Un modello di ruota da corsa semplice ed economico per l'allenamento di resistenza progressivo nei topi

Riepilogo

Questa procedura descrive un modello di allenamento di resistenza della ruota da corsa traducibile a carico progressivo nei topi. Il vantaggio principale di questo modello di allenamento di resistenza è che è interamente volontario, riducendo così lo stress per gli animali e l'onere per il ricercatore.

Abstract

I modelli di esercizi basati sulla resistenza dei roditori sviluppati in precedenza, tra cui l'ablazione sinergica, la stimolazione elettrica, l'arrampicata su scala ponderata e, più recentemente, la trazione con slitta ponderata, sono altamente efficaci nel fornire uno stimolo ipertrofico per indurre adattamenti muscolari scheletrici. Mentre questi modelli si sono dimostrati preziosi per la ricerca sui muscoli scheletrici, sono invasivi o involontari e ad alta intensità di lavoro. Fortunatamente, molti ceppi di roditori corrono volontariamente lunghe distanze quando hanno accesso a una ruota da corsa. I modelli LWR (Loaded Wheel Running) nei roditori sono in grado di indurre adattamenti comunemente osservati con l'allenamento di resistenza negli esseri umani, come l'aumento della massa muscolare e l'ipertrofia delle fibre, nonché la stimolazione della sintesi proteica muscolare. Tuttavia, l'aggiunta di un carico moderato della ruota non riesce a dissuadere i topi dal correre grandi distanze, il che riflette maggiormente un modello di allenamento di resistenza / resistenza, oppure i topi smettono di correre quasi interamente a causa del metodo di applicazione del carico. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo modello HLWR (High-Load Wheel Running) per i topi in cui viene applicata e progressivamente aumentata la resistenza esterna, consentendo ai topi di continuare a funzionare con carichi molto più elevati rispetto a quelli utilizzati in precedenza. I risultati preliminari di questo nuovo modello HLWR suggeriscono che fornisce uno stimolo sufficiente per indurre adattamenti ipertrofici nel corso del protocollo di allenamento di 9 settimane. Qui, vengono descritte le procedure specifiche per eseguire questo semplice ma economico modello di allenamento progressivo basato sulla resistenza nei topi.

Introduzione

La massa muscolare scheletrica comprende circa il 40% della massa corporea negli esseri umani adulti; Pertanto, mantenere la massa muscolare scheletrica per tutta la vita è fondamentale. La massa muscolare scheletrica svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo energetico, nel mantenimento della temperatura corporea interna e nell'omeostasi del glucosio¹. Il mantenimento del muscolo scheletrico è un equilibrio tra sintesi proteica e degradazione proteica, ma esistono ancora molte lacune nella comprensione degli intricati meccanismi molecolari che guidano questi processi. Per studiare i meccanismi molecolari che regolano il mantenimento e la crescita della massa muscolare, i modelli di ricerca dei soggetti umani impiegano spesso interventi basati su esercizi di resistenza, poiché gli stimoli meccanici svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della massa muscolare scheletrica. Mentre la ricerca sui soggetti umani ha avuto successo, il tempo necessario per mostrare adattamenti e preoccupazioni etiche riguardanti le procedure invasive (cioè le biopsie muscolari) limitano la quantità di dati che possono essere ottenuti. Mentre gli adattamenti all'esercizio di resistenza sono abbastanza onnipresenti tra le specie di mammiferi, i modelli animali offrono il vantaggio di essere in grado di controllare con precisione la dieta e il regime di esercizio, consentendo anche la raccolta di interi tessuti in tutto il corpo, come cervello, fegato, cuore e muscolo scheletrico.

Molti modelli di allenamento di resistenza sono stati sviluppati per l'uso nei roditori: ablazione sinergica², stimolazione elettrica ^3,4, salita ponderata 5^, slitta pesata 6 e accovacciata su tela⁷. È evidente che tutti questi modelli, se eseguiti correttamente, possono essere modelli efficaci per indurre adattamenti muscolari scheletrici, come l'ipertrofia. Tuttavia, le cadute di questi modelli sono che sono per lo più involontari, non fanno parte del normale comportamento dei roditori, richiedono tempo / lavoro e sono invasivi.

Fortunatamente, molti ceppi di topi e ratti corrono volontariamente lunghe distanze quando hanno accesso a una ruota da corsa. Inoltre, i modelli di esercizi con ruota libera (FWR) non si basano su condizionamento esteso, rinforzo positivo / negativo o anestesia per forzare il movimento o l'attività muscolare ^8,9. L'attività di corsa dipende molto dallo sforzo del topo, dal sesso, dall'età e da una base individuale. Lightfoot et al. hanno confrontato l'attività di corsa di 15 diversi ceppi di topi e hanno scoperto che la distanza di corsa giornaliera varia da 2,93 km a 7,93 km, con topi C57BL / 6 che corrono più lontano, indipendentemente dal sesso¹⁰. FWR è comunemente accettato come un modello eccellente per indurre adattamenti di resistenza nei muscoli scheletrici e cardiaci 11,12,13,14,15,16; Tuttavia, l'utilizzo della corsa a ruote nei modelli di allenamento di resistenza è meno comunemente studiato.

Come si potrebbe sospettare, l'effetto ipertrofico della corsa delle ruote potrebbe essere aumentato aggiungendo resistenza alla ruota da corsa, chiamata corsa a ruota caricata (LWR), richiedendo così maggiori sforzi per correre sulla ruota per imitare più da vicino l'allenamento di resistenza. Utilizzando vari metodi di applicazione del carico, studi precedenti hanno dimostrato che il modello LWR che utilizza ratti e topi mostrava abitualmente aumenti della massa muscolare degli arti del 5% -30% nel giro di 6-8 settimane 17,18,19,20,21. Inoltre, D'hulst et al. hanno dimostrato che un singolo attacco di LWR ha portato ad un aumento del 50% maggiore nell'attivazione della via di segnalazione della sintesi proteica rispetto a FWR²². La resistenza delle ruote è stata più comunemente applicata da un metodo di carico costante basato sull'attrito, in base al quale viene utilizzato un freno magnetico o un bullone di tensione per applicare la resistenza della ruota 12,19,23,24. Un avvertimento del metodo di carico costante basato sull'attrito è che quando viene applicata una resistenza da moderata ad alta, l'animale non può superare l'elevata resistenza per iniziare il movimento della ruota, interrompendo efficacemente l'allenamento. Ancora più importante, molti dei sistemi di gabbie e ruote utilizzati per i modelli di ruote da corsa per roditori sono piuttosto costosi e richiedono attrezzature specializzate.

Recentemente, Dungan et al. hanno sviluppato un modello progressivo di funzionamento ponderato della ruota (PoWeR), che applica un carico alla ruota in modo asimmetrico tramite masse esterne aderenti a un singolo lato della ruota. Si ritiene che il carico sbilanciato della ruota e la resistenza variabile del modello PoWeR incoraggino l'attività di corsa continua e promuovano raffiche più brevi di ruota caricata nei topi, imitando più da vicino le serie e le ripetizioni eseguite con l'allenamento di resistenza¹⁷. Nonostante la distanza media di corsa sia di 10-12 km al giorno, il modello PoWeR ha prodotto un aumento rispettivamente del 16% e del 17% della massa umida muscolare plantare e dell'area della sezione trasversale delle fibre (CSA). Nonostante molti vantaggi pratici, il modello PoWeR di LWR ha alcune limitazioni. Come riconosciuto dagli autori, il modello PoWeR è uno stimolo "ibrido" ad alto volume che riflette un modello di esercizio misto di resistenza / resistenza (cioè allenamento simultaneo negli esseri umani), al contrario di un modello più strettamente basato sull'esercizio di resistenza, introducendo potenzialmente un effetto di interferenza e contribuendo all'ipertrofia meno pronunciata o ai diversi meccanismi con cui viene indotta l'ipertrofia²⁵ . Garantire che un fenomeno di allenamento simultaneo non si verifichi in quello che dovrebbe essere un modello di allenamento con esercizi di resistenza è imperativo. Pertanto, il modello PoWeR è stato modificato per sviluppare un modello LWR che utilizza carichi più elevati rispetto a quelli precedentemente utilizzati per assomigliare più da vicino a un modello di allenamento di resistenza. Qui, vengono forniti i dettagli per un modello LWR di allenamento progressivo di resistenza semplice ed economico di 9 settimane nei topi C57BL / 6.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Appalachian State University (# 22-05).

1. Animali

1. Procuratevi topi C57BL/6 dalla colonia di topi interna.
   NOTA: Sono stati utilizzati topi maschi di 5-8 mesi di età all'inizio dello studio. L'attività di corsa quotidiana raggiunge picchi e plateau intorno alle 9-10 settimane di età²⁶. Studi precedenti hanno dimostrato che i topi anziani (22-24 mesi) eseguono anche ruote caricate²⁷.
2. Ospitare i topi singolarmente in una gabbia standard per roditori con coperchio metallico e mantenere la gabbia in un ambiente controllato (20-24 °C con un ciclo luce:buio di 12:12 h).
3. Fornire chow standard per roditori e acqua ad libitum.

2. Apparato a ruota rotante

1. Configurazione della ruota da corsa:
   NOTA: Le ruote da corsa sono assemblate/configurate in modo simile per tutti i protocolli di corsa, ad eccezione dell'aggiunta di magneti di carico da 1 g o 2,5 g.
   1. Incollare un singolo magnete con sensore da 1 g alla circonferenza centrale esterna della ruota di corsa (Figura 1).
   2. Utilizzare questa ruota con un singolo magnete con sensore da 1 g solo per la prima settimana di acclimatazione della ruota.
   3. Funzionamento della ruota caricata (LWR; protocollo di caricamento identico a PoWeR¹⁷): seguire i passaggi 2.1.4-2.1.6.
   4. La settimana 2 per LWR richiede 2 g di carico (vedere Tabella 1).
   5. Incollare due magneti da 1 g affiancati sulla circonferenza esterna della ruota (Figura 2A).
      NOTA: Qui, è utile usare del nastro adesivo per tenere i magneti in posizione fino a quando la colla non si asciuga saldamente; In caso contrario, potrebbero essere attratti dal magnete del sensore e staccarsi.
   6. Applicare un carico aggiuntivo nelle settimane 3, 4 e 6 posizionando un altro magnete da 1 g sopra uno dei magneti già presenti.
      NOTA: Non è necessaria alcuna colla poiché i magneti aderiscono saldamente l'uno all'altro. Ad esempio, con 6 g di carico nella settimana 6, i magneti saranno impilati ciascuno a tre altezze (Figura 2B).
   7. Funzionamento delle ruote ad alto carico (HLWR): seguire i passaggi 2.1.8-2.1.11.
      NOTA: il protocollo HLWR richiede tre set di ruote. L'assemblaggio di diversi set di ruote consente al ricercatore di riutilizzare le configurazioni delle ruote per altri topi una volta che la ruota è stata accuratamente pulita e disinfettata (i numeri di ciascun set dovrebbero essere determinati dal ricercatore in base alle dimensioni della coorte / gruppo).
   8. Il primo set di ruote (richiesto solo per la settimana 2) avrà un singolo magnete da 2,5 g; colla (fare riferimento alla NOTA sotto Passo 2.1.5) un magnete da 2,5 g sulla circonferenza esterna della ruota (Figura 3A).
   9. Il secondo set di ruote (richiesto solo per la settimana 3) avrà due magneti da 2,5 g; colla (fare riferimento alla NOTA sotto il punto 2.1.5) due magneti da 2,5 g affiancati sulla circonferenza esterna della ruota (Figura 3B).
   10. Il terzo set di ruote (richiesto per la settimana 4 e oltre) avrà tre magneti da 2,5 g affiancati; colla (fare riferimento alla NOTA sotto il punto 2.1.5) tre magneti da 2,5 g affiancati sulla circonferenza esterna della ruota (Figura 3C).
   11. Applicare un carico supplementare per le settimane 6 e 8 posizionando un altro magnete da 2,5 g sopra uno dei magneti già presenti (Figure 3D, E).

Figura 1: Ruota da corsa di base con un singolo magnete sensore da 1 g incollato alla circonferenza esterna centrale della ruota. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Ruota di corsa caricata (LWR) con magnete sensore e magneti di carico da 1 g. (A) Esempio di 2 g di carico, due magneti da 1 g incollati fianco a fianco al bordo esterno della ruota; (B) esempio di 6 g di carico, due magneti da 1 g incollati fianco a fianco al bordo esterno della ruota con un carico supplementare di 4 g applicato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Ruota di corsa ad alto carico (HLWR) con magnete sensore e magneti di caricamento da 2,5 g. (A) esempio di 2,5 g di carico, un magnete da 2,5 g incollato al bordo esterno della ruota; (B) esempio di 5 g di carico, due magneti da 2,5 g incollati fianco a fianco al bordo esterno della ruota; (C) esempio di 7,5 g di carico, tre magneti da 2,5 g incollati fianco a fianco al bordo esterno della ruota; (D) esempio di 10 g di carico, tre magneti da 2,5 g incollati uno accanto all'altro sul bordo esterno della ruota, con un carico supplementare di 2,5 g applicato; (E) esempio di 12,5 g di carico, tre magneti da 2,5 g incollati uno accanto all'altro sul bordo esterno della ruota, con un carico aggiuntivo di 5 g applicato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Assemblaggio della gabbia

1. Assemblare le ruote da corsa utilizzando una gabbia dotata di un computer digitale per biciclette per monitorare il tempo di esercizio (h) e la distanza percorsa (km). La velocità media (km/h) è derivata aritmeticamente.
   1. Assicurarsi che una batteria nuova sia inserita nel computer della bicicletta prima del montaggio.
   2. Impostare le dimensioni delle ruote durante la programmazione iniziale del computer della bicicletta (vedere le istruzioni del produttore); Calcolare la distanza di ogni giro misurando la circonferenza esterna della ruota di corsa (ad esempio, 3.580 mm per il tipo di ruota utilizzato nel presente documento).
2. Posizionare il sensore del computer per biciclette all'interno di una superficie solida all'esterno del coperchio della gabbia, direttamente sopra il punto in cui si trova il magnete del sensore della ruota. Assicurarsi che tutti i componenti del computer e dei sensori siano contenuti all'interno di una barriera solida all'esterno della gabbia per impedire ai topi di masticare i componenti.
   1. Utilizzare il coperchio di una scatola di punta per pipette vuota con un piccolo rettangolo ritagliato per far risiedere il sensore magnetico della bicicletta e la parte principale della scatola (con la griglia del portapacchi rimossa) per contenere il computer e il filo della bicicletta (Figura 4A).
   2. Praticare due fori attraverso gli angoli della superficie solida per fissare il sensore magnetico della bici e il supporto della ruota di corsa all'esterno della gabbia (Figura 4A).
3. Inserire l'interasse della ruota di rotolamento, capovolto, attraverso gli spazi vuoti nel coperchio della gabbia, ma sopra la superficie solida descritta al punto 3.2 (Figura 4B).
   1. Fissare l'interasse e il sensore del computer sulla parte superiore della gabbia con l'hardware (Figura 4C, D).
4. Assicurarsi che il magnete del sensore e il sensore del computer siano distanziati di non più di 1 cm per consentire una corretta registrazione del movimento delle ruote (la maggior parte dei sensori standard del computer per biciclette sono bidirezionali e registreranno il movimento positivo della ruota in entrambe le direzioni di rotazione).
5. Fissare la ruota di corsa appropriata (come descritto sopra) all'interasse dall'interno del coperchio della gabbia e posizionare saldamente il coperchio sulla gabbia (Figura 4E, F).
6. Con la ruota appesa al coperchio della gabbia, assicurarsi di almeno 2,5 cm di spazio dal pavimento della gabbia. Posizionare una quantità minima di materiale per la lettiera nella gabbia per assicurarsi che la ruota giri liberamente ma non venga ostacolata dall'accumulo di lettiera.
7. Durante la sperimentazione, registrare i dati dal computer della bicicletta a intervalli coerenti per garantire un monitoraggio accurato dell'attività.
   1. Riconoscere che i topi sono una specie notturna; Pertanto, la maggior parte della loro naturale attività in gabbia (compresa la corsa delle ruote) verrà eseguita durante le ore buie del ciclo di luce.

Figura 4: Assemblaggio della gabbia della ruota di corsa. (A) Computer per biciclette e sensore magnetico collocati in superficie solida/vassoio; (B) interasse invertito posto sopra la superficie solida/vassoio e il sensore (vista dall'alto; notare i due fori nella superficie/vassoio del sensore per fissare la base al coperchio della gabbia con l'hardware), (C) interasse invertito con hardware assemblato (vista inferiore); (D) interasse invertito con hardware assemblato (vista dall'alto); (E) assemblaggio completo della gabbia (vista dall'alto); e (F) assemblaggio completo della gabbia (vista laterale). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Protocolli di carico dell'allenamento

1. Ospitare individualmente topi sedentari (SED) per 9 settimane in una gabbia contenente una ruota bloccata per impedire qualsiasi corsa.
   NOTA: la tabella 1 fornisce il programma di caricamento per i protocolli LWR (PoWeR) e HLWR utilizzati nel progetto sperimentale.
2. Ridurre il carico per i gruppi LWR e HLWR, se necessario, per garantire che i topi continuino ad allenarsi per l'intero protocollo di 9 settimane.

		Settimana
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
LWR (n = 4)	Carico (g)	0.0	2.0	3.0	4.0	5.0	5.0	6.0	6.0	6.0
	%BM	--	8%	11%	15%	19%	19%	23%	23%	23%
HLWR (n = 7)	Carico (g)	0.0	2.5	5.0	7.5	7.5	10.0	10.0	12.5	12.5
	%BM	--	10%	19%	28%	28%	38%	38%	48%	48%

Tabella 1. Protocolli di funzionamento delle ruote caricate

5. Test di funzionalità muscolare in situ , raccolta di tessuti e analisi dei tessuti

1. Dopo l'intervento di formazione di 9 settimane, anestetizzare i topi utilizzando isoflurano inalato (4% di induzione; 2% di mantenimento) con ossigeno supplementare e garantire un adeguato monitoraggio del piano anestetico durante tutta la procedura.
2. Eseguire un test di funzionalità muscolare in situ sul complesso gastrocnemio, plantaris, soleo (GPS) per testare la forza muscolare isometrica²⁸. Stabilire una curva forza-frequenza stimolando direttamente il nervo sciatico con aghi per elettrodi da 27 G a 11 frequenze ascendenti tra 1-300 Hz, con contrazioni tetaniche che si verificano intorno a 100-150 Hz²⁹.
3. Immediatamente dopo il test di funzionalità muscolare, eutanasia i topi tramite dislocazione cervicale e confermare l'eutanasia rimuovendo il cuore. Asportare con attenzione i muscoli plantari e solei e registrare la massa del tessuto bagnato.
4. Rivestire ogni campione muscolare in un mezzo di incorporamento (OCT) e montarlo su un tappo di sughero. Congelarlo in isopentano liquido raffreddato ad azoto e conservarlo a -80 °C fino a quando non vengono eseguite ulteriori analisi immunoistochimiche (IHC) su sezioni di tessuto muscolare (10 μm di spessore).
5. Analizzare la fibra muscolare CSA utilizzando l'immunofluorescenza per la laminina. Misurare la fibra CSA utilizzando una piattaforma di quantificazione automatica delle immagini³⁰.

6. Analisi statistica

1. Esprimere tutti i dati come media ± SD.
2. Eseguire analisi statistiche utilizzando software di analisi statistica con significatività impostata a p ≤ 0,05.
3. Confronta i dati relativi alla corsa delle ruote e al volume di allenamento con le misurazioni ripetute bidirezionali ANOVA.
4. Confronta la massa corporea, la massa tissutale, la CSA e la funzione muscolare con un ANOVA unidirezionale. Se vengono trovati rapporti F significativi, confrontare le differenze all'interno del gruppo utilizzando analisi post hoc dell'LSD di Fisher.
5. Calcola le dimensioni degli effetti, quindi interpretale come 0,01, 0,06 e 0,14 rispettivamente per le dimensioni degli effetti piccole, medie e grandi.

Risultati

In questo studio, 24 topi C57BL / 6 (6,3 ± 0,7 mesi all'inizio di questo studio) sono stati assegnati in modo casuale a uno dei tre gruppi di trattamento: sedentario (SED), caricato a ruota (LWR; come PoWeR descritto da Dungan et ^al.17) o alto LWR (HLWR), e quindi completato il rispettivo protocollo di 9 settimane. Dopo la settimana di acclimatazione (settimana 1), non ci sono state differenze di tempo del gruppo o del gruppo x nella distanza di corsa o nel volume di allenamento (

Discussione

I modelli di esercizi di resistenza esistenti nei roditori si sono dimostrati preziosi per la ricerca sui muscoli scheletrici; Tuttavia, molti di questi modelli sono invasivi, involontari e / o ad alta intensità di tempo e lavoro. LWR è un modello eccellente che non solo induce adattamenti muscolari simili a quelli osservati in altri modelli di allenamento di resistenza ben accettati, ma fornisce anche uno stimolo di esercizio cronico e a basso stress per l'animale con un impegno minimo di tempo / lavoro da parte del r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND018-6	Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading
2.5 g disc neodymium magnets	Applied Magnets	ND022	Used for 2.5 g increments of wheel loading
8-32 x 1" stainless steel screws	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
8-32 Wing Nuts	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
10 µL pipette tip box (empty)	Thermo Scientific	2140	We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice
Extreme Liquid Glue	Loctite
Laminin primary antibody	Novus Biologicals	NB300-144AF647	primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum
Lithium 3 V battery	n/a	CR2032
M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers	Amazon		https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1
MyoVision: Automated Image Quantification Platform	Wen et al. (2017)	v1.0	https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision
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