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Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour administrer des médicaments antirétroviraux combinés oraux qui suppriment avec succès la réplication de l’ARN du VIH-1 chez des souris humanisées.

Résumé

La pandémie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) continue de se propager sans relâche dans le monde entier et, à l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin contre le VIH. Bien que la thérapie antirétrovirale combinée (cART) ait réussi à supprimer la réplication virale, elle ne peut pas éradiquer complètement le réservoir des personnes infectées par le VIH. Une stratégie de guérison sûre et efficace de l’infection par le VIH nécessitera des méthodes à plusieurs volets et, par conséquent, les progrès des modèles animaux pour l’infection par le VIH-1 sont essentiels au développement de la recherche sur la guérison du VIH. Les souris humanisées récapitulent les principales caractéristiques de l’infection par le VIH-1. Le modèle murin humanisé peut être infecté par le VIH-1 et la réplication virale peut être contrôlée par des schémas thérapeutiques cART. De plus, l’interruption de la cART entraîne un rebond viral rapide chez les souris humanisées. Cependant, l’administration de cART à l’animal peut être inefficace, difficile ou toxique, et de nombreux schémas thérapeutiques de TAR cliniquement pertinents ne peuvent pas être utilisés de manière optimale. En plus d’être potentiellement dangereuse pour les chercheurs, l’administration de cART par une procédure d’injection quotidienne intensive couramment utilisée induit un stress par contention physique de l’animal. La nouvelle méthode orale cART pour traiter les souris humanisées infectées par le VIH-1 décrite dans cet article a entraîné une suppression de la virémie inférieure au seuil de détection, une augmentation du taux de restauration du CD4+ et une amélioration de la santé globale chez les souris humanisées infectées par le VIH-1.

Introduction

L’espérance de vie des personnes infectées par le virus de l’immunodéficience humaine chronique (VIH) s’est considérablement améliorée grâce au traitement antirétroviral combiné (TARc)1,2. cART réduit avec succès la réplication du VIH-1 et augmente le nombre de lymphocytes T CD4+ jusqu’à la normale chez la majorité des participants infectés de façon chronique par le VIH-13, ce qui entraîne une amélioration de la santé globale et une réduction spectaculaire de la progression de la maladie4. Cependant, le réservoir latent du VIH-1 est établi même lorsque le TAR est initié pendant l’infection aiguë 5,6,7. Les réservoirs persistent pendant des années pendant le TAR et le rebond viral rapide après l’interruption du TAR est bien documenté 8,9. Les personnes vivant avec le VIH sous TAR sont également prédisposées à un risque plus élevé de comorbidités telles que les maladies cardiovasculaires, le cancer et les troubles neurologiques10,11,12. Par conséquent, un remède fonctionnel contre le VIH est nécessaire. Les modèles animaux pour l’infection par le VIH-1 offrent des avantages évidents dans l’élaboration et la validation de nouvelles stratégies de guérison du VIH13,14,15. Les souris humanisées, en tant que modèle de petit animal, peuvent fournir une reconstitution de cellules immunitaires humaines multilignées dans différents tissus, ce qui permet d’étudier de près l’infection par le VIH16,17,18,19. Parmi les modèles humanisés, le modèle humanisé de la moelle osseuse, du foie et du thymus (BLT) récapitule avec succès l’infection chronique par le VIH-1 ainsi que les réponses immunitaires humaines fonctionnelles à l’infection par le VIH-1 20,21,22,23,24. Par conséquent, le modèle murin BLT humanisé a été largement utilisé pour étudier divers aspects dans le domaine de la recherche sur le VIH. Les souris BLT humanisées ne sont pas seulement des modèles bien établis pour la récapitulation de l’infection persistante par le VIH-1 et la pathogenèse, mais aussi des outils conséquents pour l’évaluation des stratégies d’intervention basées sur la thérapie cellulaire. Les auteurs actuels et d’autres ont démontré que le modèle humanisé des souris BLT récapitule l’infection persistante par le VIH-1 et la pathogenèse 25,26,27 et fournit des outils pour évaluer les stratégies d’intervention basées sur la thérapie cellulaire 28,29,30,31,32,33.

Les schémas thérapeutiques cART consistant en des combinaisons de médicaments antirétroviraux pris quotidiennement suppriment la réplication du VIH-1 au point que la charge virale chez les personnes traitées avec succès reste indétectable à long terme34. Les résultats du traitement de souris humanisées infectées par le VIH avec des schémas thérapeutiques cART cliniquement pertinents ressemblent à ceux observés chez les personnes infectées par le VIH-1 traitées par TAR22 : Les taux de VIH-1 sont supprimés en dessous des limites de détection et l’interruption du TAR entraîne un rebond de la réplication du VIH à partir du réservoir latent35. L’injection sous-cutanée (SC)27,36,37 ou intrapéritonéale (IP)37,38,39 est la voie couramment utilisée pour le traitement antirétroviral chez les souris humanisées. Cependant, l’injection quotidienne intensive induit un stress chez les animaux par la contention physique40. Il est également exigeant en main-d’œuvre et potentiellement dangereux pour les chercheurs en raison de l’exposition accrue au VIH lors de l’utilisation d’objets tranchants. L’administration orale est idéale pour imiter l’absorption, la distribution et l’excrétion des médicaments antirétroviraux pris par les personnes infectées par le VIH-1. L’administration orale implique généralement des procédures personnalisées et souvent laborieuses pour mettre les médicaments antirétroviraux dans des aliments stérilisés (nécessaires en raison de l’immunodéficience des souris) 24,37,41 ou de l’eau 42,43,44,45,46 , qui peut ou non être chimiquement compatible avec de nombreux médicaments antirétroviraux, ou entraîner quelque chose que les souris ne mangeraient pas ou ne boiraient pas facilement (ce qui affecterait la dose et les niveaux de médicament dans le corps). La nouvelle méthode d’administration perorale de cART proposée ici surpasse les tentatives d’administration précédentes en raison de sa compatibilité avec différents types de médicaments antirétroviraux, de son innocuité et de sa facilité de préparation et d’administration, ainsi que de la réduction du stress et de l’anxiété chez les animaux résultant de l’injection quotidienne.

Le fumarate de ténofovir disoproxil (TDF), l’elvitégravir (ELV) et le raltégravir (RAL) sont des médicaments peu solubles dans l’eau. Fait intéressant, une biodisponibilité accrue du TDF est observée avec les aliments gras, ce qui suggère que l’inhibition compétitive des lipases par les aliments gras peut fournir une certaine protection contre le TDF47. Par conséquent, les gobelets DietGel Boost ont été choisis pour remplacer le chow de rongeur ordinaire comme méthode d’administration en fonction de leur teneur modeste en matières grasses (20,3 g pour 100 g) par rapport au chow de rongeur ordinaire (10 g pour 100 g) et à un régime alimentaire typique de souris riche en graisses (40-60 g pour 100 g)48. Le poids total d’une tasse est de 75 g; Ainsi, chaque tasse contiendra la quantité de nourriture, et donc de médicament, suffisante pour cinq souris sur 3 jours.

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Protocole

Des tissus fœtaux humains anonymisés ont été acquis commercialement. La recherche sur les animaux a été menée conformément aux protocoles approuvés par l’Université de Californie à Los Angeles et le Comité de recherche animale (ARC) de l’UCLA, conformément à toutes les directives fédérales, étatiques et locales. Plus précisément, toutes les expériences ont été menées conformément aux recommandations et aux lignes directrices pour l’hébergement et les soins des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH) et de l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International en vertu du protocole UCLA ARC numéro 2010-038-02B. Toutes les chirurgies ont été effectuées sous anesthésie à la kétamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) et à l’isoflurane (2-3 vol%) et tous les efforts ont été faits pour minimiser la douleur et l’inconfort des animaux.

1. Souris humanisées infectées par le VIH-1

NOTE: Les souris humanisées ont été construites comme décrit précédemment dans30,31,49. Le protocole est brièvement décrit ci-dessous.

  1. Purifier les cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ du foie fœtal humain via des microbilles anti-CD34 selon le protocole du fabricant.
  2. Anesthésier les souris mâles et femelles NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) âgées de 6 à 8 semaines et les irradier sublétalement (2,7 Gy) avant la chirurgie.
  3. Implanter le thymus, dérivé du même donneur que le foie fœtal, sous la capsule rénale avec le foie.
  4. Après l’implantation, injecter des souris de 0,5 million à un million de cellules CD34+, par voie intraveineuse.
  5. Après 8-10 semaines, recueillir 100 μL de sang de souris par saignement rétro-orbital50 dans des tubes de microcentrifugation contenant 5 μL d’EDTA et centrifuger à 350 x g pendant 3 min.
  6. Conservez le plasma à -80 °C pour surveiller la charge virale après que la souris a été infectée par le VIH-1. Ajouter 2 mL de solution de NH4C à 83% et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour lyser les globules rouges.
  7. Ajouter 10 mL de RPMI avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) pour arrêter la lyse. Faire tourner à 300 x g pendant 5 min.
  8. Aspirer le surnageant. Colorer les cellules avec un panel d’anticorps (voir le tableau des matériaux) et analyser par cytométrie en flux pour vérifier la greffe de cellules immunitaires humaines.
  9. Infecter des souris présentant plus de 50 % des cellules CD45+ circulantes par injection veineuse rétro-orbitaire51,52 avec au moins 200 ng de p24 d’une souche VIH-1 (c.-à-d. NFNSXSL9 30,53,54) à l’aide d’une seringue à insuline. Prélever du sang toutes les deux semaines pour l’analyse de cytométrie en flux et pour mesurer la charge virale.

2. Préparation des médicaments antirétroviraux

  1. Peser les médicaments individuels; par exemple, pour fabriquer 10 gobelets alimentaires contenant du TAR, utilisez des racleurs à cellules stériles pour peser 250 mg de FTC (emtricitabine), 375 mg de TDF et 500 mg de RAL ou d’ELV dans des tubes à centrifuger stériles individuels de 15 ml dans une enceinte de biosécurité.
  2. Ajouter 1 mL de DMSO dans un tube de 250 mg FTC (concentration finale de 250 mg/mL), ajouter 1,5 mL de DMSO dans un tube de 375 mg TDF (concentration finale de 250 mg/mL) et ajouter 1 mL de DMSO dans un tube de 500 mg de RAL ou de VLE (concentration finale de 500 mg/mL). Remuer ou pipeter le mélange de médicaments jusqu’à dissolution complète et obtention d’une solution claire.
  3. Utilisez un filtre à membrane en PVDF hydrophile de 0,22 μM pour stériliser les solutions avec une seringue stérile. Les solutions médicamenteuses individuelles peuvent être conservées à -20 °C pendant 12 semaines.
  4. Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, décongeler fraîchement une partie aliquote de chaque solution médicamenteuse à 37 °C jusqu’à ce que la solution soit limpide. Bien mélanger à l’aide d’une pipette.
  5. Combinez les médicaments et mélangez bien pour former le mélange principal : 1 mL de FTC dans le DMSO, 1,5 mL de TDF dans le DMSO et 1 mL de VLE ou RAL dans le DMSO.
    NOTE: Ce montant fera 10 gobelets de nourriture.
  6. Ajouter 350 μL de solution de mélange principal cART dans une tasse pour obtenir une tasse DietGel Boost cART.
  7. Ajouter 0,75 mL de triméthoprime-sulfaméthoxazole (concentration finale de 0,48 mg/mL) dans la tasse.
  8. Bien mélanger à l’aide d’embouts de pipette stériles de 1 mL.
  9. Aliquote la gobelette alimentaire contenant cART de la tasse d’origine avec une micro-spatule sur une boîte de Petri de 60 mm au besoin. Peser les aliments sur une balance pour calculer la quantité de gobelet contenant du TAR pour chaque cage en fonction du nombre de souris.

3. Administration de médicaments antirétroviraux à des souris infectées par le VIH-1

  1. Retirez le chow ordinaire de la cage et remplacez-le par un gobelet contenant du cART.
    REMARQUE: En moyenne, une souris mangera jusqu’à 5 g de nourriture par jour. Environ une tasse alimentaire peut être administrée à cinq souris pendant 2 jours.
  2. Rafraîchissez les aliments cART trois fois par semaine.
  3. Peser les tasses usagées pour surveiller la consommation. Peser les souris chaque semaine pour confirmer la consommation.

4. Surveiller la charge virale par PCR en temps réel

  1. Évaluer les cellules immunitaires humaines (taux de lymphocytes T CD4 et CD8) et la réplication du VIH-1 chez les souris BLT toutes les 2 semaines par saignement rétro-orbitaire. Récoltez le plasma en suivant les instructions des étapes 1.5 à 1.8.
  2. Surveiller les charges virales plasmatiques des souris infectées par le VIH-1 avant et pendant l’administration orale de cART pendant 8 semaines. Extraire l’ARN viral plasmatique du plasma à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN viral et le quantifier par PCR en temps réel à l’aide des amorces et des sondes (voir le tableau des matériaux) comme décrit précédemment 27,30,31. Utilisez le protocole de cyclisme suivant : 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), puis 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) pendant 45 cycles.

5. Évaluer les rapports CD4/CD8 par cytométrie en flux

  1. Préparer des suspensions unicellulaires de sang périphérique de saignements bihebdomadaires en suivant les étapes 1.5-1.8.
  2. Colorer les cellules avec des marqueurs de surface et analyser par cytométrie de flux. Utilisez les anticorps marqueurs de surface 27,30,43,49 suivants en cytométrie de flux : CD45 (clone HI30), CD8 (clone SK1), CD3 (clone OKT3), CD4 (clone RPA-T4)27,30,42,49.

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Résultats

En supposant qu’une souris pesant moyenne 25 g consomme 4 g de nourriture par jour, la dose quotidienne de médicament par voie orale correspond à 2,88 mg / kg de TFV, 83 mg / kg FTC et 768 mg / kg RAL. Pour vérifier si le régime alimentaire optimisé est toxique et influence la santé globale par rapport à l’injection quotidienne de cART, le poids des souris a été surveillé chaque semaine avant et pendant le TAR par injection orale ou sous-cutanée. Il n’y avait pas de différence de poids significative ava...

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Discussion

Une méthode d’administration orale de cART est développée ici pour les souris humanisées infectées par le VIH-1 en combinant trois médicaments antirétroviraux dans des aliments riches en nutriments. Par rapport à l’administration par injections quotidiennes, l’administration orale est plus facile à utiliser, limite la fréquence d’administration, réduit la manipulation des animaux, minimise le stress et améliore la sécurité55. Jusqu’à présent, seules quelques études sur d...

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Déclarations de divulgation

SK est l’un des fondateurs de CDR3 Inc. Les autres auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Nous tenons à remercier les Drs Romas Geleziunas et Jeff Murry ainsi que les employés de Gilead pour avoir fourni les médicaments antirétroviraux utilisés dans cette étude. Ce travail a été financé par NCI 1R01CA239261-01 (à Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core et Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (à Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Ce travail a également été soutenu par le UCLA AIDS Institute, le James B. Pendleton Charitable Trust et la McCarthy Family Foundation.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
60 mm petri dishThermo Scientific Nunc150288For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 AntibodyBiolegend344722For flow cytometry
BD LSRFortessaBD biosciencesFor flow data collection
CD34 microbeadsMiltenyi Biotec130-046-702For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubesFalcon14-432-22For dissolving ART
DietGel BoostClearH2O72-04-5022For making ART food
ElvitegravirGileadGifted from Gilead
EmtricitabineGileadGifted from Gilead
FITC anti-human CD3 AntibodyBiolegend317306For flow cytometry
Flowjo softwareFlowJoFor flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′;IDTCustomizedFor viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		IDTCustomizedFor viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′;IDTCustomizedFor viral load RT-PCR
Human fetal tissueAdvanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJThe Jackson Laboratory5557For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45Biolegend304022For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 AntibodyBiolegend300528For flow cytometry
QIAamp Viral RNA KitsQiagen 52904For measuring viral load
RaltegravirMerckGifted from Merck
Sterile cell scrapersThermo Scientific179693For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step KitApplied Biosystems4392653For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarateGileadGifted from Gilead
Trimethoprim-SulfamethoxazolePharmaceutical AssociatesNDC 0121-0854-16For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

Références

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