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Résumé

Le présent protocole décrit l’extraction d’acides aminés non protéiques à partir de matrices biologiques par précipitation protéique de l’acide trichloracétique (TCA) et hydrolyse acide avant analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem.

Résumé

Les acides aminés non protéiques (NPAA) sont une grande classe d’acides aminés (AA) qui ne sont pas génétiquement codés pour être traduits en protéines. L’analyse des NPAA peut fournir des informations cruciales sur l’absorption et/ou la fonction cellulaire, les voies métaboliques et la toxicité potentielle. β-méthylamino-L-alanine (BMAA) est un NPAA neurotoxique produit par diverses espèces d’algues et est associé à un risque accru de maladies neurodégénératives, ce qui a suscité un intérêt important pour la recherche. Il existe de nombreuses façons d’extraire les AA pour analyse, la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en tandem étant les plus courantes, nécessitant une précipitation des protéines suivie d’une hydrolyse acide de la pastille de protéines. Les études sur la présence de BMAA chez les espèces d’algues fournissent des résultats contradictoires, l’utilisation de la préparation/extraction et de l’analyse d’échantillons non validés étant la cause principale. Comme la plupart des NPAA, la précipitation des protéines dans 10% de TCA aqueux et l’hydrolyse avec HCl fumant sont la forme d’extraction la plus appropriée pour le BMAA et ses isomères aminoéthylglycine (AEG) et acide 2,4-diaminobutyrique (2,4-DAB). Le présent protocole décrit les étapes d’une méthode d’extraction validée du NPAA couramment utilisée dans les laboratoires de recherche et d’enseignement.

Introduction

Les acides aminés sont des composés chimiques qui contiennent au moins un groupe fonctionnel amine et carboxylique. Certains acides aminés contiennent également un groupe imino, un groupe acide fonctionnel autre que carboxylique; D’autres acides aminés ont des groupes amines qui ne sont pas attachés au groupe α-carbone1. Il existe plus de 500 acides aminés2, dont 22 sont connus sous le nom d’acides aminés protéiques utilisés pour le codage génétique dans la synthèse des protéines ribosomales3. Ces 22 acides aminés peuvent être subdivisés en essentiels et non essentiels. Les acides aminés essentiels sont nécessaires au bon fonctionnement d’un organisme et ne peuvent être acquis que par des sources externes. Les acides aminés non essentiels peuvent être synthétisés dans l’organisme. La classification des 22 acides aminés en essentiels / non essentiels est unique à chaque espèce. Tous les autres acides aminés sont des acides aminés non protéiques (NPAA) qui ne sont pas codés pour la synthèse des protéines. Les acides aminés, qu’ils soient protéiques ou non, peuvent également jouer un rôle de signalisation au sein d’un organisme et agir comme intermédiaires métaboliques4. En raison de leurs rôles importants et variés, les niveaux d’acides aminés peuvent donner un aperçu de l’état de l’organisme, de la fonctionnalité et des voies métaboliques, etc. Il existe deux mécanismes principaux par lesquels les acides aminés peuvent être incorporés dans une chaîne polypeptidique: la synthèse des protéines ribosomiques, qui utilise les 22 acides aminés dans le codage, et la synthèse peptidique non ribosomique, qui, avec les acides aminés protéiques, permet l’utilisation de certains NPAA en synthèse. Certains NPAA peuvent imiter les acides aminés protéiques, ce qui peut conduire à leur mauvaise incorporation dans les peptides et les protéines. La mauvaise incorporation provoque un mauvais repliement des protéines, qui, à son tour, a des effets néfastes5, tels que la mauvaise incorporation de la NPAA L-3,4 dihydroxyphénylalanine (L-DOPA) à la place de la tyrosine, affectant négativement la fonction cellulaire et la santé 6,7. Une source supplémentaire de NPAA incorporés est la modification post-traductionnelle (PTM) des résidus d’acides aminés. Les résidus d’acides aminés sont modifiés pour diverses raisons, y compris des changements dans la conformation, la stabilité et la fonctionnalité des peptides ou des protéines. Lors de l’hydrolyse de protéines ou de peptides contenant du PTM, ces résidus d’acides aminés modifiés sont libérés sous leur forme libreNPAA 8,9.

Le NPAA β-méthylamino-L-alanine (BMAA) produit par les cyanobactéries, les diatomées et les dinoflagellates 10 est une neurotoxine présumée qui est impliquée comme facteur contribuant à diverses maladies neurodégénératives telles que le complexe sclérose latérale amyotrophique/parkinsonisme-démence (SLA-PDC)11,12, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie d’Alzheimer 13 . Il est suggéré que BMAA est incorporé par erreur dans la chaîne polypeptidique des protéines à la place de la L-sérine14 et / ou d’autres acides aminés protéiques. La mauvaise incorporation du BMAA peut entraîner le mauvais repliement des protéines, entraînant le dépôt d’agrégats protéiques dans les neurones14. Au cours de la dernière décennie, l’intérêt pour BMAA a considérablement augmenté. Un large éventail d’espèces cyanobactériennes provenant d’environnements d’eau douce, marins et saumâtres ont été découvertes pour produire BMAA15, conduisant à leur distribution généralisée dans divers écosystèmes16,17. De plus, il a été démontré que le BMAA se bioamplifie tout au long de la chaîne alimentaire jusqu’au réseau trophique humain18,19. En raison des effets potentiels sur la santé, du manque de compréhension et des incongruités de la toxicité du BMAA, il est impératif de poursuivre les recherches jusqu’à ce que la toxicité du BMAA soit finalement comprise ou que la BMAA soit jugée sûre20,21.

L’analyse des acides aminés dans les échantillons biologiques peut être divisée en quatre étapes principales: préparation des échantillons, dérivatisation des acides aminés, séparation et détection, identification et quantification. La chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) est la méthode d’analyse privilégiée car elle fournit une séparation et une analyse ciblées et reproductibles des acides aminés.

Les techniques de préparation des échantillons pour l’analyse des échantillons de cyanobactéries et d’autres algues impliquent principalement une méthode d’extraction des acides aminés sous leur forme libre et liée aux protéines. Au fil des ans, les méthodes d’extraction sont restées relativement cohérentes avec les éléments communs, y compris la désolvatation de l’échantillon pour séparer les acides aminés libres de leur forme liée, suivie de la précipitation des protéines et de la libération des acides aminés liés par hydrolyse avec de l’acide chlorhydrique (HCl) à des températures élevées22 . Cette forme d’extraction a été optimisée pour les acides aminés protéiques et utilisée pour les NPAA. Cependant, la détection et la quantification du BMAA et de ses isomères (Figure 1), de l’aminoéthylglycine (AEG) et de l’acide 2,4-diaminobutyrique (2,4-DAB), chez la même espèce de cyanobactéries ont montré des résultats incohérents dans la littérature, une explication possible résidant dans les différences dans les conditions de croissance et/ou la souche d’algues produisant des quantités variables ou nulles de BMAA23 . On a fait valoir qu’une explication plus probable des incohérences dans la détection et la quantification du BMAA et de ses isomères est due à des protocoles expérimentaux non validés, à l’utilisation d’un large éventail de techniques analytiques et à un niveau expérimental insuffisant des méthodes rapportées16,24 conduisant à des données interlaboratoires non reproductibles. Cependant, Glover et coll.25 et Banack26 ont récemment mis au point et validé une technique analytique pour la détection et la quantification du BMAA et de ses isomères par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC)-MS/MS conformément aux directives de l’International Society of Analytical Chemists (AOAC), de la pharmacopée américaine et de la FDA nécessaires à la validation par un seul laboratoire.

Ces expériences de validation ont porté sur la séparation et la détection du BMAA et de ses isomères et n’ont pas permis de corriger les incohérences dans les protocoles de préparation des échantillons. Lage et coll.27 ont comparé le rendement de trois méthodes d’extraction courantes pour quantifier le BMAA et ses isomères dans des échantillons de cyanobactéries par LC-MS/MS : extraction en phase solide (SPE) d’acides aminés libres28,29; une méthode de précipitation protéique impliquant une extraction au méthanol et une précipitation à l’acétone30; et la méthode d’extraction la plus couramment utilisée pour le BMAA, la précipitation des protéines avec de l’acide trichloracétique (TCA)31. Ils ont conclu que la précipitation de la protéine TCA était le protocole optimal, produisant des concentrations plus élevées de BMAA dans les échantillons d’essai par rapport aux autres méthodes d’extraction. Leur étude a validé l’extraction de TCA avec dérivatisation du BMAA à l’aide de carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl (AQC) dans une matrice de cyanobactéries, fournissant un guide établi pour obtenir des données BMAA fiables et reproductibles. L’extraction d’acides aminés TCA est une technique de préparation d’échantillons acceptée et courante qui peut également être appliquée à d’autres matrices. Cependant, la stabilité de l’acide aminé pendant l’hydrolyse doit être prise en compte pour prévenir la dégradation ou l’oxydation, qui peut être surmontée avec l’utilisation de modificateurs chimiques et d’agents réducteurs32. L’extraction de TCA est couramment utilisée et enseignée aux nouveaux étudiants en recherche, et bien que le protocole soit largement rapporté, une aide visuelle dans l’application de cette méthode est une ressource précieuse, assurant une exécution correcte et cohérente.

La chromatographie en phase inverse est couramment utilisée pour séparer les acides aminés, nécessitant une étape de dérivatisation avant les analyses. La dérivatisation des acides aminés tels que le BMAA permet la rétention chromatographique et peut augmenter la résolution entre les isomères. Il augmente également la masse moléculaire et améliore l’ionisation dans le spectromètre de masse. Plusieurs réactifs dérivatisant ont été utilisés pour l’analyse des acides aminés via la LC-MS/MS, notamment le chloroformate de propyle (PCF)33, le carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidyl (AQC)27, le 9-fluorénylméthylchloroformate (FMOC)34 et le chlorure de dansyle (DC)35. Cependant, les seules techniques validées pour analyser BMAA utilisaient soit PCF 36 ou AQC24,26,37 comme réactif de dérivatisation.

La portée de ce protocole est axée sur l’extraction TCA des NPAA à partir de matrices cyanobactériennes. Il s’agit d’une méthode à forte intensité de main-d’œuvre qui est couramment utilisée et enseignée dans les laboratoires de recherche universitaires et industriels sur la base de manuscrits qui peuvent manquer de détails; par conséquent, ce protocole fournit des détails sur la procédure et les techniques impliquées dans la préparation des échantillons pour l’analyse du BMAA libre et lié comme acide aminé modèle.

Protocole

L’espèce de cyanobactéries Merismopedia a été utilisée pour la présente étude38.

1. Préparation de l’échantillon brut

  1. Prélever l’écume d’algues de la source aquatique d’intérêt ou d’un ballon de culture cyanobactérien et la placer dans un tube à centrifuger38 de 50 mL.
    REMARQUE : L’échantillon doit être congelé à −20 °C pour les extractions ultérieures et décongelé avant l’étape suivante.
  2. Centrifuger les tubes contenant l’échantillon à 3 500 x g pendant 10 min à 25 °C. Décanter le surnageant dans un conteneur à déchets et le jeter dans un déchet biologique.
    NOTE: Le surnageant peut être réservé pour une analyse future de l’exosome.
  3. Couvrir solidement le tube contenant la pastille d’échantillon avec un film d’étanchéité (voir le tableau des matériaux) et percer quelques trous dans le film à l’aide d’une pince à épiler à nez longue et tranchante. Conserver le tube en position verticale à −80 °C pendant 30 min.
  4. Allumez et équilibrez le lyophilisateur à 0,1 mbar et -80 °C (~30 min).
    REMARQUE : Les paramètres (étape 1.4) sont optimisés pour le lyophilisateur utilisé pour la présente étude (voir le tableau des matières). Suivez les procédures d’utilisation standard selon le modèle de lyophilisateur disponible en laboratoire ou réglez la température la plus basse possible si le modèle de lyophilisateur ne descend pas aussi bas que −80 °C.
    1. Placez le(s) tube(s) centrifugeur(s) à la verticale dans un récipient en verre lyophilisateur et placez-le à l’intérieur du congélateur à −80 °C pendant 5 minutes pour refroidir le pot.
    2. Retirez le récipient en verre du congélateur et fixez le couvercle en caoutchouc.
    3. Assurez-vous que la poignée de la sortie de la valve en caoutchouc du lyophilisateur est ventilée dans l’atmosphère (pointant vers le haut) et fixez fermement le récipient en verre.
    4. Tournez la poignée de la sortie de la valve en caoutchouc très lentement vers la position de pointage vers le bas pour exposer le pot au vide et permettre jusqu’à 24 h de lyophilisation pour assurer la sublimation de tout le liquide.
    5. Pour libérer le vide dans le pot, tournez la poignée vers le haut, détachez le récipient en verre et retirez les échantillons lyophilisés.
  5. Utilisez une balance analytique pour peser de 15 à 50 mg de granulés d’échantillon séchés dans un tube à centrifuger de 15 mL.
    NOTE: Les échantillons peuvent être entreposés à −80 °C s’ils ne sont pas traités plus avant à ce stade.

2. Lyse cellulaire et fractionnement des NPAA libres

  1. Ajouter 100 μL de 100 ng/mL d’étalon D5-2,4-DAB (voir le tableau des matières) à l’aide d’une micropipette au tube à échantillon (facultatif).
  2. Ajouter 300 à 600 μL de trichloroacétique aqueux à 10 % p/v (TCA, voir le tableau des matières) ou 300 à 600 μL de 11,7 % à 13,3 % de TCA, respectivement, si vous ajoutez la norme D5-2,4-DAB.
    REMARQUE: Choisissez un volume de TCA aqueux qui recouvre complètement le granulé.
  3. Placez les tubes d’échantillon dans un récipient rempli de glace pilée.
  4. Utilisez un sonde sonicateur (voir le tableau des matériaux) à puissance moyenne-élevée (70%) et lyser l’échantillon pendant 1 min en suivant les étapes ci-dessous.
    ATTENTION : Assurez-vous que l’EPI est approprié en utilisant des cache-oreilles antibruit.
    1. Suivez les protocoles de sécurité appropriés en prévision de l’utilisation du sonicateur à sonde en plaçant des panneaux en cours d’utilisation sur la porte, en effectuant une sonication dans la hotte et en utilisant des cache-oreilles antibruit.
    2. Allumez le sonicateur et entrez les paramètres suivants: amplitude, 70%; temps, 1 min.
    3. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur une lingette en papier non pelucheuse (voir le tableau des matériaux) et essuyez la sonde.
    4. Immergez complètement l’extrémité de la sonde dans l’échantillon et appuyez sur Démarrer.
    5. Lorsque le sonicateur de la sonde s’arrête, placez le tube centrifuge contenant l’échantillon sur de la glace pendant 1 min.
    6. Pour vous assurer que les cellules sont lysées, répétez les étapes 2.4.3-2.4.5 une fois de plus.
  5. Placer l’échantillon au réfrigérateur à 4 °C pendant 12 à 24 h pour permettre la précipitation des protéines.
  6. Centrifuger l’échantillon aqueux de TCA à 10 % à 3 500 x g pendant 15 min à 8 °C.
  7. Utilisez une micropipette pour transférer le surnageant dans un tube de 2 mL étiqueté « Fraction libre ».
  8. Micropipette 400 μL de TCA aqueux à 10% dans le tube à centrifuger contenant la pastille d’échantillon restante et briser la pastille soit par agitation vortex, soit avec l’embout de la micropipette.
  9. Répétez les étapes 2.6-2.7, en transférant le surnageant dans le même tube « Fraction libre » de 2 mL.
  10. Micropipette 400 μL de 10% TCA/acétone dans le tube de centrifugation avec la pastille restante et briser la pastille avec vortex ou l’embout de la micropipette.
  11. Centrifuger l’échantillon de TCA/acétone à 10 % à 3 500 x g pendant 15 min à 8 °C. Utilisez une micropipette pour transférer le surnageant dans le tube de 2 ml étiqueté « fraction libre ».
  12. Placez le tube « Fraction libre » avec le couvercle ouvert dans un évaporateur centrifuge (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que tous les liquides volatils soient éliminés (au moins 1 h).
  13. Une fois que l’échantillon est exempt de liquides volatils, couvrez solidement le tube avec un film d’étanchéité et percez le film avec quelques trous à l’aide d’une pince à épiler à nez longue et tranchante. Placer l’échantillon dans un congélateur à −80 °C.
  14. Lyophiliser l’échantillon de « fraction libre » en répétant toutes les étapes de l’étape 1.4.
  15. Micropipette 200 μL d’acide chlorhydrique (HCl) 20 mM dans le tube « Fraction libre » pour reconstituer l’échantillon lyophilisé et le placer dans un congélateur à −80 °C.
    REMARQUE: La « fraction libre » de l’échantillon est prête pour la filtration à l’étape 4. La pastille restante sera traitée dans les étapes suivantes pour le fractionnement des protéines.

3. Fractionnement des NPAA liés aux protéines

  1. Utilisez un graveur sur verre pour étiqueter les flacons de coquille en verre avec les détails de l’échantillon pour l’identification.
    REMARQUE: L’acide fort peut dissiper l’étiquetage de l’encre; Par conséquent, il est recommandé de graver les étiquettes sur du verre.
  2. Micropipette 100 μL de 100 ng/mL D5-2,4-DAB étalon sur la pastille d’échantillon (facultatif).
  3. Micropipette 400 μL d’acétone à 100% sur la pastille d’échantillon et briser la pastille en utilisant soit l’agitation vortex, soit l’embout de la micropipette.
  4. Utilisez une micropipette de 1 mL réglée à 1 000 μL pour transférer la pastille lavée et remise en suspension dans le flacon d’enveloppe en verre correspondant.
    REMARQUE : Un autre 400 μL d’acétone à 100 % peut être ajouté à la pastille agitée pour faciliter le transfert complet de la pastille dans le flacon d’enveloppe en verre. Cela peut être répété une troisième fois si nécessaire.
  5. Centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min à 25 °C et décanter le liquide en déchets biologiques.
  6. Placer la pastille restante dans un évaporateur centrifuge jusqu’à ce que tout le liquide soit retiré et que la pastille soit sèche (~1 h).
  7. Préparer le flacon d’hydrolyse sous vide en ajoutant 1 mL de HCl 6 M au fond du flacon d’hydrolyse.
  8. Utilisez une pince à épiler pour insérer soigneusement les flacons d’enveloppe étiquetés contenant les échantillons séchés dans le flacon d’hydrolyse, en assurant une position verticale et stable.
    REMARQUE : Des flacons à coque vide peuvent être utilisés pour aider à maintenir les flacons d’échantillons en position verticale si le nombre d’échantillons est inférieur à la capacité du flacon d’hydrolyse.
  9. Fixez le couvercle au flacon d’hydrolyse et poussez le bouton rouge sur le couvercle pour fermer la vanne.
  10. Allumez la pompe à vide, fixez le tube à vide à la tête du couvercle du flacon d’hydrolyse et appuyez sur le bouton vert du couvercle pour ouvrir la vanne.
  11. Laissez la pompe à vide (voir le tableau des matériaux) retirer l’air du flacon pendant 1 min.
  12. Fermez le flacon en appuyant sur le bouton rouge du couvercle du flacon d’hydrolyse, éteignez la pompe à vide et retirez le tube à vide.
  13. Fixez un tube en caoutchouc au robinet d’azote gazeux sur la paillasse du laboratoire et ouvrez légèrement le robinet. Placez le pouce à l’extrémité du tube, scellez-le et comptez jusqu’à ce que le gaz commence à s’échapper à mesure que la pression augmente. Ce sera le calendrier de la prochaine étape. Ajustez le débit de gaz à un délai approprié.
  14. Fixez l’autre extrémité du tube en caoutchouc à la tête du couvercle du flacon d’hydrolyse, puis appuyez immédiatement sur le bouton vert du couvercle. Comptez jusqu’au temps déterminé à l’étape 3.13 et appuyez rapidement sur le bouton rouge sur le couvercle et retirez le tube en caoutchouc.
  15. Répétez les étapes 3.10 à 3.14 deux fois pour vous assurer que le flacon d’hydrolyse du verre est exempt d’air et rempli d’azote gazeux.
  16. Placer le flacon d’hydrolyse dans un four préchauffé réglé à 110 °C pendant 16-18 h.
  17. Utilisez des gants de four pour retirer le flacon d’hydrolyse en verre du four et laissez-le refroidir à l’intérieur de la hotte pendant 10 minutes. À l’intérieur de la hotte, tout en lui faisant face, poussez le bouton vert pour libérer la pression et le gaz.
  18. Utilisez une pince à épiler pour retirer les flacons d’enveloppe du flacon d’hydrolyse.
  19. Reconstituer les pastilles d’échantillon hydrolysées par micropipetage de 200 μL de HCl 20 mM dans le flacon de coque. Assurez-vous que la pastille est remise en suspension en tourbillonnant ou en utilisant une pointe de pipette.
  20. Centrifuger les flacons d’enveloppe contenant les pastilles d’échantillon reconstituées pendant 2 min à 5 300 x g et 25 °C.

4. Filtrage des échantillons

  1. Étiqueter les tubes filtrants de 2 mL (voir le tableau des matières) contenant des filtres à membrane à pores de 0,2 μm comme « fraction libre » et « fraction protéique ».
  2. Transférer les échantillons reconstitués de l’étape 2.15 (fraction libre) et de l’étape 3.20 (fraction protéique) dans les tubes filtrants correspondants.
  3. Placez-les dans la centrifugeuse pendant 30 min à 5 000 x g et 25 °C.
  4. Retirez les filtres des tubes filtrants et bouchonnez-les. Les échantillons sont maintenant prêts pour la dérivatisation des acides aminés à l’étape 5.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être placés dans le congélateur à −80 °C pour être entreposés en vue d’une dérivatisation et d’une analyse ultérieures.

5. Dérivatisation des acides aminés

  1. Dériver les échantillons à l’aide de chloroformiate de propyle (PCF)39 ou de carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidyl (AQC)40 conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

Résultats

Une illustration du protocole d’extraction est fournie à la figure 2 à titre de guide de référence résumé. Les résultats obtenus par Violi et al.38 ont été choisis pour représenter un résultat positif de ce protocole d’extraction pour l’analyse des isomères BMAA des cyanobactéries. Dix-neuf espèces uniques de cyanobactéries ont été cultivées dans 11 sites d’eau douce de l’est de l’Australie. En utilisant le même protocole, les isomères BMAA ont été extraits en fractions libres et protéiques, dérivatisés avec PCF et analysés à l’aide de LC-MS/MS. Dix-sept des isolats de cyanobactéries étaient positifs pour le BMAA, et tous les 19 contenaient l’isomère 2,4-DAB. Un résultat positif est confirmé en utilisant une méthode LC-MS/MS validée et en observant au moins trois transitions de surveillance des réactions multiples (MRM), une en tant qu’ion quantificateur et deux en tant qu’ions qualificatifs au temps de rétention attendu. Un chromatogramme MRM représentatif d’un étalon contenant du BMAA et ses isomères, indiqué par les lignes codées par couleur, est illustré à la figure 3. La présence et la concentration de BMAA et d’isomères dans les 19 échantillons, sectionnées pour montrer la concentration de BMAA et d’isomères dans les fractions libres et liées, sont résumées dans le tableau 1. Une détection positive pour les trois isomères a été observée dans la fraction libre de l’espèce Merismopedia recueillie dans le lac Liddell (NSW, Australie), où la fraction libre contenait une concentration de BMAA de 68,38 μg/g de poids sec (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB avec une concentration de 1 223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW, et AEG avec une concentration de 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. Les MRM chromatographiques sont illustrés à la figure 4. Pour illustrer un résultat négatif pour le BMAA et ses isomères dans un échantillon, la fraction liée de l’espèce Microcystis flos-aquae collectée à Walka Water Works (NSW, Australie) est présentée chromatographiquement à la figure 5. Alors que la fraction liée ne contenait pas de BMAA, de 2,4-DAB et/ou d’AEG, sa fraction libre contenait les trois isomères, avec des concentrations de 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1 156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW et 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW, respectivement.

Ainsi, grâce à l’utilisation de ce protocole, Violi et al.38 ont confirmé la présence d’isomères BMAA dans les cyanobactéries d’eau douce de l’est de l’Australie et ont déterminé quelles cyanobactéries avaient des capacités de production de toxines.

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Figure 1 : Structure chimique du BMAA et de ses isomères 2,4-DAB et AEG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Diagramme de référence résumé du protocole d’extraction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Chromatogramme LC-MS/MS d’un étalon contenant D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA et AEG pour l’identification des isomères basée sur la rétention, indiqué par les pics mis en surbrillance. Légende : D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z à 6,4 min (rouge), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z à 6,4 min (vert), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z à 7,4 min (orange) et BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z à 7,8 min (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Chromatogramme LC-MS/MS pour la détection du D5-2,4-DAB, du 2,4-DAB, du BMAA et de l’AEG chez les espèces de Merismopedia prélevées dans le lac Liddell (NSW, Australie), indiquées par les pics mis en évidence. Légende : D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z à 6,4 min (rouge), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z à 6,4 min (vert), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z à 7,4 min (orange) et BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z à 7,8 min (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Chromatogramme LC-MS/MS d’un témoin négatif pour le 2,4-DAB, le BMAA et l’AEG dans une fraction liée d’espèces de Microcystis flos-aquae prélevées à Walka Water Works (NSW, Australie). Légende: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z à 6,4 min (rouge - pic surligné), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z à 6,4 min (vert), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z à 7,4 min (orange) et BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z à 7,8 min (bleu). Les lignes pointillées représentent les temps de rétention du 2,4-DAB, AEG et BMAA manquants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Concentrations de BMAA, d’AEG et de 2,4-DAB dans les isolats de cyanobactéries. Les concentrations ± erreur type de la moyenne (n = 3). ND indique qu’il n’a pas été détecté. La concentration la plus élevée de chaque isomère détecté est surlignée en vert. Le tableau est une version modifiée de Violi et al.38. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Le protocole d’extraction décrit ici pour l’analyse des NPAA s’applique à l’analyse de tous les acides aminés dans les échantillons biologiques. Pour des guides sur l’isolement et la culture des souches de cyanobactéries, on peut se référer aux méthodes présentées dans l’étude de Violi et al.38. La première étape du protocole amène l’échantillon à un point où la normalisation entre les échantillons par rapport au poids sec peut être réalisée. La deuxième étape est la lyse cellulaire pour libérer les analytes et peut être effectuée à l’aide d’un éventail de techniques, y compris les perturbations / lyses mécaniques telles que la sonication de sonde comme décrit dans ce protocole, les cycles de congélation / décongélation, le broyage et le broyage des billes, et les perturbations non mécaniques telles que la lyse enzymatique, détergente et / ou chimique. La perturbation mécanique est connue pour être avantageuse par rapport à la perturbation non mécanique car elle permet une plus grande capacité de lyse de l’échantillon tout en permettant aux liaisons intracellulaires et aux protéines de rester intactes41, bien que la matrice de l’échantillon puisse dicter la méthode optimale pour la lyse cellulaire.

La précipitation des protéines est la troisième étape critique de ce protocole lors de l’extraction des acides aminés pour analyse. Le TCA est le solvant le plus couramment utilisé; cependant, l’acide perchlorique, l’acétone, le méthyl tert-butyléther (MTBE), le méthanol et/ou l’acétonitrile 8,42 ont également été utilisés, chaque solvant d’extraction étant destiné à extraire et à précipiter différents substrats. Le modèle décrit ici extrait le NPAA BMAA et ses isomères d’une matrice cyanobactérienne, et bien qu’une gamme de solvants différents aient été utilisés, les deux plus courants sont 10% de TCA dans l’eau (aqueux) et 10% de TCA dans l’acétone. En général, la précipitation des protéines avec TCA est couramment utilisée pour extraire les acides aminés afin de fractionner les acides aminés libres des acides aminés liés aux protéines. De plus, l’extraction au TCA permet de déterminer la teneur totale en protéines, de réduire les contaminants pour la fraction libre et de réduire l’activité des protéases avec une dégradation minimale des protéines43. L’extraction TCA de la fraction libre fonctionne en rinçant d’abord les substances solubles organiques, laissant derrière elle des protéines et des composés insolubles tels que des restes de paroi cellulaire dans le précipité, qui est ensuite suivie d’une extraction par hydrolyse thermique des acides aminés liés aux protéines (fraction liée) à l’aide d’un acide fort.

Le fractionnement de la fraction libre avec 10% de TCA aqueux plus sonication produit la précipitation protéique la plus étendue par rapport aux autres solvants organiques44 et les meilleures récupérations d’acides aminés42. Certaines études choisissent d’utiliser un acide combiné à un solvant organique (c.-à-d. 10 % à 20 % de TCA dans l’acétone 43) pour précipiter plus de molécules, y compris des peptides/biomolécules plus petits, minimiser la dégradation des protéines et réduire les contaminants tels que les sels43. Un autre avantage de 10% de TCA dans l’acétone est son taux de séchage plus rapide dans la préparation du granulé pour l’hydrolyse, minimisant les résidus d’humidité pour empêcher la modification des acides aminés. Cependant, 10% de TCA aqueux plus sonication ont de meilleures efficacités d’extraction des acides aminés libres par rapport à 10% de TCA dans l’acétone44 seule. De plus, la précipitation aqueuse de 10 % du TCA présente des limites telles qu’un long temps de séchage, l’impossibilité de précipiter toutes les protéines ou les petits peptides/biomolécules, et selon l’analyte d’intérêt (c.-à-d. protéines ou acides aminés), nécessitant des additifs et des agents réducteurs pour prévenir l’oxydation et la dégradation45,46.

Ce protocole utilise une combinaison de 10 % de TCA aqueux et de 10 % de TCA dans l’acétone pour augmenter la précipitation des protéines, assurer la précipitation des peptides/biomolécules plus petits, accélérer les temps de séchage des granulés et augmenter l’efficacité de l’extraction, en tirant parti des deux propriétés d’extraction par solvant. Cependant, la combinaison de 10% de TCA aqueux et de 10% de TCA dans l’acétone peut précipiter de petits peptides / biomolécules dans la fraction libre après que les 10% de TCA dans le surnageant d’acétone soient combinés avec la fraction libre aqueuse. Dans ce cas, les précipités doivent être transférés à la fraction liée pour l’hydrolyse.

La seconde moitié de ce protocole implique la libération d’acides aminés (c.-à-d. BMAA) de la pastille de protéine par hydrolyse acide-vapeur à des températures élevées dans un environnement sans oxygène. Le facteur limitant principalement l’étape d’hydrolyse est qu’elle prend du temps et est laborieuse à préparer. L’incubation de nuit empêche une préparation et une analyse rapides et rapides des échantillons. De plus, le transfert quantitatif de la pastille d’un tube à centrifuger vers un flacon d’obus (étape 3.4) est un processus ardu qui nécessite diligence et patience pour assurer un point précis de normalisation du poids sec. Les problèmes possibles auxquels l’utilisateur peut être confronté sont le transfert incomplet de la pastille, les protéines précipitées humides collées aux extrémités de la pipette et au tube d’origine, et les particules solides de la pastille bloquant l’extrémité de la pipette. Une suggestion pratique pour faciliter le transfert de la pastille est de retirer environ 0,3 à 0,5 mm de l’extrémité de la pointe de la pipette avec une paire de ciseaux, ce qui permet d’aspirer et de libérer les particules de granulés plus grosses dans le flacon de la coque. Cette méthode de transfert est une pratique courante pour l’extraction des protéines pour toutes les analyses d’acides aminés. Cependant, des modifications visant à améliorer l’efficacité et la précision du transfert quantitatif de la pastille dans le flacon d’enveloppe doivent être étudiées.

Deux formes de techniques d’hydrolyse peuvent être utilisées pour libérer les acides aminés de leur état lié aux protéines: l’hydrolyse en phase liquide et l’hydrolyse en vapeur acide. L’hydrolyse en phase liquide, qui implique l’ajout de 6 M HCl sur l’échantillon, qui est ensuite placé dans un four à 110 °C pendant une nuit, est une alternative à l’hydrolyse acide-vapeur décrite dans ce protocole. Les techniques d’extraction qui utilisent l’hydrolyse en phase liquide peuvent nécessiter un traitement supplémentaire, tel que le dessalement, en particulier si la dérivatisation AQC est choisie, car elle nécessite des conditions de base pour l’étiquetage40. L’hydrolyse acide-vapeur évite le dessalement et permet à l’utilisateur de choisir librement la technique de dérivatisation lors de la reconstitution de la pastille finale avant la filtration. De plus, indépendamment de la méthode d’hydrolyse choisie, les échantillons peuvent nécessiter un traitement supplémentaire, tel que SPE pour la purification matricielle et la concentration 29,47,48, selon le choix de la technique de dérivatisation et/ou de l’analyse analytique (p. ex., phase inverse LC-MS/MS vs interaction hydrophile chromatographie liquide [HILIC] LC-MS/MS 37 ). La reconstitution de la pastille finale dans 20 mM HCl dans ce protocole est appropriée pour la dérivatisation à l’aide de réactifs PCF48via un kit d’hydrolyse d’acides aminés disponible dans le commerce39 (voir tableau des matériaux). L’AQC et le PCF dérivatisent tous les acides aminés, protéines et non-protéines d’origine présents dans l’échantillon, et la sélectivité des analytes est obtenue grâce à l’utilisation de LC-MS/MS et à sa combinaison d’appariement du temps de rétention et de sélection minutieuse des MRM quantificateurs et qualificatifs38. 

Les protocoles d’hydrolyse actuels ne sont pas optimisés pour la libération de BMAA, de 2,4-DAB et d’AEG, mais pour les 22 acides aminés protéiques basés sur les méthodes existantes d’hydrolysedes protéines 32, où l’incubation pendant plus de 18 heures entraîne la dégradation et la modification de certains acides aminés, affectant l’analyse LC-MS/MS et, par conséquent, les concentrations obtenues32. Beach et coll.49 ont étudié l’hydrolyse au fil du temps (0,5 à 120 h) afin d’optimiser l’hydrolyse pour l’analyse du BMAA et des acides aminés protéinogènes. Ils ont constaté que bien qu’il y ait eu une libération rapide précoce de BMAA au cours des premières 0,5 heure de l’hydrolyse, les niveaux de BMAA ont continué d’augmenter à mesure que le temps d’hydrolyse augmentait, sans dégradation, même après 5 jours49. Il existe également des points de vue et des questions divergents sur la véritable nature du BMAA lié et de ses isomères, certaines études suggérant que plutôt que la liaison BMAA 50,51 ou la mauvaise incorporation dans les protéines14, l’association BMAA-protéine est superficielle52. Cependant, le consensus actuel dans l’analyse du BMAA « lié » nécessite l’étape d’hydrolyse validée et largement acceptée qui sépare les peptides / protéines pour libérer des acides aminés et, par conséquent, du BMAA et de ses isomères.

Les taux de récupération de 20 acides aminés protéiques ont été déterminés dans une étude de Sedgwick et coll.42 à l’aide d’une extraction au TCA, ce qui a entraîné une récupération d’environ 100 %. Dans le cas du BMAA et de ses isomères provenant de matrices d’algues, des études comparant l’efficacité de l’extraction du BMAA à l’aide de divers solvants d’extraction ont révélé que 10% de TCA était le plus efficace pour le BMAA27 libre. Les taux de récupération du BMAA lié aux protéines extrait par hydrolyse en phase liquide ont été établis dans des études menées par Glover et coll.25 et par Faassen et coll.53, où la précision a été déterminée par des méthodes de récupération par pointe, avec un taux moyen de récupération du BMAA de 108,6 % et 70 %, respectivement. Faassen et al. ont décrit les procédures pour les expériences de récupération des pointes et ont illustré comment la récupération diffère selon le stade du processus d’extraction de la pointe a été faite53. Faassen et al. ont également déterminé l’efficacité du protocole acide-vapeur présenté ici, avec des taux de récupération de 83,6% pour les isomères BMAA dopés avant l’extraction et de 68,6% pour ceux dopés avant l’hydrolyse24. Ces récupérations, méthodes d’extraction et analyses ont été validées par Banack 26, avec des taux de récupération de 94% à 106% pour BMAA dans une matrice cyanobactérienne et un %Écart type relatif (%RSD) compris entre 5,6% et20%, répondant aux critères de précision de la FDA54. Il est recommandé que chaque laboratoire établisse d’abord ses taux de récupération et sa précision avant d’utiliser ce protocole via des expériences de récupération de pointes. Les méthodes de rétablissement présentées dans Faassen et al.53 et Glover et al.25 peuvent être suivies à titre indicatif.

D’autres formes de techniques d’hydrolyse peuvent être utilisées au lieu de l’hydrolyse au four de nuit pour une extraction plus rapide de l’analyte liée aux protéines. Par exemple, un extracteur à micro-ondes pourrait réduire considérablement le temps d’hydrolyse de 24 h à aussi peu que 10 min55. L’hydrolyse par micro-ondes pour les acides aminés utilise les mêmes principes que la méthode thermique conventionnelle, en utilisant une boîte à gants pour préparer et assembler le récipient micro-ondes dans un environnement sans oxygène et en ajoutant 6 M HCl. Une fois étanche à l’air, le récipient contenant l’échantillon subit un rayonnement micro-ondes. L’hydrolyse par micro-ondes a été utilisée pour extraire les acides aminés de diverses matrices d’échantillons56,57,58; cependant, l’hydrolyse par micro-ondes n’a pas encore été développée et validée pour l’analyse de BMAA.

En conclusion, la précipitation aqueuse des protéines TCA à 10% est la méthode optimale pour extraire les acides aminés non protéiques libres des matrices cyanobactériennes27, et l’hydrolyse thermique fournit une extraction fiable et reproductible de la fraction liée aux protéines. Ce protocole d’extraction du NPAA BMAA et de ses isomères des cyanobactéries est validé et largement accepté. Les orientations futures pour optimiser davantage l’extraction du BMAA se concentreront sur l’étape d’hydrolyse, qui est réalisée selon les spécifications des 22 acides aminés protéiques. Cependant, le protocole d’extraction présenté ici doit toujours être considéré comme efficient et efficace pour analyser BMAA et ses isomères via LC-MS/MS.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

D.P.B., K.J.R. et S.M.M. sont soutenus par la Fondation Ian Potter, et J.P.V. est le bénéficiaire d’un programme de formation à la recherche du gouvernement australien, Stipend.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL glass shell vialsSHIMADZUREST-24663
10% TCA solutionDilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solutionDissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipetteEpendorf/Sigma-AldrichZ683809
13.3% TCA solutionDilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubesMERCKBR780546-500EA
20 mM HClChem-Supply Pty Ltd7647-01-0Made from stock
20-200 µL micropipetteEpendorf/Sigma-AldrichZ740441
6 M HClChem-Supply Pty Ltd7647-01-0Made from stock
70% ethanolSupelco1.11727Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C FreezerMartin CHRIST102142Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit Waters186003836
AcetoneChem-Supply Pty Ltd34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporatorThermo Scientific13442549DNA120-115 SpeedVac Concentrator
CentrifugeMERCKEP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standardCDN IsotopesD-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis KitPhenomenexCEO-8492
Falcon tube holder
Falcon TubesMERCKT2318-500EAGreiner centrifuge tubes
Filter TubesSigma-AldrichCLS8161-100EACorning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & LidEldex Laboratories/WatersWAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipeKimwipes/Sigma-AldrichZ188956
Milli-Q water18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 MicropipetteMERCKEP3123000063
P1000 pipette tipsMERCKZ740127
P200 MicropipetteMERCKEP3123000055-1EA
P200 pipette tipsMERCKZ740125
ParafilmMERCKP7793Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicatorQSONICA SonicatorsQ125 SonicatorPlease ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma-AldrichT6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

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