Un modèle de roue de roulement simple et peu coûteux pour l’entraînement progressif en résistance chez la souris

Résumé

Cette procédure décrit un modèle d’entraînement de résistance de roue à charge progressive traduisible chez la souris. Le principal avantage de ce modèle d’entraînement en résistance est qu’il est entièrement volontaire, réduisant ainsi le stress pour les animaux et le fardeau du chercheur.

Résumé

Les modèles d’exercices basés sur la résistance des rongeurs précédemment développés, y compris l’ablation synergique, la stimulation électrique, l’escalade d’échelles lestées et, plus récemment, la traction de traîneau lesté, sont très efficaces pour fournir un stimulus hypertrophique pour induire des adaptations musculaires squelettiques. Bien que ces modèles se soient révélés inestimables pour la recherche sur les muscles squelettiques, ils sont soit invasifs, soit involontaires et nécessitent beaucoup de main-d’œuvre. Heureusement, de nombreuses souches de rongeurs courent volontairement de longues distances lorsqu’on leur donne accès à une roue de course. Les modèles de course à roues chargées (LWR) chez les rongeurs sont capables d’induire des adaptations couramment observées avec l’entraînement en résistance chez l’homme, telles que l’augmentation de la masse musculaire et l’hypertrophie des fibres, ainsi que la stimulation de la synthèse des protéines musculaires. Cependant, l’ajout d’une charge modérée sur les roues ne dissuade pas les souris de courir sur de grandes distances, ce qui reflète davantage un modèle d’entraînement d’endurance / résistance, ou les souris cessent presque entièrement de courir en raison de la méthode d’application de la charge. Par conséquent, un nouveau modèle de roue à charge élevée (HLWR) a été développé pour les souris où la résistance externe est appliquée et progressivement augmentée, permettant aux souris de continuer à courir avec des charges beaucoup plus élevées que celles utilisées auparavant. Les résultats préliminaires de ce nouveau modèle HLWR suggèrent qu’il fournit un stimulus suffisant pour induire des adaptations hypertrophiques au cours du protocole d’entraînement de 9 semaines. Ici, les procédures spécifiques pour exécuter ce modèle d’entraînement progressif simple mais peu coûteux basé sur la résistance chez la souris sont décrites.

Introduction

La masse musculaire squelettique représente environ 40% de la masse corporelle chez les humains adultes; Ainsi, le maintien de la masse musculaire squelettique tout au long de la vie est essentiel. La masse musculaire squelettique joue un rôle essentiel dans le métabolisme énergétique, le maintien de la température corporelle centrale et l’homéostasie du glucose¹. Le maintien du muscle squelettique est un équilibre entre la synthèse des protéines et la dégradation des protéines, mais de nombreuses lacunes existent encore dans la compréhension des mécanismes moléculaires complexes qui conduisent ces processus. Pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent le maintien et la croissance de la masse musculaire, les modèles de recherche de sujets humains utilisent souvent des interventions basées sur l’exercice de résistance, car les stimuli mécaniques jouent un rôle essentiel dans la régulation de la masse musculaire squelettique. Bien que la recherche sur des sujets humains ait été couronnée de succès, le temps nécessaire pour présenter des adaptations et des préoccupations éthiques concernant les procédures invasives (c.-à-d. les biopsies musculaires) limite la quantité de données qui peuvent être obtenues. Alors que les adaptations à l’exercice de résistance sont assez omniprésentes chez les espèces de mammifères, les modèles animaux offrent l’avantage de pouvoir contrôler avec précision le régime alimentaire et le régime d’exercice tout en permettant la collecte de tissus entiers dans tout le corps, tels que le cerveau, le foie, le cœur et les muscles squelettiques.

De nombreux modèles d’entraînement en résistance ont été développés pour être utilisés chez les rongeurs : ablation synergique², stimulation électrique^3,4, escalade d’échelle^{lestée 5,} traîneau lesté^{tirant 6} et squat en toile⁷. Il est évident que tous ces modèles, s’ils sont effectués correctement, peuvent être des modèles efficaces pour induire des adaptations des muscles squelettiques, telles que l’hypertrophie. Cependant, les inconvénients de ces modèles sont qu’ils sont pour la plupart involontaires, ne font pas partie du comportement normal des rongeurs, exigent beaucoup de temps et de main-d’œuvre et sont invasifs.

Heureusement, de nombreuses souches de souris et de rats courent volontairement de longues distances lorsqu’elles ont accès à une roue de course. De plus, les modèles d’exercices à roue libre (FWR) ne reposent pas sur un conditionnement intensif, un renforcement positif / négatif ou une anesthésie pour forcer le mouvement ou l’activité musculaire ^8,9. L’activité de course dépend grandement de la souche de la souris, du sexe, de l’âge et d’une base individuelle. Lightfoot et al. ont comparé l’activité de course de 15 souches de souris différentes et ont constaté que la distance de course quotidienne varie de 2,93 km à 7,93 km, les souris C57BL / 6 courant le plus loin, quel que soit leur sexe¹⁰. Le FWR est communément accepté comme un excellent modèle pour induire des adaptations d’endurance dans les muscles squelettiques et cardiaques 11,12,13,14,15,16; Cependant, l’utilisation de la course sur roues dans les modèles d’entraînement en résistance est moins couramment étudiée.

Comme on pourrait s’en douter, l’effet hypertrophique de la course des roues pourrait être augmenté en ajoutant une résistance à la roue de roulement, appelée course de roue chargée (LWR), nécessitant ainsi plus d’efforts pour courir sur la roue afin d’imiter plus étroitement l’entraînement de résistance. En utilisant diverses méthodes d’application de la charge, des études antérieures ont démontré que le modèle LWR utilisant des rats et des souris affichait régulièrement des augmentations de la masse musculaire des membres de 5% à 30% en 6-8 semaines 17,18,19,20,21. De plus, D’hulst et al. ont démontré qu’un seul épisode de LWR entraînait une augmentation de 50% plus importante de l’activation de la voie de signalisation de la synthèse des protéines par rapport au FWR²². La résistance des roues a été le plus souvent appliquée par une méthode de friction à charge constante, dans laquelle un frein magnétique ou un boulon de tension est utilisé pour appliquer la résistance des roues 12,19,23,24. Une mise en garde de la méthode à charge constante basée sur le frottement est que lorsque la résistance modérée à élevée est appliquée, l’animal ne peut pas surmonter la résistance élevée pour initier le mouvement de la roue, cessant ainsi l’entraînement. Plus important encore, bon nombre des systèmes de cages et de roues utilisés pour les modèles de roues de roulement de rongeurs sont assez coûteux et nécessitent un équipement spécialisé.

Récemment, Dungan et al. ont développé un modèle PoWeR (Progressive Weighted-Wheel-running), qui applique une charge à la roue de manière asymétrique via des masses externes collées à un seul côté de la roue. On pense que la charge de roue déséquilibrée et la résistance variable du modèle PoWeR encouragent la poursuite de l’activité de course et favorisent des rafales plus courtes de roue chargée chez la souris, imitant plus fidèlement les ensembles et les répétitions effectués avec l’entraînement en résistance¹⁷. Malgré une distance moyenne de course de 10 à 12 km par jour, le modèle PoWeR a entraîné une augmentation de 16 % et 17 % de la masse humide du muscle plantaire et de la section transversale des fibres (CSA), respectivement. Malgré de nombreux avantages pratiques, le modèle PoWeR de LWR présente certaines limites. Comme l’ont reconnu les auteurs, le modèle PoWeR est un stimulus « hybride » à volume élevé qui reflète un modèle mixte d’exercices d’endurance et de résistance (c.-à-d. un entraînement simultané chez les humains), par opposition à un modèle plus strictement basé sur l’exercice de résistance, introduisant potentiellement un effet d’interférence et contribuant à l’hypertrophie moins prononcée ou aux différents mécanismes par lesquels l’hypertrophie est induite²⁵ . Il est impératif de s’assurer qu’un phénomène d’entraînement simultané ne se produit pas dans ce qui est censé être un modèle d’entraînement d’exercices de résistance. Par conséquent, le modèle PoWeR a été modifié pour développer un modèle LWR qui utilise des charges plus élevées que celles utilisées précédemment pour ressembler davantage à un modèle d’entraînement en résistance. Ici, des détails sont fournis pour un modèle LWR d’entraînement en résistance progressive simple et peu coûteux de 9 semaines chez des souris C57BL / 6.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Appalachian State University (#22-05).

1. Animaux

1. Procurez-vous des souris C57BL/6 provenant de la colonie de souris interne.
   REMARQUE : Des souris mâles âgées de 5 à 8 mois au début de l’étude ont été utilisées. L’activité quotidienne de course atteint des sommets et des plateaux vers l’âge de 9 à 10 semaines de²⁶ ans. Des études antérieures ont démontré que les souris âgées (22-24 mois) effectueront également une roue chargée²⁷.
2. Entreposer les souris individuellement dans une cage standard pour rongeurs munie d’un couvercle métallique et maintenir la cage dans un environnement contrôlé (20-24 °C avec un cycle lumière:obscurité de 12:12 h).
3. Fournir du chow standard pour rongeurs et de l’eau ad libitum.

2. Appareil de roue de roulement

1. Configuration des roues de course:
   REMARQUE: Les roues de roulement sont assemblées / configurées de la même manière pour tous les protocoles de fonctionnement, à l’exception de l’ajout d’aimants de charge de 1 g ou 2,5 g.
   1. Collez un seul aimant capteur de 1 g sur la circonférence médiane extérieure de la roue de roulement (Figure 1).
   2. Utilisez cette roue avec un seul aimant de capteur de 1 g pour la première semaine d’acclimatation de la roue.
   3. Roue chargée en marche (LWR; protocole de chargement identique à PoWeR¹⁷): Suivez les étapes 2.1.4-2.1.6.
   4. La semaine 2 pour les REL nécessite 2 g de charge (voir tableau 1).
   5. Collez deux aimants de 1 g côte à côte sur la circonférence extérieure de la roue (figure 2A).
      REMARQUE: Ici, il est utile d’utiliser du ruban adhésif pour maintenir les aimants en place jusqu’à ce que la colle sèche fermement; Sinon, ils peuvent être attirés par l’aimant du capteur et se déloger.
   6. Appliquez une charge supplémentaire au cours des semaines 3, 4 et 6 en plaçant un autre aimant de 1 g sur l’un des aimants déjà présents.
      REMARQUE: Aucune colle n’est nécessaire car les aimants adhèrent fermement les uns aux autres. Par exemple, avec 6 g de charge au cours de la semaine 6, les aimants seront empilés chacun à trois hauteurs (figure 2B).
   7. Roue à haute charge (HLWR) : Suivez les étapes 2.1.8 à 2.1.11.
      REMARQUE: Le protocole HLWR nécessite trois jeux de roues. L’assemblage de différents ensembles de roues permet au chercheur de réutiliser les configurations de roues pour d’autres souris une fois que la roue est soigneusement nettoyée et désinfectée (le nombre de chaque jeu doit être déterminé par le chercheur en fonction de la taille de la cohorte / du groupe).
   8. Le premier jeu de roues (requis pour la semaine 2 seulement) aura un seul aimant de 2,5 g; coller (voir le NOTA ci-dessous Étape 2.1.5) un aimant de 2,5 g sur la circonférence extérieure de la roue (figure 3A).
   9. Le deuxième jeu de roues (requis pour la semaine 3 seulement) aura deux aimants de 2,5 g; coller (voir le NOTA ci-dessous Étape 2.1.5) deux aimants de 2,5 g côte à côte sur la circonférence extérieure de la roue (figure 3B).
   10. Le troisième jeu de roues (requis pour la semaine 4 et au-delà) aura trois aimants de 2,5 g côte à côte; coller (voir le NOTA ci-dessous Étape 2.1.5) trois aimants de 2,5 g côte à côte sur la circonférence extérieure de la roue (figure 3C).
   11. Appliquez une charge supplémentaire pendant les semaines 6 et 8 en plaçant un autre aimant de 2,5 g sur l’un ou l’autre des aimants déjà présents (figures 3D, E).

Figure 1 : Roue de roulement de base avec un seul aimant à capteur de 1 g collé à la circonférence extérieure médiane de la roue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Roue de roulement chargée (REL) avec aimant capteur et aimants de chargement de 1 g. A) Exemple de 2 g de charge, deux aimants de 1 g collés côte à côte au bord extérieur de la roue; (B) exemple de 6 g de charge, deux aimants de 1 g collés côte à côte au bord extérieur de la roue avec 4 g supplémentaires de charge appliquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Roue de roulement à haute charge (HLWR) avec aimant capteur et aimants de chargement de 2,5 g. (A) exemple de charge de 2,5 g, un aimant de 2,5 g collé au bord extérieur de la roue; (B) exemple de 5 g de charge, deux aimants de 2,5 g collés côte à côte au bord extérieur de la roue; (C) exemple de 7,5 g de charge, trois aimants de 2,5 g collés côte à côte au bord extérieur de la roue; D) exemple de 10 g de charge, trois aimants de 2,5 g collés côte à côte au bord extérieur de la roue, avec 2,5 g de charge supplémentaire appliquée; (E) exemple de 12,5 g de charge, trois aimants de 2,5 g collés côte à côte au bord extérieur de la roue, avec 5 g de charge supplémentaires appliqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Assemblage de cage

1. Assemblez les roues de course à l’aide d’une cage équipée d’un compteur de vélo numérique pour surveiller le temps d’exercice (h) et la distance parcourue (km). La vitesse moyenne (km/h) est calculée arithmétiquement.
   1. Assurez-vous qu’une batterie neuve est insérée dans l’ordinateur de vélo avant l’assemblage.
   2. Régler la taille des roues lors de la programmation initiale de l’ordinateur de vélo (voir les instructions du fabricant); calculer la distance par tour en mesurant la circonférence extérieure de la roue de roulement (par exemple, 3 580 mm pour le type de roue utilisé ici).
2. Placez le capteur de l’ordinateur de vélo dans une surface solide à l’extérieur du couvercle de la cage, directement au-dessus de l’emplacement de l’aimant du capteur de la roue. Assurez-vous que tous les composants de l’ordinateur et du capteur sont contenus dans une barrière solide à l’extérieur de la cage pour empêcher les souris de mâcher les composants.
   1. Utilisez le couvercle d’une boîte de pointe de pipette vide avec un petit rectangle découpé pour le capteur magnétique du vélo et la partie principale de la boîte (avec la grille de support de pointe retirée) pour contenir l’ordinateur de vélo et le fil (Figure 4A).
   2. Percez deux trous dans les coins de la surface solide pour fixer le capteur magnétique du vélo et le support de roue de roulement en place à l’extérieur de la cage (figure 4A).
3. Insérez l’empattement de roulement, à l’envers, à travers les interstices du couvercle de la cage, mais au-dessus de la surface solide décrite à l’étape 3.2 (figure 4B).
   1. Fixez l’empattement et le capteur informatique au sommet de la cage à l’aide de matériel (Figure 4C, D).
4. Assurez-vous que l’aimant du capteur et le capteur de l’ordinateur ne sont pas espacés de plus de 1 cm pour permettre un enregistrement correct du mouvement des roues (la plupart des capteurs standard de l’ordinateur de vélo sont bidirectionnels et enregistreront le mouvement positif de la roue dans les deux sens de rotation).
5. Fixez la roue de roulement appropriée (comme décrit ci-dessus) à l’empattement à partir de l’intérieur du couvercle de la cage et placez solidement le couvercle sur la cage (figure 4E, F).
6. Avec la roue suspendue au couvercle de la cage, assurez-vous d’au moins 2,5 cm de dégagement du sol de la cage. Placez une quantité minimale de matériau de litière dans la cage pour vous assurer que la roue tourne librement, mais ne soit pas gênée par l’accumulation de litière.
7. Pendant l’expérimentation, enregistrez les données de l’ordinateur de vélo à intervalles réguliers pour assurer une surveillance précise de l’activité.
   1. Reconnaître que les souris sont une espèce nocturne; Par conséquent, la majeure partie de leur activité naturelle en cage (y compris le fonctionnement des roues) sera effectuée pendant les heures sombres du cycle lumineux.

Figure 4 : Ensemble cage de roue de roulement. A) Ordinateur de vélo et capteur magnétique placés dans une surface solide/plateau; (B) empattement inversé placé au-dessus de la surface solide/plateau et du capteur (vue de dessus; notez les deux trous dans la surface/le plateau du capteur pour fixer la base au couvercle de la cage avec le matériel), (C) empattement inversé avec matériel assemblé (vue de bas); D) empattement inversé avec quincaillerie assemblée (vue de dessus); E) ensemble cage complet (vue de dessus); et (F) ensemble cage complet (vue latérale). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Protocoles de chargement de l’entraînement à l’exercice

1. Hébergez individuellement des souris sédentaires (SED) pendant 9 semaines dans une cage contenant une roue de course verrouillée pour empêcher toute course.
   REMARQUE : Le tableau 1 présente le calendrier de chargement des protocoles LWR (PoWeR) et HLWR utilisés dans la conception expérimentale.
2. Réduire la charge pour les groupes LWR et HLWR, si nécessaire, pour s’assurer que les souris continuent à faire de l’exercice pendant tout le protocole de 9 semaines.

		Semaine
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
REL (n = 4)	Charge (g)	0.0	2.0	3.0	4.0	5.0	5.0	6.0	6.0	6.0
	%BM	--	8%	11%	15%	19%	19%	23%	23%	23%
HLWR (n = 7)	Charge (g)	0.0	2.5	5.0	7.5	7.5	10.0	10.0	12.5	12.5
	%BM	--	10%	19%	28%	28%	38%	38%	48%	48%

Tableau 1. Protocoles de fonctionnement des roues chargées

5. Tests de la fonction musculaire in situ, prélèvement de tissus et analyse tissulaire

1. Après l’intervention de formation de 9 semaines, anesthésier les souris en utilisant de l’isoflurane inhalé (induction de 4 %; 2 % d’entretien) avec de l’oxygène supplémentaire et assurer une surveillance adéquate du plan anesthésique tout au long de la procédure.
2. Effectuer un test de la fonction musculaire in situ sur le complexe gastrocnémien, plantaris, soléaire (GPS) pour tester la force musculaire isométrique²⁸. Établir une courbe force-fréquence en stimulant directement le nerf sciatique avec des aiguilles d’électrode de 27 G à 11 fréquences ascendantes entre 1-300 Hz, avec des contractions tétaniques se produisant autour de 100-150^{Hz 29}.
3. Immédiatement après le test de la fonction musculaire, euthanasier les souris par luxation cervicale et confirmer l’euthanasie en retirant le cœur. Irritez soigneusement les muscles plantaires et soléaires et notez la masse de tissu humide.
4. Enduisez chaque échantillon musculaire d’un milieu d’incorporation (OCT) et montez-le sur un bouchon. Congelez-le dans de l’isopentane liquide refroidi à l’azote et conservez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’une analyse immunohistochimique (IHC) soit effectuée sur des sections de tissu musculaire (10 μm d’épaisseur).
5. Analyser l’ASC des fibres musculaires en utilisant l’immunofluorescence pour la laminine. Mesurer l’ASC de la fibre à l’aide d’une plateforme automatique de quantification d’images³⁰.

6. Analyse statistique

1. Exprimez toutes les données sous forme de moyenne ± écart-type.
2. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique dont la signification est fixée à p ≤ 0,05.
3. Comparez les données de fonctionnement des roues et de volume d’entraînement avec des ANOVA bidirectionnelles à mesures répétées.
4. Comparez la masse corporelle, la masse tissulaire, l’ASC et la fonction musculaire avec une ANOVA unidirectionnelle. Si des rapports F significatifs sont trouvés, comparer les différences au sein du groupe à l’aide d’analyses post hoc du LSD de Fisher.
5. Calculez les tailles d’effet, puis interprétez-les comme 0,01, 0,06 et 0,14 pour les petites, moyennes et grandes tailles d’effet, respectivement.

Résultats

Dans cette étude, 24 souris C57BL/6 (6,3 ± 0,7 mois au début de cette étude) ont été assignées au hasard à l’un des trois groupes de traitement : sédentaire (SED), roulant à roues chargées (LWR; identique à PoWeR décrit par Dungan et ^coll.17) ou LWR élevé (HLWR), puis ont complété leur protocole respectif de 9 semaines. Après la semaine d’acclimatation (semaine 1), il n’y avait pas de différence de temps entre le groupe ou le groupe x en ce qui concerne la distance de cour...

Discussion

Les modèles d’exercices de résistance existants chez les rongeurs se sont révélés inestimables pour la recherche sur les muscles squelettiques; Cependant, bon nombre de ces modèles sont invasifs, involontaires et/ou exigent beaucoup de temps et de main-d’œuvre. LWR est un excellent modèle qui induit non seulement des adaptations musculaires similaires à celles observées dans d’autres modèles d’entraînement en résistance bien acceptés, mais fournit également un stimulus d’exercice chronique et peu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND018-6	Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading
2.5 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND022	Used for 2.5 g increments of wheel loading
8-32 x 1" stainless steel screws	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
8-32 Wing Nuts	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
10 µL pipette tip box (empty)	Thermo Scientific	2140	We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice
Extreme Liquid Glue	Loctite
Laminin primary antibody	Novus Biologicals	NB300-144AF647	primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum
Lithium 3 V battery	n/a	CR2032
M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
MyoVision: Automated Image Quantification Platform	Wen et al. (2017)	v1.0	https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision
Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid	Orchid Scientific	Polycarbonate Rat Cage Type II	https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa
Sigma Sport 509 Bike Computer	Sigma Sport		Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities
Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm)	Kaytee	SKU# 100079369	https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel