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Résumé

Le présent protocole décrit une procédure optimisée de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) pour la greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Résumé

CRISPR / Cas9 est un outil d’édition de gènes très polyvalent et efficace largement adopté pour corriger diverses mutations génétiques. La faisabilité de la manipulation génique des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) in vitro fait des HSPC une cellule cible idéale pour la thérapie génique. Cependant, les HSPC perdent modérément leur potentiel de greffe et de repeuplement multilignée en culture ex vivo . Dans la présente étude, des conditions de culture idéales sont décrites qui améliorent la greffe de HSPC et génèrent un nombre accru de cellules génétiquement modifiées in vivo. Le rapport actuel présente des conditions de culture in vitro optimisées, y compris le type de milieu de culture, la supplémentation unique en cocktail de petites molécules, la concentration de cytokines, les plaques de culture cellulaire et la densité de culture. En plus de cela, une procédure optimisée d’édition de gènes HSPC, ainsi que la validation des événements d’édition de gènes, sont fournies. Pour la validation in vivo , la perfusion de HSPC génétiquement modifiée et l’analyse post-greffe chez des souris receveuses sont affichées. Les résultats ont démontré que le système de culture augmentait la fréquence des CSH fonctionnelles in vitro, ce qui entraînait une greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Introduction

L’inaccessibilité aux donneurs compatibles avec l’antigène leucocytaire humain (HLA) dans les contextes de transplantation allogénique et le développement rapide d’outils de génie génétique hautement polyvalents et sûrs font de la greffe autologue de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) une stratégie de traitement curatif pour les maladies hématologiques héréditaires 1,2. La thérapie génique par cellules souches et progénitrices hématopoïétiques autologues (HSPC) implique la collecte des HSPC des patients, la manipulation génétique, la correction des mutations pathogènes et la transplantation de HSPC corrigés par les gènes chez le patient 3,4. Cependant, le succès de la thérapie génique repose sur la qualité du greffon génétiquement modifié transplantable. Les étapes de manipulation génique et la culture ex vivo des HSPC affectent la qualité du greffon en diminuant la fréquence des cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT), nécessitant la perfusion de fortes doses de HSPCmanipulées par les gènes 2,5,6.

Plusieurs petites molécules, dont SR1 et UM171, sont actuellement utilisées pour étendre les HSPC dans le sang de cordon ombilical de manière robuste 7,8. Pour les HSPC adultes, en raison du rendement cellulaire plus élevé obtenu lors de la mobilisation, une expansion robuste n’est pas nécessaire. Cependant, conserver la souche des HSPC isolés en culture ex vivo est crucial pour ses applications de thérapie génique. Par conséquent, une approche axée sur l’enrichissement de la culture de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est développée en utilisant une combinaison de petites molécules: resvératrol, UM729 et SR1 (RUS)7. Les conditions de culture HSPC optimisées favorisent l’enrichissement des CSH, ce qui entraîne une augmentation de la fréquence des CSH génétiquement modifiées in vivo, et réduit la nécessité de manipuler de grandes doses de HSPC, facilitant ainsi des approches de thérapie génique rentables8.

Ici, un protocole complet pour la culture HSPC est décrit, ainsi que la perfusion et l’analyse de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Protocole

Des expériences in vivo sur des souris immunodéficientes ont été approuvées et réalisées conformément aux directives de l’Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Inde. Des échantillons de sang périphérique mobilisés par le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF) ont été prélevés sur des donneurs humains en bonne santé avec leur consentement éclairé après avoir obtenu l’approbation du Comité d’examen institutionnel (CISR).

1. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMNCs) et purification des cellules CD34+

  1. Effectuez l’isolation PBMNC en suivant les étapes ci-dessous.
    NOTE: Pour la culture HSPC in vitro et l’édition de gènes, commencer par au moins 1 x 106 HSPCs / groupe est idéal. Pour l’analyse in vivo de la greffe, un nombre de cellules de départ d’au moins 5 x 10 6 HSPC/groupe est idéal si un groupe contient huit souris et que chaque souris est perfusée avec au moins6 x 105 cellules. Pour obtenir un nombre suffisant de PBMNCs (~1 x 109) pour la procédure, il est recommandé de commencer par 20 mL de sang périphérique mobilisé (mPB).
    1. Après la collecte du mPB, diluer 20 mL de mPB avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x stérile dans un rapport de 1:1.
      REMARQUE : L’efficacité de la mobilisation du G-CSF peut varier d’une personne à l’autre 9 et, par conséquent, le nombre de HSPC obtenusà partir de 20 mL de sang mobilisé varie d’un donneur à l’autre.
    2. Ajouter 10 mL de milieu gradient de densité (Lymphoprep, voir le tableau des matières) dans un tube de 50 mL et déposer le sang dilué sur les côtés du tube dans un rapport de 1:2.
      REMARQUE: L’inclinaison du tube de 50 ml à un angle de 20° tout en ajoutant le sang dilué l’empêche de se mélanger avec Lymphoprep, ce qui entraîne une séparation claire des composants sanguins après la centrifugation.
    3. Centrifuger à 600 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) avec une vitesse d’accélération de 1 m/s² et une vitesse de décélération de 1 m/s². Éliminer la couche supérieure (plasma) à l’aide d’une pipette sérologique et récolter la couche leucocytaire présente à l’interphase (PBMNC) au-dessus de la couche moyenne à gradient de densité.
      REMARQUE: Aspirez la couche leucocytaire à l’aide d’une pipette sérologique en la faisant tourner doucement sur les côtés du tube. Évitez de recueillir un volume plus élevé d’interphase lors de l’aspiration de la couche leucocytaire pour éviter la contamination par les granulocytes et les globules rouges.
    4. Transférer les PBMNCs dans un nouveau tube conique de 50 ml et diluer la suspension cellulaire avec 1x PBS dans un rapport de 1:2.
      REMARQUE: Diluer la suspension cellulaire avec 1x PBS dans un rapport de 1: 4 si un excès d’interphase a été recueilli lors de l’aspiration de la couche leucocytaire.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min à température ambiante avec une vitesse d’accélération de 9 m/s² et une vitesse de décélération de 7 m/s² et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique. Ajouter 30 mL de tampon de lyse de globules rouges glacé (voir le tableau 7) à la pastille et incuber dans de la glace pendant 10 minutes. Mélanger en retournant le tube toutes les 2 minutes.
    6. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante avec une vitesse d’accélération de 9 m/s² et une vitesse de décélération de 7 m/s², et jeter le surnageant. Répétez les étapes 1.1.5.-1.1.6. jusqu’à ce que la rougeur du granulé disparaisse. Resuspendre la pastille avec un milieu basal (IMDM, voir tableau des matériaux) et effectuer un comptage cellulaire en utilisant du bleu de trypan dans une chambre de Neubauer10.
      REMARQUE : Les PBMNC isolés peuvent être immédiatement utilisés pour purifier les CSSG CD34+. Alternativement, les PBMNCs peuvent être cryoconservés et réactivés chaque fois que nécessaire pour l’enrichissement en CD34+. Pour la cryoconservation, centrifuger 5 x 108 cellules à 200 x g pendant 5 min et ajouter 4 mL de cryomédia contenant IMDM: FBS: DMSO (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 7: 2: 1.
    7. Transférer les flacons dans un refroidisseur cryogénique à 1 °C et les conserver à −80 °C jusqu’à 12 h. Transférer et stocker les cryovials dans un récipient d’azote liquide pour un stockage à long terme.
  2. Faire revivre les PBMNC cryoconservés.
    1. Décongeler à moitié les cryoflacons dans un bain-marie à 37 °C en remuant doucement pendant <1 min. Transférer la suspension cellulaire du cryovial dans un tube de 50 mL contenant IMDM dans un rapport de 1:10.
    2. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min à température ambiante avec une vitesse d’accélération de 9 m/s² et une vitesse de décélération de 7 m/s², et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique.
  3. Purifier les cellules CD34+ des PBMNCs en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Préparer le tampon de purification avec 1x PBS stérile contenant 2% de sérum fœtal bovin filtré (FBS). Remettez en suspension la pastille de cellule PBMNC dans le tampon conformément au tableau 1.
      REMARQUE: Le tampon doit être exempt de Ca++ et de Mg++.
    2. Transférer la suspension cellulaire contenant 1 x 108-5 x 108 cellules de PBMNCs frais ou cryoconservés dans le tube à fond rond en polystyrène de 5 ml (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Ajouter la DNase (voir le tableau des matières) à une concentration finale de 100 μg/mL à la suspension cellulaire pour éviter l’agglutination cellulaire. Nous avons utilisé un kit disponible dans le commerce pour la purification du CD34 contenant le cocktail de sélection positive CD34 humain et les sphères rapides de Dextran (voir le tableau des matériaux).
    3. Ajouter le cocktail de sélection positive CD34 humain disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) à la concentration de 100 μL/mL de cellules et remettre en suspension doucement.
    4. Incuber à TA pendant 30 min et remettre doucement en suspension la suspension cellulaire toutes les 5 minutes. Ajouter 50 μL/mL de sphères rapides Dextran disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et remettre en suspension doucement.
      REMARQUE: Vortex les sphères de dextrane à grande vitesse pendant 5 s pour s’assurer que les particules apparaissent uniformément dispersées, puis ajoutez-les aux cellules.
    5. Incuber à TA pendant 15 min et remettre doucement en suspension la suspension cellulaire toutes les 5 minutes. Fabriquer la suspension cellulaire à un volume total de 2,5 mL avec un tampon de purification et la remettre en suspension doucement.
    6. Placez le tube dans un aimant immunomagnétique sans colonne disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 5 minutes à TA. Après l’incubation, inverser l’aimant et jeter le surnageant en un mouvement continu.
      REMARQUE: Les cellules CD34+ marquées par Dextran Rapid Spheres restent attirées sur les côtés du tube par le champ magnétique. Le tube doit être maintenu en position inversée pendant 2-3 s. Évitez de trembler ou d’éponger les gouttes qui restent suspendues à l’embouchure du tube.
    7. Retirez le tube de l’aimant et ajoutez 2,5 ml de tampon de purification. Répétez les étapes 1.3.6-1.3.7 cinq fois.
      REMARQUE: Lors de l’ajout d’un tampon de purification, positionnez le tube à un angle aigu et ajoutez un tampon en faisant tourbillonner le tube, car les cellules pourraient adhérer aux parois de surface tout en inversant l’aimant.
    8. Après cinq lavages, retirez le tube de l’aimant, ajoutez 4 mL de PBS 1x stérile et remettez en suspension la suspension cellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans le tube à centrifuger de 15 mL et la porter à 10 mL avec 1x PBS. Effectuer un comptage cellulaire en utilisant du bleu de trypan dans une chambre de Neubauer10.
    9. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TR (accélération ~9 m/s², décélération ~7 m/s²) et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Pour mettre en culture les HSPC, remettre les cellules en suspension dans des milieux de culture HSPC, comme mentionné à l’étape 2.1.
      NOTA : Les excédents de HSPC purifiés ont été cryoconservés dans un milieu de cryoconservation disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) à une densité de 9 x 106 cellules/mL après culture des HSPC pendant 12 h dans des milieux de culture HSPC.
  4. Faire revivre les HSPC cryoconservés.
    1. Décongeler les cryoflacons pendant <1 min dans un bain-marie à 37 °C en remuant doucement. Transférer la suspension cellulaire dans le cryovial dans un tube de 50 mL.
    2. Ajouter 1% de BSA remis en suspension dans 1x PBS goutte à goutte avec agitation constante et porter à 20 mL. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante avec une vitesse d’accélération de 9 m/s² et une vitesse de décélération de 7 m/s² et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique.
    3. Répétez l’étape 1.4.2. 1x. Remettez les cellules en suspension dans les milieux de culture et la culture HSPC comme décrit à l’étape 2.1.

2. Culture in vitro de HSPC purifiés

  1. Préparer les milieux de culture à l’aide de SFEM-II avec SCF (240 ng/mL), FLT3 (240 ng/mL), TPO (80 ng/mL), IL6 (40 ng/mL) et 1x antibiotique-antimycotique (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: Des milieux de culture fraîchement préparés sont fortement recommandés. Cependant, le support peut être conservé à 4 °C jusqu’à 24 heures après la préparation.
  2. Resuspendre la pastille CD34+ avec le milieu de culture, ajouter 3 μL de cocktail RUS/mL de milieu (Resvératrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; voir Tableau des matériaux) et mettre les cellules en culture à 37 °C avec 5 % de CO2.
    NOTE: UM171 (10 nm) peut être utilisé pour remplacer UM729 (500 nM) car les deux ont des effets similaires sur le maintien de la tige HSPC7. Les flacons ne peuvent pas être congelés-décongelés plus de deux fois.
  3. Initialement, ensemencer les cellules purifiées à une confluence de 5 x 105/mL dans des plaques à 6 puits traitées en surface delta disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) pour éliminer les cellules adhérentes.
  4. Réensemencer les cellules dans la suspension à une confluence de 2 x 105 cellules/mL dans une nouvelle plaque à 6 puits après 6 h de purification.
  5. Caractériser la souche des HSPC en utilisant la cytométrie de flux avant l’édition de gènes.
    1. Pour l’analyse par cytométrie en flux, prendre 1 x 105 cellules dans 100 μL de 1x PBS et ajouter 3 μL (75 ng) de CD34 PE, 4 μL (100 ng) de CD133 FITC et 4 μL (100 ng) de CD90 APC (voir le tableau des matériaux).
    2. Incuber le tube à TA pendant 20 min dans l’obscurité. Laver les cellules avec 2 mL de 1x PBS 2x et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA. Jeter le surnageant avec une pipette, remettre en suspension la pastille cellulaire avec 150 μL de 1x PBS, et l’acquérir en cytométrie de flux.
      REMARQUE : Si le pourcentage de cellules CD34+ est de <90 %, augmentez le nombre de lavages jusqu’à six fois à l’étape 1.3.7. Ensemencer les HSPC purifiés dans des milieux de culture et, après 6 h, ne recueillir que les cellules dans la suspension. La plupart des cellules CD34- adhèrent à la plaque de culture.

3. Édition génique des HSPC

  1. Effectuer la reconstitution de l’ARN guide.
    REMARQUE : L’ARNg synthétique avec des modifications du phosphorothioate ciblant le locus CCR5 a été obtenu de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).
    1. Pour la reconstitution, régler le thermomélangeur à 37 °C et préchauffer le tampon 1x TE (voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 10 min. Centrifuger le flacon d’ARNg synthétique chimiquement modifié à 11 000 x g pendant 1 min à 4 °C.
    2. Au flacon d’ARNg contenant 1,5 nM d’ARNg lyophilisé, ajouter 15 μL de 1x tampon TE, ce qui donne une concentration finale de 100 pM/μL. Remettre en suspension doucement jusqu’à 5x, en faisant tourbillonner l’embout dans les coins.
    3. Incuber dans le thermomélangeur à 37 °C pendant 30-40 s avec un minimum d’agitation. Après un court spin, prélever 15 μL d’ARNg et stocker sous forme de 1 μl d’aliquotes (100 pM/μL) à -80 °C pour une utilisation ultérieure jusqu’à 1 an.
      REMARQUE : Évitez les cas répétés de gel-décongélation. Un maximum d’un cycle de gel-dégel d’ARNg aliquote est recommandé.
  2. Effectuez la nucléofection en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Le jour 3 de la culture, comptez les cellules à l’aide de la chambre de comptage cellulaireaméliorée 10 de Neubauer.
    2. Pour la préparation de RNP (pour nucléofecter 2 x 10 5 cellules), prélever 1 μL d’ARNg ciblant le gène CCR5 (100 pM) dans un tube de0,5 mL et ajouter 2,65 μL de Cas9 (50 pM) en remuant doucement autour du fond du flacon. Incuber à TA pendant 10 min.
      NOTE: séquence d’ARNg: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG.
    3. Pour la préparation tampon, ajouter 16,4 μL de solution de cellules primaires P3 et 3,6 μL de supplément, fournis avec le kit de nucléofection commercial (voir le tableau des matériaux), et incuber à TA pendant 10 min. Préparer les milieux de culture (étape 2.1.) et les préincuber à 37 °C dans la plaque de culture avant nucléofection.
    4. Granuler 2 x 10 5 cellules par centrifugation à 200 x g pendant5 min à TA et éliminer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette sans déranger la pastille. Remettre en suspension la pastille avec 20 μL du tampon préparé à l’étape 3.2.3. et remettez-le doucement en suspension.
    5. Mélanger délicatement la suspension cellulaire avec le complexe RNP préparé (étape 3.2.2.) sans bulles d’air. Transférer la suspension sur la bande de nucléofection commerciale (voir le tableau des matériaux) et sélectionner le code d’impulsion DZ100 pour électroporer les cellules à l’aide du nucléofector 4D (voir le tableau des matériaux).
      NOTE: Le volume final de la suspension cellulaire, y compris les composants tampon et RNP, ne doit pas dépasser plus de 27 μL/électroporation.
    6. Pour le témoin expérimental, granuler 2 x 10 5 HSPC non édités par centrifugation à 200 x g pendant5 min à TA, et remettre en suspension la pastille avec 20 μL du tampon préparé à l’étape 3.2.3. sans complexe RNP.
    7. Ajouter 100 μL de milieux de culture pré-incubés (étape 3.2.3.) aux cellules électroporées et laisser les cellules intactes pendant 10 min dans la bande de nucléofection à TA. Après 10 minutes d’incubation, transférer le contenu sur la plaque de culture selon les exigences expérimentales.
      REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué à la perturbation ciblée non homologue médiée par la jonction d’extrémité (NHEJ) de tout locus génomique à l’aide d’ARNg spécifique à la cible. Le même protocole peut être appliqué pour introduire de grandes délétions en incluant l’ARNg double à l’étape 3.2.2. 11. De plus, après 10 minutes d’incubation du RNP, le même protocole peut être utilisé pour l’édition génique basée sur la réparation dirigée par homologie (HDR) lorsqu’un modèle de donneur12 est fourni. Le protocole a été validé par la perturbation ciblée de AAVS1, de la pseudo β-globine, de la β-globine et du locusCCR5 7,8.

4. Validation des événements d’édition de gènes dans les HSPC

  1. Effectuer l’extraction de l’ADN.
    1. Après 72 h après la nucléofection, effectuer un comptage cellulaire en utilisant du bleu de trypan dans une chambre de Neubauer. Recueillir 1 x 105 HSPC génétiquement modifiés pour l’extraction de l’ADN.
    2. Centrifuger les cellules à 11 000 x g pendant 5 min à TA et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettez la pastille en suspension avec 1 mL de 1x PBS et répétez la centrifugation et jetez le surnageant. À la pastille, ajouter 20 μL de solution d’extraction rapide (voir le tableau des matières) pour 1 x 105 cellules et remettre la pastille en suspension.
    3. Incuber le mélange dans un thermocycleur à 68 °C pendant 30 min. Après un court essorage, incuber le mélange dans un thermocycleur à 98 °C pendant 10 min. Mesurer la concentration d’ADN dans le lysat brut à l’aide d’un spectrophotomètre13.
  2. Effectuer l’amplification du locus génétiquement modifié par PCR.
    1. À l’aide de Primer3 (voir le tableau des matériaux), concevoir les amorces spécifiques au locus couvrant le site de rupture double brin (DSB) avec des tailles d’amplicon comprises entre 400 et 700 pb (tableau 2).
      REMARQUE: Primer3 est un outil open source basé sur le Web pour la conception d’amorces PCR.
    2. Préparer le mélange réactionnel comme indiqué dans le tableau 3 et faire fonctionner le thermocycleur dans les conditions de cyclage mentionnées au tableau 4. Pour confirmer l’amplification du locus désiré, mélanger 5 μL de produit PCR avec un colorant de chargement 6x et charger sur l’électrophorèse sur gel d’agarose à 2% fabriqué à l’aide d’un tampon TAE.
      REMARQUE : Les composants du tampon TAE sont fournis dans le tableau 7.
    3. Fonctionnement pendant 30 à 40 minutes à 100 V et détection de l’amplicon à l’aide d’un système d’imagerie sur gel (voir le tableau des matériaux). Selon le protocole du fabricant de purification PCR (voir le tableau des matériaux), nettoyez le produit PCR amplifié.
    4. Mesurer la concentration du produit PCR purifié à l’aide d’un spectrophotomètre nanogoutte (voir le tableau des matériaux).
  3. Effectuez le séquençage de Sanger et le retrait libre de la terminaison de colorant en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Préparer le mélange réactionnel comme indiqué dans le tableau 5. Faites fonctionner le thermocycleur dans les conditions de cyclage mentionnées dans le tableau 6.
    2. Ajouter 10 μL de réactif DTR HighPrep (voir le tableau des matières) et 40 μL d’éthanol à 85 % à 10 μL d’échantillon de PCR dans un tube de 1,5 mL et mélanger le mélange en pipetant vigoureusement environ 8x-10x.
    3. Incuber le mélange à TA pendant 5 min et placer le tube de 1,5 mL sur le support de séparation magnétique pendant 5 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 100 μL d’éthanol à 85 %.
    4. Jetez le surnageant et répétez l’étape 4.3.3. 1x. Sortez les tubes de 1,5 mL du support magnétique et incuberez-les à 37 °C pendant 10 min dans un thermomélangeur pour sécher l’éthanol.
    5. Remettez vigoureusement les billes en suspension avec 40 μL d’eau sans nucléase et incuber à TA pendant 5 min. Placez le tube sur le support de séparation magnétique pendant 5 minutes et effectuez le séquençage de Sanger en suivant les rapports publiés14,15.
  4. Effectuer une évaluation de la fréquence indel par analyse ICE16.
    1. Utilisez Synthego (voir le tableau des matériaux) pour l’analyse ICE.
    2. Téléchargez des fichiers ab1 d’échantillons édités et non édités et de séquences d’ARNg et cliquez sur analyser pour obtenir la fréquence des Indels.

5. Transplantation de HSPC génétiquement modifiés

  1. Préconditionnez la souris gamma SCID NOD (NSG)17 et NOD disponibles dans le commerce. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 souris (voir le tableau des matériaux) pour la greffe de moelle osseuse.
    1. Pour préconditionner les souris NSG, choisissez des souris femelles âgées de 6 à 8 semaines et séparez-les en groupes témoins et édités par randomisation en aveugle.
    2. Placer les souris NSG dans les cages à tarte et irradier à 3,5 Gy à l’aide d’un irradiateur disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) 6 à 8 heures avant la transplantation HSPC.
      NOTE: Il est recommandé de peser les souris avant l’irradiation, et les souris pesant >20 g seront soumises à l’irradiation.
    3. Pour le préconditionnement des souris mâles et femelles NBSGW âgées de 6 à 8 semaines, injecter du busulfan (voir le tableau des matières) par injection intrapéritonéale (IP) à une dose de 12,5 mg/kg de poids corporel 48 h avant la transplantation HSPC.
      NOTE: Le conditionnement au busulfan augmente la greffe de HSPC humains dans la moelle osseuse de la souris et diminue la nécessité d’infuser de fortes doses de HSPC génétiquement modifiés19. La plage idéale de dose de busulfan pour le conditionnement se situe entre 10 mg / kg et 15 mg / kg de poids corporel. L’augmentation des doses de busulfan entraînera de graves problèmes de mortalité.
  2. Préparer la suspension cellulaire pour la greffe de moelle osseuse.
    1. Après 10 minutes d’incubation des HSPC génétiquement modifiés dans la bandelette de nucléofection (voir étape 3.2.7.), transférer la suspension cellulaire à 10 mL de 1x PBS. Comptez les cellules à l’aide de la chambre de comptage cellulaire améliorée10 de Neubauer.
    2. Pour la perfusion d’une souris, granuler 6 x 10 5 cellules dans un tube de 1,5 mL par centrifugation à 200 x g pendant5 min à TA et jeter délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette sans déranger la pastille. Remettez en suspension la pastille de cellule avec 100 μL de 1x PBS.
  3. Injecter les HSPC par injection veineuse de la queue en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Placez la souris NSG ou NBSGW préconditionnée dans le dispositif de retenue de la souris (voir le tableau des matériaux).
    2. Tenez la queue de la souris et poussez doucement la fiche pour retenir la souris. Essuyez délicatement la queue de souris avec 70% d’éthanol. Aspirer 100 μL de la suspension cellulaire dans une seringue à insuline de 31 G.
      REMARQUE: Évitez strictement les bulles dans le produit de perfusion en tapotant doucement la seringue ou en déplaçant doucement le piston.
    3. Dirigez la lumière de la lampe infrarouge sur la queue pendant 30-40 s, couvrant la zone du corps de la souris avec des plis de papier de soie. Insérez délicatement la partie biseautée de l’aiguille dans la veine caudale gauche ou droite à un angle de 20°.
    4. Soulevez la queue avec l’index gauche pour la maintenir dans l’axe plan avec la seringue. Poussez le piston pour infuser la suspension cellulaire dans la veine. Appliquez une légère pression près de la région percée avec du papier de soie et retirez l’aiguille.
    5. Après 30 s d’application d’une légère pression, retirez la souris de la contention et transférez-la dans sa cage.

6. Évaluation du potentiel de greffe à court terme

  1. Après 4 semaines de transplantation HSPC humaine, évaluer la greffe à court terme en recueillant du sang via le sinus veineux orbitaire dans un tube hépariné à l’aide d’une pipette Pasteur.
    1. Anesthésier l’animal avec une formulation de kétamine (90-120 mg/kg) et de xylazine (8-12 mg/kg) par injection intrapéritonéale (IP) avant le prélèvement de l’échantillon.
      REMARQUE: Appliquez doucement une pression sur les membres postérieurs de la souris anesthésiée pour confirmer la perte de sensation.
    2. Après l’anesthésie, placez l’animal en position couchée ventrale et frottez doucement la souris pour ouvrir l’œil, ce qui permet au globe oculaire de dépasser légèrement.
    3. Insérez délicatement la pipette Pasteur dans le canthus médian de l’œil sous la membrane nictante à un angle de 30°-45°. Après avoir placé la pipette Pasteur dans la bonne position, appliquez une légère pression sur le tube et commencez à le faire tourner doucement.
      REMARQUE: Le sang pénètre dans le tube par capillarité dès que le plexus rétro-orbitaire est perforé.
  2. Après avoir recueilli 50 à 80 μL de sang périphérique, retirez doucement la pipette du canthus médial de l’œil.
    1. Pour arrêter le saignement autour de l’orbite de l’œil, fermez les paupières et appliquez une légère pression à l’aide d’un morceau de gaze.
  3. Colorer les cellules avec les anticorps respectifs (tableau 8) et incuber les cellules dans l’obscurité pendant 25-30 min à TA.
  4. Pour la lyse des globules rouges, ajouter à la suspension cellulaire 3 mL de 1x tampon de lyse des globules rouges (tableau 7) et incuber pendant 10 minutes dans de la glace.
    1. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez l’étape 6.4. jusqu’à ce que la rougeur de la pastille disparaisse.
    2. Ajouter 2 mL de 1x PBS et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA pour enlever les débris cellulaires associés à la lyse des globules rouges.
    3. Ajouter 150 μL de 1x PBS à la pastille puis procéder à l’immunophénotypage pour la cytométrie en flux afin d’évaluer le pourcentage de cellules humaines greffées7.

7. Évaluation du potentiel de greffe à long terme

  1. Euthanasier les souris.
    1. Sacrifiez les souris transplantées à la semaine 16 pour l’analyse de la greffe en introduisant une asphyxie 100% CO20 à l’intérieur de la cage des souris pendant 1-2 min.
    2. Confirmer l’euthanasie en vérifiant l’arrêt cardiaque et respiratoire et l’absence de mouvements musculaires avec pincement doux des membres postérieurs. Si les deux conditions sont remplies, retirez les souris de la cage.
    3. Pour évaluer le chimérisme des cellules humaines, prélever les cellules de la moelle osseuse.
  2. Isolez les cellules de la moelle osseuse en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Après l’euthanasie, faites une incision verticale à 1 cm au-dessus de l’urètre et étendez-la jusqu’à 1 cm sous le diaphragme. Couper horizontalement aux coins de la zone incisée pour ouvrir largement la région abdominale.
    2. Disséquer le fémur et le tibia et enlever les tissus mous attachés au fémur et au tibia à l’aide de ciseaux. Frotter délicatement avec du papier de soie et faire un petit trou d’un diamètre ne dépassant pas 0,2 cm au fond d’un tube microcentrifuge de 0,5 mL à l’aide d’un scalpel.
    3. Retirez les extrémités proximales des os à l’aide d’un scalpel et placez les os avec le côté coupé vers le trou du tube de microcentrifugation de 0,5 mL. Placez le tube de 0,5 mL avec les os dans le tube de 1,5 mL contenant 100 μL de 1x PBS stérile.
    4. Fermer le couvercle, faire tourner les tubes pendant 3 min à 1000 x g dans des conditions stériles à TA et jeter les tubes de 0,5 mL contenant des os avec une cavité médullaire vide. Ajouter 1 mL de 1x PBS dans le tube de réaction de 1,5 mL contenant de la moelle osseuse et remettre doucement les cellules en suspension environ pas moins de 10x à l’aide d’une pipette de 1 mL.
    5. Transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber les cellules dans la glace pendant 7 min avec une légère inversion des tubes toutes les 2 minutes.
    6. Après 7 min, centrifuger à 200 x g pendant 5 min à RT avec une accélération de 9 m/s² et une désaccélération de 7 m/s². Répétez l’étape 7.2.5. jusqu’à ce qu’on observe une pastille blanche pâle claire.
    7. Resuspendre les cellules avec 10 mL de 1x DPBS stérile et filtrer la suspension de cellules de moelle osseuse à l’aide d’une crépine cellulaire de 40 μm sur un tube de 15 mL. Rincer la crépine cellulaire avec 2 mL de 1x PBS 2x pour éviter la perte de cellules.
    8. Centrifuger pendant 5 min à 200 x g, RT, et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Resuspendre les cellules avec 10 mL d’IMDM avec DNase-I à une concentration de travail de 100 μg/mL.
    9. Prélever 1 x 106 cellules mononucléaires dans un tube FACS pour l’analyse de greffe par cytométrie en flux. Pour évaluer la fréquence d’édition de gènes dans les cellules mononucléaires de moelle osseuse greffées, injecter 1 x 106 cellules mononucléaires à 11 000 x g pendant 5 min à TA et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.

8. Immunophénotypage

  1. Incuber les cellules de la moelle osseuse avec 1,5 μL d’une protéine Fc humaine recombinante purifiée (voir le tableau des matières) pendant 15 minutes à 4 °C avant de les colorer avec des anticorps.
    REMARQUE: La protéine Fc humaine utilisée ici est formulée pour bloquer la coloration d’anticorps non spécifiques causée par les récepteurs des IgG; Ainsi, il augmente la spécificité du marquage des anticorps 7,21,22. Avant la coloration des cellules cibles par les anticorps, effectuez le titrage des anticorps. Il est fortement recommandé d’inclure des contrôles FMO et des contrôles isotypes lorsque vous travaillez sur une analyse cytométrique en flux multicolore.
  2. Pour déterminer le pourcentage de greffe de cellules humaines par cytomètre en flux, prélever 1 x 106 cellules mononucléaires dans un tube FACS et colorer les cellules comme mentionné dans le tableau 8.
  3. Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 25-30 min à TA. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
  4. Acquérir les cellules par un cytomètre en flux, griller la population cellulaire (P1) en utilisant les diffusions directes (FSC) et latérales (SSC) des cellules mononucléaires, et ajuster la tension en fonction de la population cellulaire. Acquérir 50 000 événements cellulaires dans la population P1.
  5. Pour analyser les populations de leucocytes humains dans la moelle osseuse de souris, séparer les cellules CD45+ humaines et CD45.1 de souris de la population de cellules P1 à l’aide d’un logiciel d’analyse de données de cytométrie en flux (voir le tableau des matériaux).
  6. Calculer la greffe de cellules humaines en utilisant la formule8 suivante:
    % de greffe = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
    REMARQUE : Le seuil de greffe humaine a été considéré comme positif à 0,1 % pour CD45.
  7. De plus, analyser le pourcentage de cellules hCD34+ provenant de cellules CD45+ humaines pour évaluer le repeuplement à long terme des cellules. Pour évaluer la reconstitution multilignée des cellules humaines greffées, colorer 100 μL de suspension cellulaire en suivant le tableau 9.
    REMARQUE: Les anticorps doivent être titrés avant les expériences.
  8. À l’aide du logiciel de cytométrie en flux, extraire le hCD45 de la population de cellules P1 et, à partir de hCD45, quantifier le pourcentage de hCD19, hCD3 et hCD13 (sous-ensembles lymphoïdes et myéloïdes).

9. Évaluation de la fréquence d’édition des gènes dans les cellules mononucléées greffées de moelle osseuse

  1. À la pastille de cellule mononucléaire de moelle osseuse, ajouter 50 μL de solution d’extraction rapide (voir le tableau des matières) pour 5 x 105 cellules et remettre la pastille en suspension.
  2. Incuber le mélange dans un thermocycleur à 68 °C pendant 30 min. Après un court essorage, incuber le mélange dans un thermocycleur à 98 °C pendant 10 min.
  3. Mesurer la concentration d’ADN dans le lysat brut à l’aide d’un spectrophotomètre. Suivez les étapes 4.2.-4.4. valider la fréquence d’édition des gènes à l’aide de l’analyse ICE 8,15.

Résultats

La présente étude identifie les conditions idéales de culture HSPC qui facilitent la rétention des CSH CD34+CD133+CD90+ en culture ex vivo. Pour démontrer l’enrichissement en culture des CSH ainsi que la génération améliorée de CSH génétiquement modifiées, les procédures optimisées pour l’isolement des CSNP, la purification des cellules CD34+, la culture, l’édition de gènes, la transplantation, la caractérisation de la greffe et les cellules gén...

Discussion

Le succès de la thérapie génique HSPC repose principalement sur la qualité et la quantité de CSH greffables dans le greffon. Cependant, les propriétés fonctionnelles des CSH sont fortement affectées pendant la phase préparatoire des produits de thérapie génique, y compris par la culture in vitro et la toxicité associée à la procédure de manipulation génique. Pour surmonter ces limitations, nous avons identifié des conditions de culture HSPC idéales qui conservent la souche des CSH CD34 + CD133 ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’installation de cytométrie en flux et de l’animalerie du CSCR. A. C. est financé par une bourse ICMR-SRF, K. V. K. est financé par une bourse DST-INSPIRE et P. B. est financé par une bourse CSIR-JRF. Ce travail a été financé par le Département de biotechnologie du gouvernement indien (subvention n° BT/PR26901/MED/31/377/2017 et BT/PR31616/MED/31/408/2019)

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4D-Nucleofector® X UnitLONZA BIOSCIENCEAAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips)LONZA BIOSCIENCEV4XP-3032
Antibiotic-Antimycotic (100X)THERMO SCIENTIFIC15240096
Anti-human CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
Anti-human CD13 PEBD BIOSCIENCE555394
Anti-human CD19 PerCPBD BIOSCIENCE340421
Anti-human CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE557749
Anti-human CD90 APCBD BIOSCIENCE561971
Anti-human CD133/1 Miltenyibiotec130-113-673
Anti-human CD34 PEBD BIOSCIENCE348057
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Blood Irradator-2000 BRIT (Department of Biotechnology, India)BI 2000 
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates)NUNC (THERMO SCIENTIFIC)140675
CrysoStor CS10BioLife solutions#07952
BusulfanCELON LABS (60mg/10mL)- 
Guide-it Recombinant Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
 Centrifuge tube-15mlCORNING430790
 Centrifuge tube-50mlNUNC (THERMO SCIENTIFIC)339652
DMSOMPBIO219605590
DNAaseSTEMCELL TECHNOLOGIES6469
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
EasySep magnetSTEMCELL TECHNOLOGIES18000
Electrophoresis unitORANGE INDIAHDS0036
FBSTHERMO SCIENTIFIC10270106
Flow cytometer – ARIA IIIBD BIOSCIENCE- 
FlowJo BD BIOSCIENCE -
Flt3-LPEPROTECH300-19-1000
Gel imaging systemCELL BIOSCIENCES11630453
HighPrep DTR reagentMAGBIOGENOMICSDT-70005
Human BD Fc BlockBD BIOSCIENCE553141
IL6PEPROTECH200-06-50
IMDM mediaTHERMO SCIENTIFIC12440053
Infrared lampMURPHY-
Insulin syringe 6mm 31GBD BIOSCIENCE324903
KetamineKETMIN 50-
Loading dye 6XTAKARA BIO9156
LymphoprepSTEMCELL TECHNOLOGIES7851
Mice RestrainerAVANTORTV-150
Nano drop spectrophotometerTHERMO SCIENTIFICND-2000C
Neubauer cell counting chamberROHEM INSTRUMENTSCC-3073
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:026622
Nunc delta 6-well plateTHERMO SCIENTIFIC140675
Polystyrene round-bottom tubeBD352008
P3 primary cell Nucleofection solutionLONZA BIOSCIENCEPBP3-02250
Pasteur pipetteFISHER SCIENTIFIC13-678-20A
PCR clean-up kitTAKARA BIO740609.25
Mouse Pie CageFISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm)STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3Whitehead Institute for Biomedical Researchhttps://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA Extraction SolutionLucigenQE09050
ReserveratrolSTEMCELL TECHNOLOGIES72862
SCFPEPROTECH300-07-1000
SFEM-IISTEMCELL TECHNOLOGIES9655
sgRNASYNTHEGO- 
SPINWINTARSON1020
StemReginin 1STEMCELL TECHNOLOGIES72342
ICE analysis toolSYNTHEGOhttps://ice.synthego.com/
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1XSYNTHEGOSupplied with gRNA 
ThermocyclerAPPLIED BIOSYSTEMS4375305
TPOPEPROTECH300-18-1000
Trypan blueHIMEDIA LABSTCL046
UM171STEMCELL TECHNOLOGIES72914
UM729STEMCELL TECHNOLOGIES72332
XylazineXYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED-

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