Développement de modèles de Drosophila melanogaster pour l’imagerie et le contrôle optogénétique de la fonction cardiaque

Résumé

Le présent protocole décrit la génération d’opsines de Drosophila melanogaster exprimant des opsines eNpHR2.0 ou ReaChR dans le cœur pour l’imagerie OCT et la stimulation cardiaque optogénétique. Des instructions détaillées pour l’imagerie de la TCO de la drosophile et la modulation des battements cardiaques, y compris la simulation d’un arrêt cardiaque réparable, d’une bradycardie et d’une tachycardie chez des animaux vivants à différents stades de développement, sont rapportées.

Résumé

L’utilisation de Drosophila melanogaster (mouche des fruits) comme organisme modèle a permis des progrès significatifs dans de nombreux domaines de la science biologique, de l’organisation cellulaire et des enquêtes génomiques aux études comportementales. En raison des connaissances scientifiques accumulées, ces dernières années, la drosophile a été amenée dans le domaine de la modélisation des maladies humaines, y compris les troubles cardiaques. Le travail présenté décrit le système expérimental de surveillance et de manipulation de la fonction cardiaque dans le contexte d’un organisme vivant entier utilisant la lumière rouge (617 nm) et sans procédures invasives. Le contrôle du cœur a été réalisé à l’aide d’outils optogénétiques. L’optogénétique combine l’expression d’opsines transgéniques sensibles à la lumière et leur activation optique pour réguler le tissu biologique d’intérêt. Dans ce travail, un système intégré personnalisé d’imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT) et de stimulation optogénétique a été utilisé pour visualiser et moduler le fonctionnement du cœur de D. melanogaster au stade larvaire du 3e stade et au début du développement nymphal. Le système génétique double UAS/GAL4 a été utilisé pour exprimer l’halorhodopsine (eNpHR2.0) et la channelrhodopsine décalée vers le rouge (ReaChR), en particulier dans le cœur de mouche. Des détails sur la préparation de D. melanogaster à l’imagerie OCT vivante et à la stimulation optogénétique sont fournis. Un logiciel d’intégration développé en laboratoire a traité les données d’imagerie pour créer des présentations visuelles et des caractéristiques quantitatives de la fonction cardiaque de la drosophile . Les résultats démontrent la faisabilité d’initier un arrêt cardiaque et une bradycardie causés par l’activation d’eNpHR2.0 et d’effectuer une stimulation cardiaque lors de l’activation de ReaChR.

Introduction

Fin 2010, la revue Nature Methods a sélectionné l’optogénétique comme méthode de l’année¹. L’utilisation d’outils génétiques (opsines transgéniques) régulées par la lumière pour contrôler les tissus biologiques d’intérêt avec une précision et une rapidité sans précédent a ouvert la voie à de nouvelles applications. À ce jour, la majorité des réalisations appartiennent aux neurosciences. La technologie a été introduite comme une nouvelle méthode de contrôle précis des neurones individuels² et a progressé vers des découvertes dans le domaine des fonctions cognitives des organismes vivants³. Dès le début, les neuroscientifiques ont démontré la capacité de moduler le comportement de l’organisme entier. L’expression et l’activation lumineuse de l’opsine ChR2 chez les neurones dopaminergiques de souris ont provoqué leur activation et ont été suffisantes pour conduire le conditionnement comportemental⁴. L’inhibition optogénétique d’un sous-ensemble de neurones contenant de l’halorhodopsine NpHR2.0 délivrée au foyer épileptique du cerveau des rongeurs a entraîné une atténuation des crises électroencéphalographiques⁵.

Les applications optogénétiques en cardiologie se développent à un rythme soutenu⁶. ChR2 a été exprimé avec succès dans la culture cellulaire de cardiomyocytes et chez la souris; La stimulation cardiaque a été réalisée par des éclairs de lumière bleue (réalisée à l’aide d’une fibre implantée chez des animaux vivants)⁷. Chez le poisson zèbre, ChR2 a été exprimé et utilisé pour identifier la région cardiaque qui fait le rythme; L’activation de la NpHR a provoqué un arrêt cardiaque⁸. La stimulation cardiaque optogénétique a le potentiel unique de développer de nouvelles thérapies de stimulation et de resynchronisation⁹. Des tentatives d’établissement d’un système de terminaison d’arythmie autogène ont également été signalées récemment¹⁰.

Des recherches approfondies et le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nécessitent l’application de divers systèmes modèles, de la culture cellulaire aux mammifères. Le cœur d’un vertébré est un organe très complexe. Les cardiomyocytes (CM) représentent un tiers de toutes les cellules cardiaques; Les autres cellules comprennent les neurones, les cellules musculaires lisses vasculaires et les cellules non excitables (c.-à-d. les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules immunitaires). La recherche sur la culture cellulaire CM limite la traduction des résultats obtenus aux applications médicales humaines. Les manipulations génétiques des organismes modèles de mammifères sont limitées et prennent beaucoup de temps. Les modèles d’invertébrés plus petits présentent de nombreux avantages; Leur système cardiovasculaire porte tous les éléments histologiques essentiels. Drosophila melanogaster (mouche des fruits) est un système de modèle génétique simple et puissant pour étudier le rôle des gènes associés aux maladies humaines, y compris les maladies cardiaques^11,12,13. En tant qu’animaux à courte durée de vie, les mouches des fruits représentent une excellente occasion de modéliser les changements de la fonction cardiaque liés à l’âge ou à la maladie qui peuvent être retracés tout au long de la vie^14,15,16,17. Le tube cardiaque de la mouche des fruits est situé sur la face dorsale de son corps à moins de 200 μm de la surface de la cuticule, permettant à la lumière visible à proche infrarouge d’atteindre le tube cardiaque. Cette caractéristique anatomique permet une stimulation optique non invasive du cœur de la drosophile à l’aide d’outils optogénétiques existants.

Pour surveiller le cœur de la drosophile, un système d’imagerie personnalisé de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) avec un module d’excitation LED à lumière rouge intégré a été développé¹⁸. Les changements morphologiques et rythmiques dans un cœur de mouche des fruits relativement simple peuvent être facilement analysés avec cette technologie d’imagerie biomédicale non invasive 12,19,20,21. Grâce à des performances de sectionnement optique améliorées et à une résolution spatiale à l’échelle du micron, l’OCT a été utilisée avec succès pour étudier la structure et surveiller la fonction du cœur de la drosophile à différents stades de développement, y compris la larve du 3ème stade et la pupe^{précoce 18}. Ce système permet également de surveiller et de stimuler simultanément l’état cardiaque de la drosophile chez l’animal intact. Une vue schématique du système de l’OPO est illustrée à la figure 1. Le système SD-OCT utilise une diode superluminescente (SLD) comme source lumineuse (longueur d’onde centrale : 850 nm ± 10 nm, FWHM : 165 nm, voir Tableau des matériaux). En utilisant une lentille d’objectif 10x, le système d’imagerie OCT peut atteindre une résolution axiale de ~4,4 μm dans l’air et ~3,3 μm dans les tissus et une résolution latérale de ~2,8 μm, suffisante pour résoudre les détails fins des structures cardiaques de la mouche^18,22. Les signaux d’interférence de la lumière réfléchie du bras de référence et du bras d’échantillonnage sont détectés à l’aide d’un spectromètre équipé d’une caméra à balayage linéaire de 2048 pixels (débit de ligne maximal : 80 kHz, voir le tableau des matériaux). La sensibilité du système mesurée est de ~95,1 dB. Chaque balayage OCT en mode B génère une image en coupe transversale dans le plan de l’image xz. Des images répétées en mode B sont acquises au même endroit pour créer des images en mode M capturant le cœur battant pendant plus de ~30 s 18,22,23. La fréquence d’images pour l’imagerie en mode M est de ~125 images / s, suffisante pour capturer la dynamique de battement du cœur de la mouche des fruits.

Pour la régulation optogénétique de la fonction cardiaque de la drosophile , un module d’éclairage avec une source lumineuse LED de 617 nm est intégré au bras échantillon du système SD-OCT. La lumière de stimulation est focalisée sur une tache de ~2,2 mm de diamètre sur la surface de l’échantillon, à la même position que la tache focale d’imagerie. Un logiciel personnalisé est utilisé pour contrôler le mode d’éclairage (intensité lumineuse, largeur d’impulsion et rapport cyclique), ajuster la fréquence de stimulation des impulsions lumineuses et synchroniser l’éclairage du module LED et l’acquisition d’images OCT en mode M²².

Des publications récentes ont décrit le système transgénique de la drosophile constitué d’opsines ChR2, ReaChR et eNpHR2.0 régulées spatio-temporellement en utilisant le système génétique UAS/GAL4. Les résultats obtenus ont démontré la capacité d’initier un arrêt cardiaque et une bradycardie causés par l’activation de la lumière rouge de l’eNpHR2.0 et une stimulation cardiaque à fréquence plus élevée causée par l’activation de la lumière bleue de ChR2. Des expériences de stimulation similaires ont été réalisées avec une autre channelrhodopsine, ReaChR, inductible par l’éclairage à la lumière rouge^22,23,24. L’expression de l’opsine dans toutes les expériences décrites a été déterminée par 24B-GAL4, où l’expression de l’opsine a été observée dans un large éventail de tissus, y compris les cardiomyocytes et les cellules musculaires environnantes. Dans la présente étude, le 24B-GAL4 a été remplacé par un pilote Hand-GAL4 pour obtenir une expression d’opsines eNpHR2.0 et ReaChR spécifique au cœur.

Dans l’ensemble, les résultats expérimentaux présentés démontrent un arrêt cardiaque réparateur et des affections cardiaques inductibles de bradycardie et de tachycardie. Un protocole détaillé avec des instructions étape par étape sur la création de modèles de drosophile transgénique et la réalisation simultanée d’expériences d’imagerie OCT et de stimulation optogénétique sur des animaux vivants est fourni.

Protocole

Pour la présente étude, la lignée transgénique eNpHR2.0 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgénique w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, et pilote GAL4 spécifique du cœur contenant le fragment régulateur du gène de la main w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (ce stock de pilotes sera indiqué comme Hand-GAL4) ont été utilisés. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 a été utilisé comme ligne de rapporteur GFP. Les stocks de drosophiles mentionnés ont été obtenus auprès du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, voir le tableau des matériaux) et maintenus à température ambiante ou à 18 °C sur des milieux de semoule de maïs standard. Les modèles de drosophile développés dans cette étude sont disponibles sur demande pour un travail collaboratif.

1. Croisements génétiques de drosophile et préparation des milieux

1. Changer le 3ème équilibreur chromosomique TM3 Sb[1] en TM6 Sb Tb, créant w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Voir la figure supplémentaire 1 pour le schéma de franchissement. Placer les croix dans des flacons avec des milieux de semoule de maïs ordinaires.
   REMARQUE : La présence d’un marqueur de la tuberculose permet aux utilisateurs de distinguer les larves et les pupes contenant le transgène de l’opsine et le pilote GAL4 des animaux contenant de l’opsine mais pas de pilote²⁵.
2. Conservez les croisements génétiques dans un incubateur à 25 °C, 70 % d’humidité sur un milieu contenant de la rétineI (ATR) entièrement trans (ATR) spécialement formulé (voir le tableau des matériaux) dans l’obscurité pendant 5 jours pour la collecte des larves et 6 jours pour la collecte des nymphes.
3. Combinez cinq femelles vierges Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb et deux à trois mâles provenant de stocks d’UAS-opsin (eNpHR2.0 ou ReaChR) par flacon. Voir le diagramme croisé pour l’opsine eNpHR2.0 et ReaChR à la figure 2A et à la figure 2B, respectivement.
4. Le lendemain, préparez des flacons contenant des ATR.
   1. Préparer des aliments semi-définis selon les instructions de BDSC²⁶. Au lieu de saccharose et de glucose, ajoutez uniquement du saccharose (5,14 g/100 mL). Refroidir à ~60 °C sous agitation constante.
   2. Préparer des flacons anti-mouches étroits et ajouter 50 μL de solution ATR-éthanol de 100 mM à chaque flacon.
   3. À l’aide d’une pipette sérologique, jeter la nourriture pour mouches dans des flacons étroits de mouches, 5 mL par flacon. Vortex à vitesse maximale pendant 10 s.
   4. Branchez les flacons et enveloppez-les dans le tissu foncé pour les protéger de la lumière. Laisser sécher les flacons pendant au moins 12 h (toute la nuit).
5. Le lendemain, transférez les mouches pondant régulièrement des œufs de l’étape 1.3. aux flacons contenant des aliments contenant de l’ATR (étape 1.4.4.). Protégez les racks avec des flacons de la lumière.
6. Après 24-48 h (en fonction du nombre d’œufs pondus), jetez les parents pour éviter la surpopulation des flacons.
7. Recueillir des descendants autres que la tuberculose et les utiliser pour l’imagerie cardiaque.
   REMARQUE : Les différences phénotypiques aux stades larvaire et nymphal sont illustrées à la figure 2C. Le résumé et le calendrier approximatif des étapes de préparation des échantillons sont présentés à la figure 3.

2. Contrôle optogénétique du cœur de la drosophile

1. Prélevez la larve/nymphe UAS-opsin/Hand-GAL4 dans le flacon (étape 1.7.), appliquez du mouchoir en papier et essuyez délicatement le média de la surface du corps à l’aide d’un pinceau.
2. Préparez la lame de microscope et placez un petit morceau de ruban adhésif double face au milieu.
3. À l’aide d’une brosse ou d’une pince à épiler fine, placer délicatement la larve ou la nymphe sur la surface de la bande, la face dorsale vers le haut et perpendiculairement au côté long de la lame. Appliquez une légère pression pour attacher la larve / nymphe à la surface de la bande.
4. Installez la lame sur la scène d’imagerie, larve/nymphe tournée vers le bas.
5. Allumez la source lumineuse OCT à l’aide d’un logiciel de contrôle laser (voir Tableau des matériaux). Ouvrez le logiciel de contrôle SD-OCT personnalisé, puis cliquez sur la fenêtre Aperçu .
6. Définissez les paramètres d’analyse dans le logiciel SD-OCT.
   REMARQUE: L’objectif est d’aligner l’échantillon pour une imagerie optimale du cœur battant, de sorte que la sélection de la plage X et de la plage Y couvre la région du cœur. À cette étape, le nombre de balayages A et B est de 400. La plage dans les directions x et y est de ~490 μm et ~537 μm, montrant les deux sections transversales orthogonales du cœur (xz et yz), respectivement.
7. Utilisez des micromanipulateurs pour contrôler l’étape de l’échantillon afin de mettre au point le cœur de mouche. Ajustez la position focale pour minimiser la réflexion de la lumière de la surface de la cuticule de la mouche. Envisagez d’appliquer de l’huile minérale sur la surface de la larve ou de la nymphe pour minimiser la réflexion.
   NOTE: L’huile peut augmenter le risque de mouvement des animaux en compromettant les propriétés adhésives du ruban.
8. S’assurer que le cœur de mouche peut être entièrement visualisé dans la fenêtre d’image sans aucune distorsion, en étant bloqué par des tissus, des ombres et des reflets non négligeables; sinon, revenez à l’étape 2.7.
9. Définissez les paramètres de numérisation pour l’acquisition d’images OCT en mode M.
   REMARQUE: Le nombre de A-scans est réduit par rapport à l’étape 2.7. pour une fréquence d’images plus rapide afin de capturer la dynamique battante du cœur de mouche (plusieurs Hz). Le nombre de balayages B indique le nombre d’images répétées pour l’imagerie en mode M, qui peut être ajusté en fonction de la durée d’enregistrement et de la mémoire système disponible. Dans cette expérience, 128 balayages A peuvent permettre une vitesse de ~125 images / s, et 4 000 balayages B répétés sont enregistrés, fournissant un enregistrement continu de ~32 s.
10. Acquérir cinq ensembles de données de contrôle sans impulsions de stimulation de la lumière rouge pour calculer la fréquence cardiaque au repos (RHR).
11. Concevez l’impulsion lumineuse pour la stimulation de la stimulation dans le logiciel de contrôle OCT personnalisé. Dans « Paramètres », ajoutez les séquences d’impulsions lumineuses conçues pour contrôler la fréquence des impulsions, la largeur des impulsions, la durée de stimulation et le temps d’attente selon différents protocoles de stimulation.
    NOTE: Le RHR est mesuré à partir de l’expérience de contrôle sans éclairage lumineux et utilisé pour calculer la fréquence à laquelle la lumière doit être pulsée pour les expériences de tachypacing et de bradypacing²².
12. Ouvrez le logiciel du contrôleur de lumière (voir le tableau des matériaux) pour générer des impulsions de lumière rouge. Choisissez le mode d’impulsion dans « Sélection du mode ». Double-cliquez sur la figure des paramètres « Profil d’impulsion » et choisissez Mode suiveur. Conservez l’intensité OFF sur 0 et définissez le pourcentage d’intensité ON lors du calcul de la densité de puissance réelle.
    REMARQUE: Les impulsions lumineuses de stimulation sont déclenchées par un signal du logiciel de contrôle OCT conformément aux paramètres de l’étape 2.12.
13. Acquérir des vidéos en mode M du cœur battant de la drosophile avec stimulation lumineuse en cliquant sur Acquérir dans le logiciel de contrôle OCT. Répétez les mesures 5x.

3. Analyse d’images

1. Ouvrez le logiciel de segmentation de cœur de mouche développé sur mesure.
2. Cliquez sur Sélectionner un fichier, puis sélectionnez le fichier à analyser dans l’interface graphique qui apparaît.
3. Entrez les limites verticales et horizontales de la région du cœur en pixels dans les zones de texte supérieures. Cliquez sur Redimensionner. À l’aide du curseur en bas, assurez-vous que toute la région du cœur est visible et qu’elle remplit toute la boîte pour toute la collection. Si ce n’est pas le cas, répétez ce processus et ajustez les limites.
4. Cliquez sur Prédire pour prédire la région du cœur. Le programme passera maintenant en revue chaque tranche de la collection et sélectionnera la région du cœur, ce qui prendra environ 3 minutes.
5. Cliquez sur HR Plot une fois la prédiction terminée. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre affichant un tracé de la zone du cœur au fil du temps. Assurez-vous que les zones de pic ou de vallée correctes sont sélectionnées. Choisissez Pulse , puis HR pour générer un chiffre final, et les paramètres fonctionnels seront enregistrés simultanément dans les fichiers .csv.

Résultats

Les animaux de D. melanogaster exprimant des opsines sensibles à la lumière rouge eNpHR2.0 ou ReaChR dans le tube cardiaque ont été générés en obtenant une descendance à partir du croisement entre chaque lignée transgénique UAS-opsine et le conducteur Hand-GAL4 . La spécificité tissulaire du pilote GAL4 a été vérifiée par imagerie de l’expression de la GFP (Figure 4). Les larves du 3e stade de la drosophile et les premiers stades de développement de la nymphe ont été utilisés pour démontrer les effets de l’activation de l’eNpHR2.0 et de ReaChR par la lumière rouge. Conçu ~ 617 nm d’impulsions de lumière rouge, délivrées par LED, a illuminé la larve / nymphe et activé l’eNpHR2.0 et ReaChR dans le cœur. Bien que la longueur d’onde de réponse maximale rapportée de NpHR soit ~580 nm et de ReaChR soit de ~600 nm, l’éclairage lumineux de 617 nm peut pénétrer plus profondément avec une livraison améliorée d’énergie lumineuse vers le tissu cardiaque exprimant l’opsine²².

Montée sur la lame du microscope avec le côté dorsal vers le bas dans la configuration du microscope inversé, la larve / nymphe a été éclairée par un faisceau lumineux LED dirigé vers le segment du corps A7. Des exemples d’images de coupe transversale du corps sont présentés à la figure 5A et à la figure 6A. Le cœur apparaît comme une forme circulaire de contraction et de dilatation dans les enregistrements vidéo composés de 4 000 images (vidéos supplémentaires 1-6). Pour imiter différentes affections cardiaques, quatre types d’impulsions lumineuses ont été conçus. Une seule impulsion d’une durée de 10 s après un temps d’attente de 5 secondes a généré un arrêt cardiaque réparateur induit par eNpHR2.0, comme le montre la figure 5B. Pour la stimulation cardiaque à des fréquences plus lentes que la fréquence cardiaque au repos (RHR), médiée par eNpHR2.0, deux séquences d’impulsions lumineuses avec des fréquences de stimulation égales à RHR/2 et RHR/4 d’une durée de 8 s avec un temps d’attente de 6 s entre les deux ont été utilisées (Figure 5C). Le rapport cyclique de chaque séquence d’impulsions lumineuses était de 90 %. Ce régime de stimulation légère a provoqué une maladie cardiaque rappelant la bradycardie. Le schéma de stimulation pour augmenter la fréquence cardiaque due à l’activation de ReaChR consistait en trois séquences d’impulsions lumineuses à des fréquences RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz et RHR + 1,5 Hz, respectivement, avec une largeur d’impulsion de 20 ms (Figure 5D). Ce régime de pouls visait à provoquer une maladie cardiaque tachycardique. La densité de puissance lumineuse était de 7,49 mW/mm² pendant toutes les expériences. Pour les expériences de contrôle, aucun éclairage lumineux n’a été réglé.

Chaque variante expérimentale a été enregistrée cinq fois. Les vidéos en mode M du cœur de mouche ont été transformées en masques 2D à l’aide de FlyNet 2.0²⁷. Ce logiciel segmente automatiquement la région cardiaque pour produire les ensembles de données de la fonction cardiaque. Le programme fournit un masque du cœur dans chaque image, qui peut être corrigé manuellement, si nécessaire, pour générer une quantification précise des paramètres fonctionnels du cœur battant, tels que la fréquence cardiaque (FC), la dimension diastolique terminale (EDD) et la dimension systolique terminale (ESD), le raccourcissement fractionnaire (FR), la zone diastolique terminale (EDA), la zone systolique terminale (ESA), etc. La fréquence cardiaque est mesurée en analysant la région du cœur au fil du temps. La vidéo témoin sans impulsions lumineuses est utilisée pour établir une fréquence cardiaque de base (p. ex., RHR) pour chaque animal.

La figure 5B et la figure 6B montrent un arrêt cardiaque de 10 secondes causé par l’activation de Hand>eNpHR2.0 à l’aide de la lumière rouge (617 nm) chez les larves et les nymphes, respectivement. Lorsque la lumière rouge a été allumée, le cœur de la drosophile a cessé de battre et est resté dans cet état jusqu’à la fin de l’illumination lumineuse. La fonction cardiaque a été rétablie après l’extinction de la lumière rouge. Les animaux dont l’opsine n’était pas exprimée (contrôle « sans opsine ») n’ont pas répondu à l’éclairage à la lumière rouge (figure supplémentaire 2A et figure supplémentaire 3A). Les expériences de contrôle avec des animaux Hand>eNpHR2.0 où l’éclairage à la lumière rouge de 10 s n’était pas activé (contrôle « pas de lumière ») ont montré que le cœur battait normalement (Figure supplémentaire 4A et Figure supplémentaire 4C).

À l’aide d’animaux Hand>eNpHR2.0, des impulsions de lumière rouge à des fréquences inférieures à la RHR ont été appliquées. La fréquence de contraction cardiaque a été réduite à la suite des signaux lumineux; ce rythme cardiaque plus lent imite un type d’arythmie cardiaque, la bradycardie (Figure 5C et Figure 6C pour la larve et la nymphe, respectivement). Le ralentissement de la stimulation cardiaque n’a pas été observé dans les expériences de contrôle « sans opsine » (figure supplémentaire 2B et figure supplémentaire 3B) et « sans lumière » (figure supplémentaire 4A et figure supplémentaire 4C).

L’augmentation de la fréquence cardiaque peut être obtenue en activant l’opsine Hand>ReaChR avec des trains d’impulsions à lumière rouge à une fréquence supérieure au RHR de l’animal donné. Une série de trois trains d’impulsions lumineuses à différentes fréquences de stimulation (p. ex., RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz) a été appliquée sur des cœurs de larves et de pupes Hand>ReaChR. Les données obtenues montrent clairement une augmentation de la fréquence cardiaque suivant les impulsions lumineuses (Figure 5D et Figure 6D pour la larve et la nymphe, respectivement). La maladie cardiaque démontrée dans ces expériences imite la tachycardie. Les expériences de contrôle négatif sont présentées dans la figure supplémentaire 2C, la figure supplémentaire 3C et la figure supplémentaire 4B, D.

Dans l’ensemble, les résultats démontrent la faisabilité d’un contrôle optogénétique non invasif et spécifique du rythme cardiaque à différents stades de développement dans des modèles animaux transgéniques de D. melanogaster.

Figure 1 : Système d’imagerie OCT intégré au module LED 617 nm pour le contrôle optogénétique de la fonction cardiaque de la drosophile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Génération d’animaux de D. melanogaster exprimant l’opsine dans le cœur. (A) Diagramme génétique croisé. Les femelles Hand-GAL4/TM6 SbTb ont été croisées avec des mâles porteurs d’eNpHR2.0. La descendance Hand-GAL4/eNpHR2.0 résultante (marquée par l’étoile rouge) a été recueillie pour l’imagerie OCT, et la Tb Hand-GAL4/TM6 a été rejetée en fonction de son apparence phénotypique. (B) Diagramme génétique croisé. Les femelles Hand-GAL4/TM6 SbTb ont été croisées avec des mâles porteurs de ReaChR. La descendance Hand-GAL4/ReaChR résultante (marquée par l’étoile rouge) a été recueillie pour l’imagerie OCT, et Hand-GAL4/TM6 Sb Tb a été rejetée en fonction de son apparence phénotypique. (C) Différences phénotypiques entre la filiation Hand-GAL4/opsin (étoile rouge) et la descendance Hand-GAL4/TM6 Tb. Les animaux porteurs de la mutation du gène Tb sur le chromosome TM6 ont une forme corporelle « tubby » par rapport à la larve ou à la nymphe. Le panneau de gauche montre les larves; Le panneau de droite montre les premières nymphes. Les images comprennent également une règle avec des marques de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Présentation schématique et chronologie des procédures de préparation de l’imagerie. Les stocks parentaux sont conservés dans des flacons à mouches; Les femelles vierges et les mâles sont croisés dans des flacons étroits remplis de nourriture ordinaire (indiquée par une couleur jaune). Les mouches pondeuses actives sont transférées dans des fioles contenant de l’ATR (en brun). Les flacons avec une progéniture en développement doivent être conservés dans l’ignorance à partir de cette étape. Les larves du 3e stade et la nymphe précoce sont prélevées sur les parois du flacon pour l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Pupe précoce de D. melanogaster exprimant UAS-GFP (BDSC 6658) entraîné par Hand-GAL4 (BDSC 48396). Le diagramme de fluorescence confirme la spécificité cardiaque du pilote Hand-GAL4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Simulation d’un arrêt cardiaque, d’une bradycardie et d’une tachycardie chez les larves de D. melanogaster. (A) Image OCT d’une coupe transversale du corps larvaire. Le cœur apparaît comme un cercle sous la surface du corps. (B) Présentation graphique de l’arrêt cardiaque réparateur. Le panneau supérieur montre la synchronisation (axe X) de l’éclairage de la lumière rouge (axe Y, pourcentage de niveau de puissance de la source lumineuse). Le panneau du milieu indique le changement de la zone cardiaque (axe Y, micromètres carrés) au fil du temps (axe X). Le panneau inférieur montre l’évolution de la fréquence cardiaque (axe Y, hertz) au fil du temps (axe X). (C) Présentation graphique de la bradycardie restaurable médiée par eNpHR2.0. Le panneau supérieur montre les impulsions de l’éclairage de la lumière rouge, induisant deux périodes de bradycardie: 50% du RHR et 25% du RHR. Les changements de la zone cardiaque et de la fréquence cardiaque sont indiqués respectivement sur les panneaux du milieu et du bas. (D) Présentation graphique du rythme cardiaque par ReaChR activé. Le panneau supérieur montre une série d’impulsions de lumière rouge de 20 ms se produisant aux fréquences RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz et RHR + 1,5 Hz. Les contractions cardiaques suivent les fréquences d’impulsion lumineuse, comme indiqué sur les panneaux central et inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Simulation d’un arrêt cardiaque, d’une bradycardie et d’une tachycardie chez la nymphie de D. melanogaster. (A) Image OCT de la coupe transversale du corps nymphal. Le cœur apparaît comme un cercle sous la surface du corps. (B) Présentation graphique de l’arrêt cardiaque réparateur. Le panneau supérieur montre la synchronisation (axe X) de l’éclairage de la lumière rouge (axe Y, pourcentage de niveau de puissance de la source lumineuse). Le panneau du milieu indique le changement de la zone cardiaque (axe Y, micromètres carrés) au fil du temps (axe X). Le panneau inférieur montre l’évolution de la fréquence cardiaque (axe Y, hertz) au fil du temps (axe X). (C) Présentation graphique de la bradycardie restaurable médiée par eNpHR2.0. Le panneau supérieur montre les impulsions de l’éclairage de la lumière rouge, induisant deux périodes de bradycardie: 50% du RHR et 25% du RHR. Les panneaux du milieu et du bas montrent respectivement les changements de la zone cardiaque et de la fréquence cardiaque. (D) Présentation graphique du rythme cardiaque par ReaChR activé. Le panneau supérieur montre une série d’impulsions de lumière rouge de 20 ms aux fréquences RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz et RHR + 1,5 Hz. Les contractions cardiaques suivent les fréquences de l’impulsion lumineuse, comme indiqué sur les panneaux central et inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Croix génétiques pour remplacer le chromosome équilibreur TM3 Sb par TM6 Sb Tb. Les femelles vierges Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb ont été croisées avec des mâles nub-GAL4^NP3537 tub-GAL80^ts w+/ TM6 Sb Tb. Les descendants Hand-GAL4 w⁺/ TM6 Sb Tb, y compris les femelles et les mâles vierges, ont été sélectionnés (dépistage des yeux pigmentés combiné à la forme du corps tubby). Les mouches sélectionnées ont été auto-croisées pour établir un stock stable. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Dans les expériences de contrôle, le rythme cardiaque de la larve de type sauvage (wt) ne change pas lors de l’éclairage à la lumière rouge. (A) Aucun arrêt cardiaque n’a été observé pendant l’illumination à la lumière rouge chez les larves en poids. Le panneau supérieur affiche les images cardiaques en mode M. La ligne rouge indique le moment de l’éclairage. Les panneaux central et inférieur montrent la région cardiaque et les fréquences cardiaques pendant le temps d’imagerie de 32 s. (B,C) Les impulsions de lumière rouge ne modifient pas la fréquence cardiaque chez les larves en poids. Les panneaux supérieurs montrent les images cardiaques en mode M. La ligne rouge indique le moment de l’éclairage. Les panneaux central et inférieur montrent la région cardiaque et les fréquences cardiaques pendant le temps d’imagerie de 32 s. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Dans les expériences de contrôle, le rythme cardiaque de la chrysalide de type sauvage (wt) ne change pas lors de l’éclairage à la lumière rouge. (A) Aucun arrêt cardiaque n’a été observé pendant l’illumination à la lumière rouge chez les larves en poids. Le panneau supérieur affiche les images cardiaques en mode M. La ligne rouge indique le moment de l’éclairage. Les panneaux central et inférieur montrent la région cardiaque et les fréquences cardiaques pendant le temps d’imagerie de 32 s. (B,C) Les impulsions de lumière rouge ne modifient pas la fréquence cardiaque dans la nymphe. Les panneaux supérieurs montrent les images cardiaques en mode M. La ligne rouge indique le moment de l’éclairage. Les panneaux central et inférieur montrent la région cardiaque et les fréquences cardiaques pendant le temps d’imagerie de 32 s. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Les larves et les pupes de D. melanogaster exprimant Hand> eNpHR2.0 ou Hand>ReaChR ne présentent pas de changements significatifs de la FC pendant l’imagerie OCT sans éclairage à la lumière rouge. (A) La fréquence cardiaque de la larve Hand>eNpHR2.0. (B) La fréquence cardiaque de la larve Hand>ReaChR . (C) La fréquence cardiaque de la chrysalide Hand>eNpHR2.0. (D) La fréquence cardiaque de la chrysalide Hand>ReaChR . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1 : L’eNpHR2.0 activé provoque un arrêt cardiaque chez les larves de D. melanogaster. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 2 : L’eNpHR2.0 activé provoque un arrêt cardiaque chez la chrysalide D. melanogaster. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 3 : Bradycardie réparatrice médiée par eNpHR2.0 chez la larve de D. melanogaster. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 4 : Bradycardie réparatrice médiée par eNpHR2.0 chez la nymphe de D. melanogaster. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 5 : Stimulation cardiaque par ReaChR activé chez la larve de D. melanogaster. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 6 : Stimulation cardiaque par ReaChR activé chez la chrysalide D. melanogaster. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Par rapport à nos rapports précédents où l’expression des opsines était conduite non seulement dans le cœur, mais aussi dans les tissus musculaires environnants, les rapports de travail actuels utilisant un pilote spécifique au cœur, Hand-GAL4. Cette nouvelle configuration génétique Hand> opsin utilisée pour la régulation cardiaque optogénétique confirme les résultats précédemment rapportés et établit un meilleur modèle de recherche cardiovasculaire sur la drosophile .

La préparation des milieux est essentielle au succès des expériences. Les protéines d’opsine nécessitent un ligand, le tout-trans rétinien (ATR), pour fonctionner²⁸. Les mouches ne produisent pas assez d’ATR, de sorte que l’ATR doit être complété aux milieux de mouche. Dans cette étude, l’aliment instantané précédemment rapporté a été remplacé par un milieu semi-défini²⁹. La nouvelle recette de supports contenant de l’ATR a été introduite pour assurer une distribution uniforme de l’ATR. L’ATR n’est pas soluble dans l’eau; lorsque du stock d’ATR 100 mM à base d’éthanol est ajouté aux milieux à base d’eau, il est dispersé par vortex dans les flacons contenant des milieux semi-définis chauds. De plus, la concentration d’ATR précédemment signalée a été réduite de 10 mM pour eNpHR2.0 et de 3 mM pour ReaChR²² à une concentration finale de 1 mM pour les deux. Cette concentration est suffisante pour assurer la bonne fonction eNpHR2.0 et ReaChR.

Un élément essentiel du succès expérimental est l’amélioration du traitement des données avec FlyNet 2.0²⁷. Le laboratoire a continué à développer ce logiciel pour améliorer à la fois l’efficacité de calcul et la précision de l’algorithme automatisé de segmentation du cœur de mouche. Les masques en coupe transversale produits par ce logiciel sont utilisés pour dériver des données physiologiques de la drosophile telles que le raccourcissement fractionné et la vitesse de la paroi cardiaque. Cette approche a permis une analyse efficace des données avec une supervision humaine minimale, ce qui rend plus rapide et plus fiable la caractérisation de la fonction cardiaque pour les grands ensembles de données d’imagerie cardiaque de mouches.

L’infarctus du myocarde reste la principale cause de décès, et l’ischémie myocardique contribue aux deux tiers de tous les cas d’insuffisance cardiaque, qui émerge rapidement parmi les principales causes de mortalité et de morbidité aux États-Unis³⁰. Le développement de nouveaux dispositifs thérapeutiques et médicaux nécessite une connaissance approfondie des mécanismes des troubles cardiaques aux niveaux physiologique et biochimique. Ces objectifs peuvent être atteints avec l’aide d’organismes modèles. D. melanogaster s’est imposé comme l’un des modèles les plus fiables et les plus efficaces 31,32,33,34,35. Ces travaux ont généré les modèles simulés de troubles cardiaques de la drosophile induits par une approche optogénétique non invasive. Le développement de technologies de stimulation cardiaque optique non invasives fournit une base pour le développement d’une alternative aux dispositifs de stimulation cardiaque électrique traditionnels. L’utilisation de la TCO pour observer la fonction cardiaque en temps réel permet aux études de caractériser avec précision la physiologie cardiaque pertinente dans les modèles de drosophile pour des investigations avancées, y compris le dépistage de candidats médicaments. L’imagerie OCT a une profondeur de pénétration de ~1 mm, ce qui fonctionne bien pour les études cardiaques sur la drosophile, mais limite son utilisation pour caractériser la fonction cardiaque dans des modèles animaux plus grands. De plus, traduire directement la recherche sur la drosophile en modèles de mammifères représente un défi. De nouveaux outils optogénétiques doivent être développés pour améliorer la sensibilité des opsines et les traduire en divers systèmes modèles, y compris le poisson zèbre, la souris, le rat et les organoïdes cardiaques humains, pour la recherche cardiovasculaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
All-trans retinal	Cayman Chemicals	18449
Bacto Peptone	Gibco	02-10-2025
BioLED Light Source Control Module, 4-channel	Migtex Systems	BLS-SA04-US	Part of the optogenetic stimulation module
Broadband Light Source Module	Superlum	cBLMD-T-850-HP	Part of the SD-OCT imaging system
Cobra-S 800 OCT Spectrometers	Wasatch Photonics	CS800-840/180-80-OC2K-U3	Part of the SD-OCT imaging system
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professtional	34155	tissues
Drosophila agar	Genesee Scientific	66-103
Drosophila culture bottles	Genesee Scientific	32-131
FlyNet 2.0 Software	Z-Lab		Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab
High-Power LED Collimator Sources	Migtex Systems	BLS-LCS-0617-03-22	Part of the optogenetic stimulation module
Inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-106
Microscope slides	AmScope	BS-72P
Narrow plugs for Drosophila culture	Genesee Scientific	59-200
Narrow vials for Drosophila culture	Genesee Scientific	32-116SB
Permanent double-sided tape	Scotch
Plugs for Drosophila bottles	Genesee Scientific	59-194
Propionic Acid	Sigma	P1386-1L
SD-OCT control software	Z-Lab		Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system	Z-Lab		Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)
Sucrose	Carolina	89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 41752	eNpHR2.0 transgenic line
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 53748	ReaChR transgenic line
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 48396	Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock #6658	GFP reporter line
Yeast extract	Lab Scientific bioKEMIX	978-907-4243