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요약

이 프로토콜은 인간화 마우스에서 HIV-1 RNA 복제를 성공적으로 억제하는 경구 조합 항레트로바이러스 약물을 전달하는 새로운 방법을 설명합니다.

초록

인간 면역 결핍 바이러스(HIV-1) 대유행은 전 세계적으로 계속 확산되고 있으며 현재 HIV에 대한 백신은 없습니다. 조합 항 레트로 바이러스 요법 (cART)이 바이러스 복제를 억제하는 데 성공했지만 HIV에 감염된 개체로부터 저장소를 완전히 근절 할 수는 없습니다. HIV 감염에 대한 안전하고 효과적인 치료 전략에는 다각적 인 방법이 필요하므로 HIV-1 감염에 대한 동물 모델의 발전은 HIV 치료 연구의 발전에 중추적입니다. 인간화 마우스는 HIV-1 감염의 주요 특징을 요약합니다. 인간화 마우스 모델은 HIV-1에 의해 감염 될 수 있고 바이러스 복제는 cART 요법으로 제어 될 수있다. 더욱이, cART 중단은 인간화 마우스에서 즉각적인 바이러스 반동을 초래한다. 그러나, 동물에 대한 cART의 투여는 비효과적이거나, 어렵거나, 또는 독성일 수 있고, 많은 임상적으로 관련된 cART 요법이 최적으로 활용될 수 없다. 연구자에게 잠재적으로 안전하지 않은 것과 함께 일반적으로 사용되는 집중적 인 일일 주사 절차에 의한 cART의 투여는 동물의 신체적 구속에 의한 스트레스를 유도합니다. 이 기사에 설명된 HIV-1에 감염된 인간화 마우스를 치료하는 새로운 경구 cART 방법은 HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 검출 수준 미만의 바이러스혈증 억제, CD4+ 회복 속도 증가 및 전반적인 건강 개선을 가져왔습니다.

서문

만성 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 감염된 개인의 기대 수명은 조합 항레트로바이러스 치료(cART)로 크게 향상되었습니다1,2. cART는 HIV-1 복제를 성공적으로 감소시키고 대부분의 HIV-1 만성감염 참가자3에서 CD4+ T 세포 수를 정상으로 증가시켜 전반적인 건강을 개선하고 질병진행을 극적으로 감소시킵니다4. 그러나 잠복 HIV-1 저장소는 급성 감염 5,6,7 동안 ART가 시작된 경우에도 설정됩니다. 저장소는 ART 동안 수년에 걸쳐 지속되며 ART 중단 후 빠른 바이러스 반동은 잘 문서화되어 있습니다 8,9. ART에서 HIV에 감염된 사람들은 또한 심혈관 질환, 암 및 신경 장애와 같은 동반 질환의 위험이 더 높기 쉽습니다10,11,12. 따라서 HIV에 대한 기능적 치료가 필요합니다. HIV-1 감염에 대한 동물 모델은 새로운 HIV 치료 전략13,14,15를 개발하고 검증하는 데 명백한 이점을 제공합니다. 인간화 마우스는 작은 동물 모델로서 다른 조직에서 다계통 인간 면역 세포 재구성을 제공할 수 있으며, 이는 HIV 감염16,17,18,19에 대한 면밀한 연구를 가능하게 합니다. 인간화 모델 중에서, 인간화 골수-간-흉선 (BLT) 모델은 HIV-1 감염에 대한 기능적 인간 면역 반응뿐만 아니라 만성 HIV-1 감염을 성공적으로 요약한다 20,21,22,23,24. 따라서, 인간화 BLT 마우스 모델은 HIV 연구 분야에서 다양한 측면을 조사하는데 널리 이용되고 있다. 인간화 BLT 마우스는 지속적인 HIV-1 감염 및 병인의 요약을 위한 잘 확립된 모델일 뿐만 아니라 세포 치료 기반 개입 전략의 평가를 위한 결과적 도구이기도 합니다. 현재의 저자 및 다른 사람들은 인간화 BLT 마우스 모델이 지속적인 HIV-1 감염 및 병인25,26,27을 요약하고 세포 치료 기반 중재 전략 28,29,30,31,32,33을 평가하는 도구를 제공한다는 것을 입증했습니다.

매일 복용하는 항 레트로 바이러스 약물의 조합으로 구성된 cART 요법은 성공적으로 치료 된 개인의 바이러스 부하가 장기간 동안 검출 할 수없는 지점까지 HIV-1 복제를 억제합니다34. 임상적으로 관련된 cART 요법으로 HIV-감염된 인간화 마우스를 치료하는 결과는 HIV-1에 감염된 ART-치료된 개체에서 관찰된 것과 유사하다22: HIV-1 수준은 검출의 한계 이하로 억제되고, cART의 중단은 잠복 저장소(35)로부터 HIV 복제의 반동을 초래한다. 피하 (SC) 27,36,37 또는 복강 내 (IP) 37,38,39 주사는 인간화 마우스에서 cART 치료에 일반적으로 사용되는 경로입니다. 그러나, 집중적인 일일 주사는 신체적 구속에 의해 동물에게 스트레스를 유도한다(40). 또한 노동 집약적이며 날카로운 물건을 사용하는 동안 HIV에 대한 노출이 증가하기 때문에 연구자에게 잠재적으로 안전하지 않습니다. 경구 투여는 HIV-1에 감염된 개인이 복용하는 cART 약물의 흡수, 분포 및 배설을 모방하는 데 이상적입니다. 경구 투여는 일반적으로 항 레트로 바이러스 약물을 멸균 된 (마우스의 면역 결핍으로 인해 필요함) 음식 24,37,41 또는 물42,43,44,45,46에 넣는 맞춤형 및 종종 힘든 절차를 포함합니다. , 이는 많은 항 레트로 바이러스 약물과 화학적으로 양립 할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있고, 마우스가 쉽게 먹거나 마시지 않는 것을 초래할 수도 있습니다 (신체의 복용량 및 약물 수준에 영향을 미칠 수 있음). 여기에 제안된 새로운 peroral cART 투여 방법은 다양한 유형의 항레트로바이러스 약물과의 호환성, 안전성 및 준비 및 투여 용이성, 매일 주사로 인한 동물 스트레스 및 불안 감소로 인해 이전 전달 시도를 능가합니다.

Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) 및 Raltegravir (RAL)는 수용성이 낮은 약물입니다. 흥미롭게도, TDF의 증가된 생체이용률은 지방 식품에서 관찰되며, 이는 지방이 많은 음식에 의한 리파아제의 경쟁적 억제가 TDF47에 대한 특정 보호를 제공할 수 있음을 시사한다. 따라서 DietGel Boost 컵은 일반 설치류 차우(100g당 10g) 및 일반적인 마우스 고지방 식단(100g당 40-60g)48과 비교하여 적당한 지방 함량(100g당 20.3g)을 기반으로 전달 방법으로 일반 설치류 차우를 대체하기 위해 선택되었습니다. 한 컵의 총 무게는 75g입니다. 따라서 각 컵에는 3 일 동안 5 마리의 마우스에 충분한 양의 음식과 약물이 들어 있습니다.

프로토콜

익명화된 인간 태아 조직은 상업적으로 획득되었다. 동물 연구는 모든 연방, 주 및 지역 지침에 따라 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스 및 (UCLA) 동물 연구 위원회(ARC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 구체적으로, 모든 실험은 UCLA ARC 프로토콜 번호 2010-038-02B에 따라 국립 보건원 (NIH) 및 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AALAC) 국제 실험실 동물의 주거 및 관리에 대한 권장 사항 및 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 수술은 케타민 (100 mg / kg) / 자일 라진 (5 mg / kg) 및 이소 플루 란 마취 (2-3 부피 %)하에 수행되었으며 동물의 통증과 불편 함을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. HIV-1에 감염된 인간화 마우스

참고: 인간화 마우스는 이전에30,31,49에 기재된 바와 같이 구축하였다. 프로토콜은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.

  1. 제조업체의 프로토콜에 따라 항-CD34 마이크로비드 를 통해 인간 태아 간에서 CD34+ 조혈 전구 세포를 정제합니다.
  2. 수술 전에 6-8 주 된 NOD / SCID / IL2Rγ-/- (NSG) 수컷 및 암컷 마우스를 마취시키고 아 치사 조사 (2.7 Gy)하십시오.
  3. 태아 간과 동일한 기증자로부터 유래 된 흉선을 간과 함께 신장 캡슐 아래에 이식하십시오.
  4. 이식 후, 마우스에 0.5백만에서 100만 CD34+ 세포를 정맥주사한다.
  5. 8-10주 후, 역궤도 블리드50을 통해 마우스 혈액 100μL를 EDTA 5μL가 포함된 미세 원심분리 튜브에 수집하고 350 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
  6. 마우스가 HIV-1에 감염된 후 바이러스 부하를 모니터링하기 위해 혈장을 -80 ° C에 보관하십시오. 2mL의 83% NH4C 용액을 넣고 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 용해시킵니다.
  7. 용해를 중지하기 위해 10% 태아 소 혈청(FBS)과 함께 RPMI 10mL를 추가합니다. 300 x g 에서 5분 동안 돌립니다.
  8. 상청액을 흡인하십시오. 항체 패널( 재료 표 참조)로 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 인간 면역 세포 생착을 확인합니다.
  9. 순환하는 CD45+ 세포의 50% 이상을 나타내는 마우스를 인슐린 주사기를 사용하여 HIV-1 균주의 p24 200ng 이상(즉, NFNSXSL9 30,53,54)으로 역안와 정맥 주사 51,52로 감염시킵니다. 유세포 분석 분석을 위해 격주로 혈액을 수집하고 바이러스 부하를 측정합니다.

2. ART 약물의 제조

  1. 개별 약물의 무게를 측정하십시오. 예를 들어, cART로 식품 컵 10개를 만들려면 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 250mg의 FTC(엠트리시타빈), 375mg의 TDF, 500mg의 RAL 또는 ELV를 생물안전 캐비닛의 개별 멸균 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
  2. 250 mg FTC 튜브(최종 농도 250 mg/mL)에 1 mL의 DMSO를 추가하고, 375 mg TDF 튜브(최종 농도 250 mg/mL)에 1 mL의 DMSO를 추가하고, 500 mg RAL 또는 ELV 튜브(최종 농도 500 mg/mL)에 DMSO 1mL를 추가합니다. 완전히 용해되고 투명한 용액이 얻어 질 때까지 약물 혼합물을 교반하거나 피펫하십시오.
  3. 0.22μM 공극 크기 친수성 PVDF 멤브레인 필터를 사용하여 멸균 주사기로 용액을 멸균합니다. 개별 약물 용액은 -20°C에서 12주 동안 보관할 수 있습니다.
  4. 사용할 준비가 되면 용액이 투명해질 때까지 37°C에서 각 약물 용액의 분취량 하나를 새로 해동합니다. 피펫을 사용하여 잘 섞는다.
  5. 약물을 결합하고 잘 혼합하여 마스터 믹스를 구성합니다 : DMSO에서 1mL의 FTC, DMSO에서 1.5mL의 TDF, DMSO에서 1mL의 ELV 또는 RAL.
    알림: 이 양은 10개의 음식 컵을 만들 것입니다.
  6. 350 μL의 cART 마스터 믹스 용액을 한 컵에 넣어 하나의 다이어트젤 부스트 cART 컵을 만듭니다.
  7. 0.75mL의 트리메토프림-설파메톡사졸(최종 농도 0.48mg/mL)을 컵에 넣습니다.
  8. 1mL 멸균 피펫 팁을 사용하여 완전히 저어줍니다.
  9. 필요에 따라 마이크로 주걱으로 원래 컵의 cART가 들어 있는 식품 컵을 60mm 페트리 접시에 분배합니다. 쥐의 수에 따라 각 케이지에 대한 cART가 들어 있는 음식 컵의 양을 계산하기 위해 저울로 음식을 칭량한다.

3. HIV-1 감염 마우스에 대한 ART 약물 투여

  1. 케이지에서 일반 차우를 제거하고 cART가 들어있는 식품 컵으로 교체하십시오.
    알림: 평균적으로 마우스는 하루에 최대 5g의 음식을 섭취합니다. 약 1 개의 음식 컵을 2 일 동안 5 마리의 마우스에게 투여 할 수 있습니다.
  2. 일주일에 세 번 cART 음식을 새로 고칩니다.
  3. 섭취량을 모니터링하기 위해 사용한 컵의 무게를 측정합니다. 소비량을 확인하기 위해 매주 쥐의 무게를 측정하십시오.

4. 실시간 PCR로 바이러스 부하 모니터링

  1. 인간 면역 세포 (CD4 및 CD8 T 세포 수준)와 BLT 마우스에서 2 주마다 역궤도 출혈로 HIV-1 복제를 평가합니다. 1.5-1.8단계의 지침에 따라 혈장을 수확합니다.
  2. 8주 동안 경구 cART 투여 전과 도중에 HIV-1에 감염된 마우스의 혈장 바이러스 부하를 모니터링합니다. 바이러스 RNA 추출 키트를 이용하여 혈장으로부터 혈장 바이러스 RNA를 추출하고, 앞서 기술한 바와 같이 프라이머 및 프로브(물질 표 참조)를 이용한 실시간 PCR로 정량한다(문헌 표 참조). 다음 사이클링 프로토콜을 사용하십시오 : 48 ° C (15 분), 95 ° C (10 분), 95 ° C (15 초), 60 ° C (1 분) 동안 45 사이클.

5. 유세포분석에 의한 CD4/CD8 비율 평가

  1. 1.5-1.8단계에 따라 격주 출혈의 말초 혈액에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
  2. 표면 마커로 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석합니다. 유세포분석에서 다음의 표면 마커 항체 27,30,43,49를 사용한다: CD45 (클론 HI30), CD8 (클론 SK1), CD3 (클론 OKT3), CD4 (클론 RPA-T4)27,30,42,49.

결과

체중이 25g인 평균 마우스가 하루에 4g의 음식을 섭취한다고 가정하면 경구 섭취를 통한 일일 약물 용량은 2.88mg/kg TFV, 83mg/kg FTC 및 768mg/kg RAL에 해당합니다. 최적화된 식품 요법이 독성이 있고 cART의 일일 주사와 비교하여 전반적인 건강에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, 마우스 체중을 경구 또는 피하 주사를 통해 cART 전과 도중에 매주 모니터링하였다. 각 군에서 cART 투여 전에 유의한 체?...

토론

경구 cART 투여 방법은 HIV-1에 감염된 인간화 마우스를 위해 고 영양 식품 내에 3 가지 항 레트로 바이러스 약물을 결합하여 개발되었습니다. 매일 주사에 의한 투여에 비해 경구 전달은 사용하기 쉽고, 투여 빈도를 제한하고, 동물 취급을 줄이고, 스트레스를 최소화하고, 안전성을 향상시킵니다55. 이 시점까지, 인간화 마우스 24,37,41에 대한 소수의 연구만이 마우스를 치료하기 위?...

공개

SK는 CDR3 Inc.의 설립자입니다. 나머지 저자는 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

감사의 말

우리는 이 연구에 사용된 항레트로바이러스 약물을 제공해 주신 로마스 겔레지우나스 박사와 제프 머리 박사 그리고 길르앗 사람들에게 감사드리고 싶습니다. 이 연구는 NCI 1R01CA239261-01 (Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core, and Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs : Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (Zhen에게), NIAID R2120200174 (PIs : Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). 이 작업은 UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust 및 McCarthy Family Foundation의 지원도 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
60 mm petri dishThermo Scientific Nunc150288For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 AntibodyBiolegend344722For flow cytometry
BD LSRFortessaBD biosciencesFor flow data collection
CD34 microbeadsMiltenyi Biotec130-046-702For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubesFalcon14-432-22For dissolving ART
DietGel BoostClearH2O72-04-5022For making ART food
ElvitegravirGileadGifted from Gilead
EmtricitabineGileadGifted from Gilead
FITC anti-human CD3 AntibodyBiolegend317306For flow cytometry
Flowjo softwareFlowJoFor flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′;IDTCustomizedFor viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		IDTCustomizedFor viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′;IDTCustomizedFor viral load RT-PCR
Human fetal tissueAdvanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJThe Jackson Laboratory5557For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45Biolegend304022For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 AntibodyBiolegend300528For flow cytometry
QIAamp Viral RNA KitsQiagen 52904For measuring viral load
RaltegravirMerckGifted from Merck
Sterile cell scrapersThermo Scientific179693For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step KitApplied Biosystems4392653For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarateGileadGifted from Gilead
Trimethoprim-SulfamethoxazolePharmaceutical AssociatesNDC 0121-0854-16For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

참고문헌

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