ECM solubilisé puisse former une structure en forme de dôme.
    REMARQUE: L’utilisation d’embouts de pipette provenant d’un congélateur à -20 ° C aide à plaquer l’ECM solubilisé. Si les morceaux de tissu sont plus gros que la pointe de la pipette P200, utilisez de larges pointes froides ou coupez des pointes froides P1000 pour faciliter le placage. Conservez l’échantillon avec l’ECM solubilisé sur la glace dans la mesure du possible.
13. Transportez la plaque dans un incubateur (37 °C; 5% d’atmosphère de _CO2 ) et laissez l’ECM solubilisé se solidifier pendant environ 30 min.
14. Mélanger l’inhibiteur de ROCK et le GSK3β dans le CMGF+ (concentrations dans le tableau 1). Ajouter 500 μL de cette solution (CMGF+ R/G) à chaque puits. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C; 5 % d’atmosphère de _CO2 ).

Figure 3 : Flux de travail d’isolement organoïde canin. L’échantillon de tissu récolté est transféré dans une boîte de Pétri et haché correctement. L’échantillon est ensuite transféré dans un tube CCS 1x et des étapes de lavage sont effectuées. Pour l’incubation de l’EDTA dans une plaque à 6 puits, l’échantillon est ensuite transféré dans un tube contenant 1x CCS et FBS. Une fois que le tissu s’est déposé, le surnageant avec une petite quantité de tissu est transféré dans un tube vide. L’échantillon est donc filé, le surnageant est retiré et la pastille est remise en suspension en Advanced DMEM/F12. Le tube est tourné à nouveau et le surnageant est aspiré et jeté. L’ECM solubilisé est ajouté au tube, mélangé, et l’échantillon est plaqué dans une plaque de 24 puits. La plaque est ensuite incubée (37 °C ; 5 % de _CO2 sous atmosphère) pendant 30 min, puis du milieu est ajouté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

REMARQUE : La section suivante (étapes 4 et 5) décrit le protocole d’entretien des organoïdes canins. Changez de support selon le tableau 2 et vérifiez quotidiennement les organoïdes pour détecter tout signe d’apoptose, de contamination, de surpeuplement et de détachement de l’ECM solubilisé. Des notes quotidiennes doivent être prises conformément à la figure 4 pour surveiller avec précision les conditions et les effets expérimentaux sur les cultures. Voir le tableau supplémentaire 1 pour un modèle permettant une prise de notes précise et reproductible liée à la culture organoïde. Pour les organoïdes hépatiques, utilisez CMGF+ amélioré avec l’inhibiteur de ROCK et GSK3β.

Figure 4 : Guide de dimensionnement et de densité des organoïdes. (A) Tableau des tailles organoïdes pour un suivi précis de la croissance des organoïdes. Le Guide de dimensionnement comprend les catégories extra-petit (XS), petit (S), moyen (M), grand (L) et extra-large (XL). (B) Le guide de densité se compose de catégories de très faible densité (VLD), basse densité (LD), densité moyenne (MD), haute densité (HD) et très haute densité (VHD). (C) Images représentatives de la contamination bactérienne et fongique de l’échantillon organoïde. (D) Images représentatives de la surpopulation organoïde et de l’apoptose. Le grossissement de l’objectif est indiqué dans chaque panneau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Recommandation de changement de média
Lundi	Mardi	Mercredi	Jeudi	Vendredi	Samedi	Dimanche
500 μL	N/A	500 μL	N/A	750 μL	N/A	N/A

Tableau 2 : Recommandation de changement pour les médias. Une chronologie recommandée du changement hebdomadaire des médias. Il est recommandé de changer les milieux (500 μL de CMGF+ pour les organoïdes intestinaux ou 500 μL de CMGF+ R/G pour les organoïdes hépatiques). Pour tenir compte des heures supplémentaires d’un week-end, 750 μL de médias sont ajoutés le vendredi après-midi, les médias étant actualisés le lundi matin.

4. Nettoyage organoïde

REMARQUE: Le nettoyage ou le passage des organoïdes doit être effectué régulièrement pour maintenir la santé de la culture organoïde. Effectuez la procédure de nettoyage chaque fois qu’une apoptose dans la culture, la présence de débris, la surpopulation des organoïdes ou le détachement d’ECM solubilisé est remarqué. Reportez-vous à la Figure 4D.

1. Retirez le support des puits tout en inclinant la plaque pour éviter la destruction de l’ECM solubilisé.
   REMARQUE: Si le détachement d’ECM solubilisé est considérable, il est conseillé de transférer le support dans le tube de 15 mL pour éviter de perdre des fragments d’ECM solubilisé contenant l’échantillon.
2. Ajouter 0,5 mL de DMEM/F12 avancé précoûté à chaque puits pour dissoudre les dômes matriciels par pipetage répété à l’aide d’une pointe P1000 (évitez de créer des bulles excessives). Transférer la matrice dissoute contenant des organoïdes dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Gardez le tube sur la glace et si le volume est inférieur à 6 mL, remplissez lentement le tube avec Advanced DMEM/F12 pour atteindre un volume total de 6 mL.
3. Faites tourner le tube (700 x g pendant 5 min à 4 °C) et retirez tout le surnageant tout en veillant à ne pas déranger la pastille.
4. Ajouter le volume requis d’ECM solubilisé (30 μL par puits pour obtenir une densité d’ensemencement appropriée) et remettre lentement en suspension la pastille par mélange à la pipette. Plaquez la suspension au milieu de la plaque de 24 puits pour former un dôme.
5. Placer la plaque dans un incubateur (37 °C; atmosphère à 5 % de _CO2 ) pendant environ 30 min, puis ajouter le volume de milieu approprié (tableau 2).

5. Passage organoïde

REMARQUE: Le passage est généralement effectué 5 à 7 jours après la culture initiale pour élargir la lignée cellulaire organoïde. Les cultures organoïdes peuvent généralement être étendues dans un rapport de 1: 3. Des images de cultures saines prêtes à être adoptées peuvent être vues à la figure 4. Les organoïdes doivent être au moins de taille moyenne.

1. Effectuez les étapes 4.1 à 4.3.
2. Retirez le surnageant en laissant 0,5 mL dans le tube. Assurez-vous de ne pas déranger la pastille.
3. Ajouter 0,5 mL de protéase de type trypsine (voir tableau des matériaux), mélanger correctement en aspirant avec une pipette et incuber au bain-marie à 37 °C (incuber des organoïdes intestinaux pendant 8 min ou des organoïdes hépatiques pendant 10 min). Continuer à mélanger la solution en agitant le tube plusieurs fois à la mi-temps de l’incubation.
4. Déplacez le tube contenant l’échantillon vers une armoire de biosécurité et ajoutez lentement 6 mL de DMEM/F12 avancé précrolin pour inactiver la protéase de type trypsine et arrêter la dissociation des cellules.
5. Faire tourner le tube (700 x g pendant 5 min à 4 °C) et retirer le surnageant. Assurez-vous de ne pas déranger la pastille.
6. Effectuez les étapes 4.4. et 4.5.
   REMARQUE : La section suivante (étapes 6 à 9) décrit le protocole de prélèvement d’organoïdes et de biobanque. Les cultures organoïdes doivent être exemptes de tissu qui a été enlevé lors de passages précédents. Les cultures doivent également être saines, au moins de grande taille et de densité moyenne à élevée. Des images de cultures saines prêtes pour des applications en aval peuvent être vues à la figure 4. Le fait de se déplacer en aval avec la préservation et le prélèvement de cultures organoïdes sous-optimales peut avoir un impact négatif sur les résultats de la caractérisation et la viabilité de la biobanque. Passez en revue la disposition recommandée des plaques de 24 puits à la figure 5.

Figure 5 : Disposition recommandée des plaques à 24 puits. La disposition recommandée de la plaque de 24 puits pour la caractérisation de base après expansion de la culture organoïde. L’incorporation de paraffine de six puits (organoïdes de densité moyenne à grande de densité moyenne à élevée) permettra généralement une concentration élevée d’organoïdes dans un bloc d’histologie. Quatre puits d’organoïdes peuvent être regroupés en un cryovial avec un réactif de stockage d’ARN pour les applications en aval. Quatorze puits sont utilisés pour la biobanque des échantillons organoïdes et fournissent du matériel pour jusqu’à sept flacons cryoconservés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Fixation des organoïdes

1. Retirez le média du puits et assurez-vous de ne pas déranger le dôme ECM solubilisé.
2. Ajouter 500 μL de solution de formol-acide acétique-alcool servant de fixateur (FAA; composition dans le tableau 1).
3. Conservez les organoïdes à température ambiante. Après 24 h, aspirer la FAA et remplir le puits avec 70% d’éthanol. Enveloppez les plaques avec un ruban de film flexible de laboratoire (voir Tableau des matériaux) pour éviter une évaporation rapide. Les organoïdes sont maintenant prêts pour l’incorporation de paraffine. L’incorporation de paraffine de la culture organoïde est effectuée dans des moules de base métalliques traditionnels.

7. Préservation de l’ARN

1. Retirez les médias des puits et assurez-vous de ne pas déranger le dôme ECM solubilisé.
2. Utilisez 0,5 mL de DMEM/F12 avancé précrolin par puits pour dissoudre les dômes ECM solubilisés en pipetant à plusieurs reprises de haut en bas (évitez de créer des bulles excessives). Transférer les organoïdes dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Gardez le tube sur la glace et si le volume est inférieur à 6 mL, remplissez lentement le tube avec Advanced DMEM/F12 pour atteindre 6 mL de volume total.
3. Faire tourner le tube (700 x g pendant 5 min à 4 °C) et retirer tout le surnageant. Assurez-vous de ne pas déranger la pastille.
4. Ajouter 100 μL de PBS au tube d’échantillonnage et remettre la pastille en suspension par pipetage doux. Transférer le contenu du tube d’échantillonnage dans un cryovial.
5. Ajouter 900 μL de réactif de stockage d’ARN (voir tableau des matériaux) dans le tube d’échantillonnage et mélanger pour prélever les organoïdes restants. Transférer ces organoïdes résiduels au cryovial et les stocker à -80 °C (généralement quatre puits regroupés en un seul cryovial seront suffisants pour les applications en aval, y compris la qPCR et le séquençage de l’ARN).
   REMARQUE: Un cryovial produit généralement un total de 4 000 ng d’ARN (mesuré par analyse spectrophotomètre).

8. Biobanque organoïde

REMARQUE: La biobanque se produit généralement 3-4 jours après le passage. Les signes d’apoptose ne doivent pas être présents dans la culture pour effectuer cette méthode. Reportez-vous à la figure 4 pour obtenir la taille et la densité appropriées pour la congélation. Biobanque organoïdes moyens à très larges à densité moyenne à très élevée. Une étape de congélation d’urgence peut être suivie si une lignée cellulaire organoïde est particulièrement rare ou si la viabilité n’est pas garantie. Suivez les mêmes étapes pour la biobanque organoïde normale (étapes 8.1 à 8.4). La congélation d’urgence se fait avec des cultures plus petites et moins denses. Regrouper autant de puits d’organoïdes en croissance en un seul cryovial en suivant les étapes 8.1 à 8.4. Gardez à l’esprit qu’un nombre suffisant d’organoïdes doit être maintenu en vie pour tenter d’étendre la culture (la congélation d’urgence est simplement une procédure de secours pour se protéger contre une éventuelle perte de culture par contamination ou autres événements inattendus).

1. Suivez les étapes 7.1 à 7.3.
2. Ajouter 1 mL de milieu de congélation par cryovial (composition dans le tableau 1) au tube d’échantillonnage et remettre doucement la pastille en les remettant en suspension en les faisant sauter de haut en bas.
3. Transférer 1 mL de la solution dans un cryovial (rapport de deux puits/cryovial) et maintenir les cryoviales sur la glace.
4. Transférer les cryoviaux de la glace dans un récipient de congélation (remplir régulièrement le réservoir d’isopropanol) et transférer immédiatement à -80 °C. Déplacer les échantillons vers de l’azote liquide (-196 °C) pour un stockage à long terme après 24 h.
   REMARQUE: Un récipient de congélation cellulaire sans alcool peut également être utilisé à la place d’un récipient traditionnel. Assurez-vous que les échantillons ne dégèlent pas pendant le transport de -80 °C au stockage à long terme de l’azote liquide. La décongélation répétée diminue la viabilité de la culture cellulaire.

9. Relance du stockage de l’azote liquide

REMARQUE: Lorsque vous choisissez de décongeler une ligne organoïde, un sous-ensemble des organoïdes revivifiés doit être recongelé et remplacé dans la biobanque le plus rapidement possible par au moins un (de préférence plus) cryovial.

1. Placez l’ECM solubilisé sur la glace pour qu’elle dégèle lentement, placez une plaque de 24 puits dans l’incubateur (37 °C; atmosphère à 5 % de _CO2 ) et préparez les réactifs nécessaires tels qu’un tube de 15 mL et advanced DMEM/F12.
2. Récupérer un cryoviral contenant un échantillon organoïde du stockage d’azote liquide et le transférer immédiatement dans un bain de chaleur (37 °C) pendant 2 min.
3. Transférer le contenu du cryovial dans un tube centrifuge de 15 mL dans une armoire de biosécurité. Ajoutez lentement le DMEM/F12 avancé précroduit pour atteindre un volume total de 6 mL.
4. Faire tourner le tube (700 x g pendant 5 min à 4 °C). Retirez le surnageant et assurez-vous de ne pas déranger la pastille.
5. Ajouter 180 μL (30 μL par puits) d’ECM solubilisé à la pastille et plaquer cette suspension dans la plaque préchauffée de 24 puits. Un cryovial peut être plaqué à six puits d’une plaque de 24 puits.
6. Placer la plaque de 24 puits dans l’incubateur (37 °C; 5% d’atmosphère de _CO2 ) pendant ~30 min et ajouter CMGF+ R/G (pour les organoïdes intestinaux, passer au CMGF+ en 24 à 48 h).
   REMARQUE: Lorsqu’un échantillon est plaqué et qu’il pousse dans la plaque de 24 puits, il doit être laissé récupérer pendant au moins 2 jours avant le passage pour augmenter la viabilité.

Résultats

Le protocole organoïde canin génère généralement ~ 50 000 à ~ 150 000 cellules intestinales ou hépatiques par puits d’une plaque de 24 puits. Des organoïdes représentatifs peuvent être vus à la figure 6.

Figure 6 : Images représentatives d’organoïdes canins. Des images d’organoïdes isolés à l’aide de ce protocole sont représentées. (A,B) Organoïdes intestinaux dérivés du duodénum (pris à un grossissement objectif de 10x et 5x). Notez la présence d’organoïdes bourgeonnés plus âgés et de sphéroïdes plus jeunes. (C,D) Entéroïdes canins de la partie inférieure du jéjunum (pris à un grossissement objectif de 10x et 20x). (E,F) Entéroïdes iléaux (pris à un grossissement d’objectif de 20x et 5x) et colonoïdes (G, H) (pris à un grossissement d’objectif de 10x). (I) Une image représentative des organoïdes hépatiques prise à un grossissement objectif de 20x. La plupart des organoïdes sont dans leur forme naissante. Des sphéroïdes hépatiques plus jeunes peuvent également être vus sur l’image. (J) Image représentative montrant un organoïde hépatique rare qui forme une structure en forme de conduit (prise à un grossissement objectif 10x). La barre d’échelle (500 μm) est présente dans le coin supérieur gauche de chaque image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les entéroïdes et les colonoïdes dérivés à l’aide de ce protocole ont été caractérisés précédemment par Chandra et al. en 201912. Les organoïdes intestinaux canins sont composés d’une population cellulaire régulière de l’épithélium intestinal. En utilisant l’hybridation in situ de l’ARN, l’expression de biomarqueurs de cellules souches (Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 - LGR5 et SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin type-B receptor 2 - EPHB2), absorptive epithelial cell markers (Alkaline phosphatase - ALP) et enteroendocrine marker (Neurogenin-3 - Neuro G3)¹² a été confirmé. La coloration Alcian Blue a été effectuée sur des lames incrustées de paraffine pour confirmer la présence de cellules Goblet. De plus, des tests fonctionnels tels que l’imagerie métabolique optique (OMI) ou le test de gonflement du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) ont été effectués pour confirmer l’activité métabolique des organoïdes. Des organoïdes canins de chiens diagnostiqués avec une maladie inflammatoire de l’intestin, des tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) ou un adénocarcinome colorectal ont également été isolés à l’aide de ce ^protocole12.

Après l’isolement des cellules souches, les organoïdes canins hépatiques commencent leur cycle de vie sous forme de sphéroïdes en expansion, et après environ 7 jours, ils se transforment en organoïdes bourgeonnants et différenciants. Les sphéroïdes hépatiques canins isolés et cultivés selon ce protocole ont été mesurés pour quantifier leur croissance et déterminer le moment idéal pour le passage. Des sphéroïdes dérivés de biopsies hépatiques laparoscopiques de chiens adultes en bonne santé (n = 7) ont été mesurés au cours de leurs 7 premiers jours de culture. Des images représentatives ont été prises et le rayon longitudinal (a) et diagonal (b) des sphéroïdes (n = 845) a été mesuré tout au long de la culture. Le volume (V), la surface (P), l’ellipse 2D (A) et la circonférence (C) des sphéroïdes ont été calculés. Les calculs et les résultats de l’expérience sont résumés à la figure 7. La zone d’ellipse 2D et la circonférence ont été utilisées pour évaluer la santé de la culture organoïde à l’aide de la microscopie optique. Ces valeurs peuvent servir de guide pour les décisions de maintien de la culture.

En bref, les sphéroïdes se sont rapidement développés en volume, en surface, en zone d’ellipse 2D et en circonférence. Les données de mesure des sept beagles ont été moyennées pour les calculs suivants. Le volume a augmenté de 479% (±6%) du jour 2 au jour 3. Dans le même temps, la surface sphéroïde et la surface d’ellipse 2D ont augmenté de 211% (±208%) et de 209% (±198%), respectivement. La circonférence de l’ellipse 2D a augmenté de 73% à 3 du jour 2 à 3 (±57%). L’augmentation du volume global d’organoïdes hépatiques des jours 2 à 7 a été plus de 365 fois, la surface et la surface de l’ellipse 2D ont augmenté de 49 fois et la circonférence de l’ellipse 2D a augmenté de six fois.

Ensuite, des sphéroïdes dérivés de deux échantillons canins adultes ont été cultivés après le passage et collectés tous les jours (jours 2-7) pour l’hybridation in situ de l’ARN (ARN ISH). Des sondes canines ont été conçues (la liste des sondes est fournie dans le tableau supplémentaire 2), et l’expression de l’ARNm a été évaluée pour les marqueurs de cellules souches (LGR5), les marqueurs spécifiques aux cholangiocytes (cytokératine 7 - KRT-7 et aquaporine 1 - AQP1), ainsi que les marqueurs hépatocytaires (protéine de boîte à fourche A1 - FOXA1; et cytochrome P450 3A12 - CYP3A12). L’expression des marqueurs a été évaluée de manière semi-quantitative (images représentatives de la figure 8). Les sphéroïdes exprimaient préférentiellement le marqueur cholangiocyte KRT-7 allant de 1% à 26% dans la surface du signal / la surface totale des cellules. AQP1 n’a pas été exprimé dans les échantillons organoïdes, sans doute parce que sa présence dans les échantillons hépatiques canins est rare. L’expression des marqueurs de cellules souches (LGR5) variait entre 0,17 % et 0,78 %, tandis que les marqueurs hépatocytaires étaient exprimés dans une moindre mesure entre 0,05 % et 0,34 % pour FOXA1 et 0,03 %-0,28 % pour le CYP3A12.

Figure 7: Mesures des sphéroïdes hépatiques. (A) La croissance des sphéroïdes hépatiques a été observée tous les jours des cultures du jour 2 au 7. Les sphéroïdes se sont formés pour la première fois le jour 2, et les derniers sphéroïdes ont commencé le processus de bourgeonnement le jour 7. Une expérience ultérieure a utilisé deux lignes organoïdes canines après le passage pour prélever des sphéroïdes tous les jours pour l’incorporation de paraffine afin d’effectuer l’ISH de l’ARN (l’image du jour 2 a été prise à 40x, l’image du jour 6 à 10x, et le reste des images ont été prises à un grossissement de 20x). (B) Un amas de sphéroïdes hépatiques est montré attaché à un morceau de tissu incorporé dans l’ECM solubilisé 4 jours après l’isolement. Les rayons longitudinaux et diagonals des sphéroïdes ont été mesurés (image prise à 10x). Le panneau (C) représente la formule utilisée pour les calculs permettant de calculer le volume (V), la surface (P), l’ellipse 2D (A) et la circonférence (C). Pour ces calculs, on a supposé que les sphéroïdes hépatiques canins sont des sphéroïdes idéaux. Les résultats des mesures du volume, de la surface, de la surface, de la surface de l’ellipse 2D et de la circonférence de l’ellipse 2D des sphéroïdes hépatiques pour des jours individuels de croissance sont représentés dans le panneau (D). Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (SEM). (E) L’expression de l’ARNm de KRT-7, LGR5, FOXA1 et CYP3A12 a été mesurée dans des échantillons de sphéroïdes hépatiques canins après le passage du jour 2 au jour 7. L’AQP1 n’a pas été exprimée dans ces échantillons. Une barre d’échelle (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) est présente en haut à gauche de chaque image. Grossissement objectif noté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les organoïdes ne se briseraient rarement pas pendant le processus de passage suivant cette technique standardisée. Si la dissociation ne se produit pas, les temps de passage peuvent être ajustés pour obtenir une désintégration optimale des grappes cellulaires. Cependant, une exposition prolongée à la protéase de type trypsine peut avoir un impact négatif sur la croissance des organoïdes. Les organoïdes hépatiques ont été utilisés dans une expérience ultérieure pour étudier le temps de dissociation optimal et établir une méthode de passage appropriée. En bref, les organoïdes hépatiques de deux chiens en bonne santé (6 bien répliqués chacun) ont été passés avec de la protéase de type trypsine pendant 12 min et 24 min. Les échantillons étaient agités toutes les 6 minutes. À la fin du point de temps de dissociation, 6 mL de DMEM/F12 avancé glacé ont été ajoutés à la solution, et des échantillons ont été filés (700 x g pendant 5 min à 4 °C). Le surnageant (Advanced DMEM/F12 avec protéase diluée de type trypsine) a été retiré et les pastilles ont été incorporées dans un ECM solubilisé comme décrit ci-dessus (étapes 4.4-4.5). Après 12 h de culture dans l’ECM solubilisé et le CMGF+ R/G, des différences ont été observées dans les deux échantillons. Une incubation de 12 minutes avec de la protéase de type trypsine n’a pas inhibé la croissance organoïde. Cependant, la croissance des organoïdes a été affectée négativement (voir la figure 9) en utilisant une incubation de 24 minutes.

Figure 9 : Expérience de passage organoïde hépatique canin. Images représentatives d’organoïdes provenant de deux chiens (D_1 et D_2) passés à l’aide de la méthode d’incubation de la protéase de type trypsine pendant 12 min ou 24 min. Les échantillons témoins ont été passés avec de la protéase de type trypsine pendant 10 minutes. Une barre d’échelle (μm) est présente en haut à gauche de chaque image et représente 500 μm (grossissement objectif 5x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ensuite, l’étude de la capacité de survie des organoïdes hépatiques canins dérivés de ce protocole dans un environnement défavorable (privation de soutien structurel et de nutrition) a été réalisée. L’enquête s’est concentrée sur la détermination du volume de milieux organoïdes et de matrice de sous-sol nécessaires à la croissance et à la survie réussies des organoïdes hépatiques et sur l’établissement de l’influence de ces conditions sur la culture organoïde. La capacité de survie a été mesurée dans une plaque de 96 puits avec un nombre limité d’organoïdes. Les organoïdes de deux chiens ont été passés comme décrit ci-dessus et incorporés (12 répliques) dans différents volumes d’ECM solubilisé (10 μL ou 15 μL). Les cellules ont été plaquées dans une concentration de 400 cellules/10 μL de puits et de 600 cellules/15 μL de puits correspondant à 40 000 cellules/mL. Deux types de supports (CMGF+, ou CMGF+ R/G) ont été ajoutés dans différents volumes (25 μL, 30 μL ou 35 μL). Les supports n’ont jamais été changés et aucune procédure de maintenance n’a été effectuée. La capacité de survie des organoïdes était surveillée tous les jours. La mort organoïde a été définie comme la dissolution de plus de 50% des structures organoïdes. Le taux de survie des organoïdes dans ces conditions variait de 12,9 (±2,3) jours à 18 (±1,5) jours, et les résultats sont résumés dans le tableau 3. Les deux échantillons qui ont survécu le plus longtemps étaient des organoïdes dérivés de chiens incrustés dans 15 μL d’ECM solubilisé et 30 μL de milieu CMGF+. Les deux échantillons ont été incorporés dans un ECM solubilisé (30 μL) et un milieu frais (500 μL) dans une plaque standard de 24 puits après 18 jours de privation pour s’assurer que l’expansion organoïde était encore possible (Figure 10).

	Type de média	Moyenne (jours survivants)	Médian	CV%	Moyenne (jours survivants)	Médian	CV%	Moyenne (jours survivants)	Médian	CV%	Moyenne (jours survivants)	Médian	CV%
Média (μL)		30			25			35			30
ECM (μL)		10			10			10			15
D_1	CMGF+ R/G	12.50	13	11.57	12.83	13	4.50	11.83	11.5	12.91	12.08	13	12.46
	CMGF+	17.08	17	16.26	18.50	19	4.89	18.42	19	14.54	17.82	19	8.99
D_2	CMGF+ R/G	13.67	14	13.36	13.00	13	12.70	14.00	14.5	17.23	13.08	13	8.90
	CMGF+	15.50	15	18.56	17.50	18	10.48	17.50	19	20.89	17.00	17	14.41
TOTAL	CMGF+ R/G	13.08	13	13.13	12.92	13	9.39	12.92	13	17.52	12.58	13	11.22
	CMGF+	16.29	16.5	17.69	18.00	18.5	8.35	17.96	19	17.65	17.43	17	11.70
	décès = plus de 50% de la masse organoïde n’est pas viable

Tableau 3 : Résultats de l’expérience de survie. L’expérience était basée sur la privation de soutien structurel ou de nutrition de deux cultures organoïdes. Les résultats comprennent la moyenne, la médiane et l’écart-type (CV%) des concentrations individuelles d’ECM et de milieux solubilisés chez des chiens individuels.

Figure 10 : Privation nutritionnelle et structurelle des organoïdes. Les organoïdes ont été replaqués dans des plaques de 24 puits pour confirmer la capacité d’expansion après la privation (A). Des images représentatives du jour 4 et du jour 7 après le replaquage montrent l’expansion des organoïdes, confirmant la capacité d’identifier visuellement les organoïdes viables (les images sont prises à un grossissement objectif 5x). Des images représentatives d’organoïdes considérés comme vivants ou morts sont vues en (B). Les images sont prises à un grossissement d’objectif 5x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Images représentatives de l’hybridation in situ de l’ARN des sphéroïdes hépatiques. Des images représentatives des marqueurs LGR5, KRT7, FOXA1 et CYP3A12 ont été prises à un grossissement objectif de 60x des échantillons du jour 2 à 7 après le passage. Les molécules d’ARNm positives se colorent en rouge. AQP1 n’a pas été exprimé dans les échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composition incomplète de la solution chélatante (CSI)	Concentration finale
500 mL H2O	NA
2,49 g de Na2HPO4-2H2O	4,98 mg/mL
2,7 g de KH2PO4	5,4 mg/mL
14 g de NaCl	28 mg/mL
0,3 g KCl	0,6 mg/mL
37,5 g de saccharose	75 mg/mL
25 g de D-sorbitol	50 mg/mL
Composition de la solution chélatante complète (CCS)	V/V % ou concentration finale
Solution de chélation incomplète	20%
H2O stérile	80%
TNT	520 μM
Streptocoque de stylo	Stylo : 196 U/mL; Streptocoque 196 ug/mL
Composition des milieux organoïdes	Concentration finale
DMEM/F12 avancé	NA
FBS (en anglais seulement)	8%
Glutamax	2 mM
HEPES	10 mM
Primocine	100 μg/mL
Supplément de B27	1x
Supplément N2	1x
N-acétyl-L-cystéine	1 mM
Murin EGF	50 ng/mL
Murine Noggin	100 ng/mL
R-Spondin-1 humain	500 ng/mL
Murin Wnt-3a	100 ng/mL
[Leu15]-Gastrine I humaine	10 nM
Nicotinamide	10 mM
A-83-01	500 nM
SB202190 (inhibiteur de P38)	10 μM
TMS (triméthoprime sulfaméthoxazole)	10 μg/mL
Composants supplémentaires	Concentration finale
Inhibiteur de ROCK (Y-27632)	10 μM
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	2,5 μM
Composition du milieu de congélation	V/V pour cent
Milieu organoïde et inhibiteur de ROCK	50%
FBS (en anglais seulement)	40%
Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)	10%
Composition de la FAA	V/V pour cent
Éthanol (100 %)	50%
Acide acétique, glacial	5%
Formaldéhyde (37 %)	10%
Eau distillée	35%

Tableau 1 : Composition des solutions et des supports. Une liste des composants et des concentrations des solutions chélatantes incomplètes et complètes, du CMGF+ (milieu organoïde), des milieux de congélation et du FAA.

Tableau supplémentaire 1 : Modèle de soins organoïdes. Ce modèle permet une prise de notes organoïde précise et reproductible pour chaque jour. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2 : Sondes d’hybridation in situ de l’ARN. Liste des sondes spécialement conçues pour les cibles d’ARNm canines par un fabricant de la technologie permettant d’effectuer une technique d’hybridation in situ de l’ARN. Les informations sur l’importance des marqueurs individuels, le nom d’une sonde, son numéro de référence et la région cible sont répertoriées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Il existe actuellement un manque de protocoles normalisés disponibles pour l’isolement et le maintien des organoïdes hépatiques et intestinaux canins. L’établissement de procédures opérationnelles normalisées pour les cultures organoïdes est justifié pour que ce modèle soit applicable dans différents contextes de laboratoire. Plus précisément, fournir des protocoles d’exploitation normalisés pour la culture de ces modèles organoïdes canins est essentiel pour caractériser la croissance normale des organoïdes pendant la culture et le passage afin d’obtenir des points temporels optimaux pour l’expansion et la maintenance. Les organoïdes intestinaux canins cultivés selon le protocole ont déjà été caractérisés par Chandra et ^al.12.

L’une des étapes les plus critiques du protocole est le passage des organoïdes. Le moment optimal pour le premier passage des sphéroïdes hépatiques a été déterminé comme étant le jour 7 après l’isolement sur la base des mesures des sphéroïdes hépatiques. Le volume maximal de sphéroïdes a été atteint au jour 7, et en même temps, les sphéroïdes ont commencé à bourgeonner et à former des organoïdes hépatiques. L’augmentation du volume organoïde global du jour 2 à 7 après l’isolement a été plus de 365 fois, ce qui suggère que le temps de passage optimal est plus long que la culture organoïde intestinale canine. Après 7 jours de culture, aucun signe grossier d’apoptose cellulaire dans le sphéroïde hépatique n’a été observé, même sans nettoyage ni passage (Figure 7). Le passage des organoïdes intestinaux et hépatiques peut être difficile car la procédure peut entraîner la perte de cellules et une altération de la viabilité. Les résultats indiquent que l’incubation prolongée d’organoïdes hépatiques avec de la protéase de type trypsine (jusqu’à 12 min) n’influence pas négativement la sous-culture. L’incubation des organoïdes dans la protéase de type trypsine pendant plus de 24 minutes peut être préjudiciable à la sous-culture ultérieure des organoïdes.

En cas de rupture sous-optimale dans les amas cellulaires avec le passage organoïde, une dissociation mécanique au lieu d’une incubation prolongée avec une protéase de type trypsine pourrait être plus bénéfique. Si des problèmes sont rencontrés avec la dissociation correcte des organoïdes, un bref vortex des échantillons peut être tenté pour améliorer le rendement de passage. D’autre part, le vortex a le potentiel de ruiner une culture et d’endommager les cellules, il ne devrait donc être utilisé que lorsque d’autres procédures ont échoué à plusieurs reprises. Briser les organoïdes hépatiques en cellules individuelles réduit le taux de croissance des organoïdes, tandis que les diviser en grappes de cellules peut grandement améliorer leur viabilité. Dix minutes ont été choisies comme temps d’incubation pour le protocole organoïde. Un point de temps d’incubation de 12 minutes a été jugé non cytotoxique par rapport à une incubation de 24 minutes dans l’expérience de protéase de type trypsine.

L’expérience de survie a confirmé que les organoïdes hépatiques canins pouvaient survivre jusqu’à 19,5 jours dans des conditions défavorables (épuisement structurel et nutritionnel). Les organoïdes qui ont survécu le plus longtemps à ces conditions ont été cultivés avec des milieux CMGF+. Cette observation pourrait avoir été causée par la croissance plus lente des organoïdes hépatiques dans les milieux non supplémentés par l’inhibiteur de Rock et GSK3β. Les cultures organoïdes avec CMGF+ R/G se sont développées plus rapidement et ont peut-être épuisé leurs ressources plus rapidement. Cette expérience ouvre des possibilités de miniaturisation de la culture organoïde canine pour obtenir une conversion du système à haut débit. Une telle technologie montre le potentiel de faciliter la découverte de médicaments ou les études toxicologiques à un coût considérablement réduit.

Certains problèmes courants rencontrés lors de l’entretien de la culture organoïde canine sont une solidification incorrecte de l’échantillon lors du placage, la contamination de la culture et l’établissement de la densité et de la taille appropriées des organoïdes. Si l’ECM solubilisé se solidifie prématurément pendant le placage, placez-le immédiatement sur de la glace pendant 10 min. Si l’ECM solubilisé ne forme pas de structures en forme de dôme, il est probable qu’un nombre insuffisant de supports ait été retiré de l’échantillon. Si tel est le cas, diluer l’échantillon avec un ECM plus solubilisé jusqu’à ce que des dômes se forment.

Lorsqu’une contamination fongique ou bactérienne est trouvée dans une plaque entière (voir la figure 4), la meilleure solution est de jeter la plaque. Un traitement avec des médicaments antifongiques ou antibiotiques peut être tenté, mais le succès d’une telle tentative est extrêmement faible. Si un seul puits est contaminé dans une plaque, les puits viables et non affectés peuvent être nettoyés (suivez les étapes 4.1 à 4.5) sur une nouvelle plaque et surveillés de près. Si l’échantillon a déjà été congelé d’urgence, il est conseillé de jeter l’échantillon entier, car la décongélation de l’échantillon expose l’incubateur à un risque de contamination supplémentaire.

La culture organoïde saine doit être au moins dans la catégorie de taille moyenne et de densité moyenne ou plus grande. Une densité optimale est cruciale pour la croissance de la culture organoïde. Une densité plus faible doit être corrigée en nettoyant les organoïdes à une densité moyenne. Si la situation de densité extrême se produit (surpeuplement), les organoïdes doivent être étendus à plus de puits. Les signes bruts d’apoptose cellulaire accompagnent souvent à la fois la surpopulation et la faible densité de la culture organoïde. Si ces problèmes ne sont pas corrigés à temps, toute la culture organoïde deviendra apoptotique en quelques jours. Si les organoïdes atteignent une très grande taille ou une densité très élevée, la culture doit être utilisée pour une expérience, une congélation ou une fixation.

Le milieu organoïde contient actuellement 17 composants, et l’ajout de facteurs de croissance nécessaires à l’entretien et à l’expansion des organoïdes peut donc être coûteux. Ce problème peut être résolu en cultivant des cultures cellulaires 2D qui synthétisent les facteurs de croissance pour produire du CMGF+ conditionné. La culture cellulaire L-WRN produit des facteurs de croissance Wnt-3a, R-Spondin-3 et ^Noggin37. La colonie cellulaire utilise 90 % de milieux de culture DMEM/F12 et 10 % de FBS. Lorsque la culture atteint 90% de confluence, les médias sont récoltés tous les jours pendant 1 semaine. Le milieu récolté est ensuite mélangé avec 2x CMGF+ (sans ces facteurs de croissance). Alors que les cultures 2D peuvent produire les facteurs de croissance nécessaires à une fraction du coût, il faut s’attendre à un temps et à une préparation supplémentaires pour produire le média. Les concentrations de facteurs de croissance entre les lots de milieux conditionnés peuvent également ^{différer37,38}.

Les cultures organoïdes canines dérivées de cellules souches adultes sont un modèle biomédical unique qui peut aider à atteindre les objectifs de l’Initiative Une seule ^santé39. La technologie organoïde peut être utilisée dans de nombreux domaines de recherche fondamentale et biomédicale, allant de la biologie du développement, de la physiopathologie, de la découverte et des essais de médicaments, de la toxicologie à l’étude des maladies infectieuses et de la médecine régénérative40. La recherche translationnelle et la recherche translationnelle inverse sont deux domaines où les organoïdes canins sont ^{applicables15}. Les chiens sont utilisés depuis des siècles dans des contextes expérimentaux translationnels, et leur statut d’animal de compagnie a également facilité leur position comme l’une des espèces les plus explorées en médecine vétérinaire.

En conclusion, ce manuscrit fournit des protocoles d’exploitation normalisés pour l’isolement, l’entretien, le prélèvement et la biobanque d’organoïdes hépatiques et intestinaux canins afin de faciliter l’application de ce modèle dans divers domaines biomédicaux. Ce modèle est particulièrement approprié pour promouvoir la recherche translationnelle inversée en tant qu’outil de l’initiative Une seule santé afin de promouvoir le partage inter et intradisciplinaire des connaissances.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chelating solution
D-Sorbitol	Fisher Chemical	BP439-500
DTT	Promega	V3151
KCl	Fisher Chemical	P217-500
KH2PO4	Sigma	P5655-100G
Na2HPO4-2H2O	Sigma	S5136-100G
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
Pen Strep	Gibco	15140-122
Sucrose	Fisher Chemical	S5-500
Organoid media
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma	G9145-.5MG
A-83-01	PeproTech	9094360
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
FBS	Corning	35-010-CV
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	VWR Life Science	J848-500ML
Human R-Spondin-1	PeproTech	120-38-500UG
Murine EGF	PeproTech	315-09-1MG
Murine Noggin	PeproTech	250-38-250UG
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG
N2 supplement	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-25G
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
ROCK inhibitor (Y-27632)	EMD Millipore Corp.	SCM 075
SB202190 (P38 inhibitor)	Sigma	S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	Reprocell	04-0004-base
Trimethoprim	Sigma	T7883-5G
Sulfamethoxazole	Sigma-Aldrich	S7507-10G
Reagents
Acetic Acid, Glacial	Fisher Chemical	A38-500
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Chemicals	D128-500
EDTA, pH 8.0, 0.5 M	Invitrogen	15575-038
Formaldehyde (37%)	Fisher Chemical	F79P-4
Glutaraldehyde solution	Sigma	G5882
Matrigel Matrix For Organoid Culture	Corning	356255	Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97%	Alfa Aesar	A11313
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
RNAlater Soln.	Invitrogen	AM7021	RNA Storage Reagent
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Trypsin-like Protease
Other
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
ACD Hybez II Hybridization System	ACD a biotechne brand	321710
Centrifuge Tube, 15 mL	Corning	430766
CoolCell LX	Corning	BCS-405MC
Cryogenic Vials	Corning	430488
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	Fisherbrand	05-539-13
GyroMini Nutating mixer (Rocker)	Labnet	S0500-230V-EU
Heat Bath	Lab-Line Instruments	3000
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	SpectrophotometerAnalysis
Panasonic incubator	Panasonic	MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film	Bemis Company Inc	PM996/EMD	Laboratory Flexible Film Tape
Protected Disposable Scalpels	Bard-Parker	239844
RNAscope 2.5 HD Assay – RED	ACD a biotechne brand	322350
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents	ACD a biotechne brand	322330
RNAscope Target Retrieval Reagents	ACD a biotechne brand	322000
RNAscope Wash Buffer Reagents	ACD a biotechne brand	310091
Tissue Culture Dish	Dot Scientific	6676621
Tissue Culture Plate 24 wells	Fisherbrand	FB012929